一种产莫纳可林j的曲霉菌及其构建方法与应用
阅读说明：本技术 一种产莫纳可林j的曲霉菌及其构建方法与应用 (Monascus for producing monacolin J and construction method and application thereof ) 是由 吕雪峰 黄雪年 杨勇 郑玲辉 滕云 于 2018-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种产莫纳可林J的曲霉菌及其构建方法与应用。本发明公开的一种产莫纳可林J的曲霉菌的构建方法,包括在曲霉菌中完全阻断聚酮合酶LovF表达的步骤。本发明通过完全敲除lovF基因阻断洛伐他汀合成而实现莫纳可林J的积累,再在此基础上用组成型启动子过表达转录调控因子lovE,使得构建得到的菌株的莫纳可林J产量进一步显著提高,并增强了该菌株的发酵稳定性。可以利用本发明的菌株直接发酵生产莫纳可林J,从而简化辛伐他汀的生产工艺,降低成本,提高生产效率,减少环境污染。(The invention discloses an aspergillus for producing monacolin J and a construction method and application thereof. The invention discloses a construction method of Monacolin J-producing aspergillus, which comprises the step of completely blocking polyketide synthase LovF expression in the aspergillus. According to the invention, the accumulation of the monacolin J is realized by completely knocking out the lovF gene to block the synthesis of lovastatin, and then the constitutive promoter is used for over-expressing the transcription regulation factor lovE on the basis, so that the yield of the monacolin J of the constructed strain is further obviously improved, and the fermentation stability of the strain is enhanced. The strain can be used for directly fermenting and producing monacolin J, so that the production process of simvastatin is simplified, the cost is reduced, the production efficiency is improved, and the environmental pollution is reduced.)
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种产莫纳可林J的曲霉菌及其构建方法与应用；更进一步地，本发明涉及莫纳可林J的生产。
背景技术
心脑血管疾病严重威胁人类健康，其发病率和死亡率在许多国家和地区排名第一。高脂血症(高胆固醇血症)是心脑血管疾病的一个重要诱因，因此预防高脂血症、调节血脂和降低血脂成为防治心脑血管疾病的关键。基于上述原因，降胆固醇药物具有很大的市场前景，多年来一直位于全球畅销药物的前列。
辛伐他汀(Simvastatin)即舒降之(Zocor)，是Merck公司研发的一种重要的降血脂药物，能有效地抑制胆固醇的体内合成，是治疗高脂血症的首选药物之一。随着2006年专利到期，辛伐他汀的市场竞争日益激烈，其工艺技术研究和生产成本成为产品竞争的重要因素。辛伐他汀并非天然化合物，而是以土曲霉的发酵产物洛伐他汀(lovastatin)为原料通过化学合成的。辛伐他汀和洛伐他汀的区别仅在于侧链多一个甲基，辛伐他汀为2,2-二甲基丁酸侧链，洛伐他汀为2-甲基丁酸侧链。在辛伐他汀的合成过程中，需要先去除洛伐他汀 C8位的2-甲基丁酸侧链，获得莫纳可林J(Monacolin J)，然后再通过后续工艺将2,2-二甲基丁酸侧链添加到莫纳可林J的C8位上，从而获得辛伐他汀。由此可见，莫纳可林J是辛伐他汀合成的重要前体物。目前，辛伐他汀的合成路线中，采用化学方法水解洛伐他汀制备莫纳可林J，整个制备过程中会使用到大量的酸、碱，以及二氯甲烷、甲苯和***等有机试剂，工艺复杂、耗时长、收率低、污染压力大。
洛伐他汀的生物合成过程中有两个聚酮合酶(PKS)参与，第一个聚酮合酶LovB在其他修饰酶的辅助下合成中间体莫纳可林J，2-甲基丁酸侧链由另外一个聚酮合酶LovF负责合成并在酰基转移酶LovD的作用下转移到莫纳可林J的C8位羟基上，形成终产物洛伐他汀。由此可见LovF和LovD是莫纳可林J合成洛伐他汀的两个关键酶。因此，理论上敲除 lovD和lovF能够阻断莫纳可林J合成洛伐他汀，从而积累莫纳可林J。基因工程改造是一种有效的遗传育种技术。如果能够通过基因工程改造方法对产洛伐他汀土曲霉进行遗传改造，使之能够直接发酵生产莫纳可林J，那么就可以简化辛伐他汀的合成工艺，降低生产成本，同时还可以减少环境污染，从而提高产品的市场竞争力。但是，次级代谢产物的合成调控机制非常复杂，阻断合成途径有可能会对整个合成途径造成显著影响，在终产物消失的同时其他上游中间产物也不能够有效积累。而且，有的中间产物不稳定，容易降解，或者中间产物的下游去路不是唯一的，可能是多个合成途径的中间产物，因此敲除某个下游基因并不一定能实现中间产物的积累。
次级代谢产物合成通常受环境因素的干扰比较明显，一些未知的环境因素小差异可能会对次级代谢产物的合成产生较大影响。洛伐他汀是一种聚酮类次级代谢产物，在工业生产过程中批次间的洛伐他汀产量差异较大，不仅增加了生产的过程控制难度还影响了生产效率。lovE是位于土曲霉洛伐他汀合成基因簇内的一个转录调控因子基因，其能够特异性调控洛伐他汀合成基因簇的转录水平，从而控制洛伐他汀的合成。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足之处，提供一种能够直接发酵生产莫纳可林J的曲霉菌及其构建方法与应用。
为解决以上技术问题，本发明提供一种产莫纳可林J的曲霉菌的构建方法，包括在曲霉菌中完全阻断聚酮合酶LovF表达的步骤。
上述方法中，所述完全阻断聚酮合酶LovF表达的方法是将所述曲霉菌的所有lovF基因拷贝敲除；
所述曲霉菌为曲霉菌HZ01(Aspergillus sp.HZ01)，其于2016年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.12970，分类命名为曲霉菌Aspergillus sp.，该菌是一株土曲霉(Aspergillus terreus)。
上述方法中，所述lovF基因拷贝敲除的方法为lovF基因同源重组双交换法。
上述任一所述的方法中，所述lovF基因同源重组双交换法包括如下步骤：
(1)在所述曲霉菌HZ01中敲除ku80基因，构建了基因打靶高效的曲霉菌HZ02(HZ01, Δku80::ptrA)，进一步敲除所述曲霉菌HZ02的pyrG基因，构建了可基于尿嘧啶营养缺陷型进行遗传转化筛选的底盘细胞菌株曲霉菌HZ03(HZ01,Δku80::ptrA,ΔpyrG)；
优选地，所述曲霉菌HZ03的构建包括如下步骤：参照公开号CN104894165A、发明名称为“一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用”的发明专利申请的实施例 2对曲霉菌HZ01的原生质体悬液进行处理，敲除HZ01的ku80，构建了基因打靶高效的曲霉菌HZ02(HZ01,Δku80::ptrA)，进一步参照该专利申请的实施例5敲除pyrG基因构建了可基于尿嘧啶营养缺陷型进行遗传转化筛选的底盘细胞菌株曲霉菌HZ03(HZ01, Δku80::ptrA,ΔpyrG)，除了将宿主菌从土曲霉CICC40205替换为HZ01外，上述操作与专利申请CN104894165A的实施例中的步骤完全一致；
(2)在所述曲霉菌HZ03的原生质体悬液中加入lovF基因打靶元件lovF-KO1敲除第一个lovF基因拷贝，得到工程菌株HZ-ΔlovF1；
优选地，所述lovF-KO1从5’到3’依次含有lovF基因的上游同源臂、pyrGAn筛选标记、 lovF基因的下游同源臂；进一步优选地，所述lovF-KO1的序列如SEQ ID No.10所示；
进一步地，在该步骤中将所述工程菌株HZ-ΔlovF1的pyrGAn筛选标记切除，得到工程菌株HZ-ΔlovF1-ΔpyrGAn；
优选地，所述pyrGAn筛选标记切除是在所述工程菌株HZ-ΔlovF1的原生质体悬液中加入筛选标记切除元件pyrGAn-KO1.5得到；进一步优选地，所述pyrGAn-KO1.5的序列如SEQ ID No.12所示；
(3)在所述工程菌株HZ-ΔlovF1-ΔpyrGAn的原生质体悬液中加入lovF基因打靶元件lovF-KO2敲除第二个lovF基因拷贝，得到工程菌株HZ-ΔlovF2；
优选地，所述lovF-KO2从5’到3’依次含有lovF基因的上游同源臂、pyrGAn筛选标记、 lovF基因的下游同源臂；进一步优选地，所述lovF-KO2序列如SEQ ID No.19所示；
进一步地，在该步骤中将所述工程菌株HZ-ΔlovF2的pyrGAn筛选标记切除，得到工程菌株HZ-ΔlovF2-ΔpyrGAn；
优选地，所述pyrGAn筛选标记切除是在所述工程菌株HZ-ΔlovF2的原生质体悬液中加入筛选标记切除元件pyrGAn-KO2.5得到；进一步优选地，所述pyrGAn-KO2.5的序列如SEQ ID No.21所示；
(4)在所述工程菌株HZ-ΔlovF2-ΔpyrGAn的原生质体悬液中加入lovF基因打靶元件 lovF-KO3敲除第三个lovF基因拷贝，得到工程菌株HZ-ΔlovF3；
优选地，所述lovF-KO3从5’到3’依次含有lovF基因的上游同源臂、pyrGAn筛选标记、lovF基因的下游同源臂；进一步优选地，所述lovF-KO3的序列如SEQ ID No.28所示。
上述任一所述的方法中，所述方法还包括过表达转录调控因子lovE的步骤。
上述方法中，所述过表达转录调控因子lovE的方法为同源重组双交换法以定点过表达 lovE。
上述方法中，所述定点过表达lovE是用组成型启动子PgpdAt定点过表达转录调控因子lovE；
优选地，所述定点过表达lovE为在工程菌株HZ-ΔlovF3-ΔpyrGAn的ku80位点上定点整合以组成型启动子PgpdAt为启动子的lovE表达元件，最终得到工程菌株 HZ-ΔlovF3-lovE；
所述工程菌株HZ-ΔlovF3-ΔpyrGAn是工程菌株HZ-ΔlovF3切除pyrGAn筛选标记得到；优选地，所述pyrGAn筛选标记切除是在所述工程菌株HZ-ΔlovF3的原生质体悬液中加入筛选标记切除元件pyrGAn-KO3.5得到；进一步优选地，所述pyrGAn-KO3.5的序列如SEQID No.30所示。
上述方法中，所述在ku80位点上定点整合以组成型启动子PgpdAt为启动子的lovE表达元件包括如下步骤：在所述工程菌株HZ-ΔlovF3-ΔpyrGAn的原生质体悬液中加入过表达 lovE的打靶元件Uku80-pyrGAn-PgpdAt-lovE-TtrpC-Dku80，所述 Uku80-pyrGAn-PgpdAt-lovE-TtrpC-Dku80的序列如SEQ ID No.42所示。
为解决以上技术问题，本发明还提供由上述任一项所述的方法构建得到的曲霉菌，优选地，所述曲霉菌为所述HZ-ΔlovF3或HZ-ΔlovF3-lovE或HZ-ΔlovF3-ΔpyrGAn；
所述HZ-ΔlovF3是按照上述方法将lovF基因完全敲除构建得到的；
所述HZ-ΔlovF3-lovE是按照上述方法将lovF基因完全敲除后，进一步按照上述方法过表达转录调控因子lovE构建得到的；
所述HZ-ΔlovF3-ΔpyrGAn是按照上述方法将所述工程菌株HZ-ΔlovF3切除pyrGAn筛选标记得到的。
为解决以上技术问题，本发明还提供一种制备莫纳可林J的方法，包括发酵上述曲霉菌。
为解决以上技术问题，本发明还提供上述曲霉菌和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在制备莫纳可林J中的应用。
本发明通过完全敲除曲霉菌的lovF基因阻断洛伐他汀合成而实现莫纳可林J的积累，再在此基础上用组成型启动子过表达转录调控因子lovE，使得构建得到的菌株的莫纳可林 J产量进一步显著提高，并增强了该菌株的发酵稳定性。可以利用本发明的菌株直接发酵生产莫纳可林J，从而简化辛伐他汀的生产工艺，降低成本，提高生产效率，减少环境污染。
附图说明
图1为完全敲除lovF基因策略示意图。
图2为质粒pXH2-1(A)和pXH-106(B)图谱。
图3为敲除第一个lovF基因拷贝菌株的基因组PCR验证结果；
其中，A为敲除第一个lovF基因拷贝获得的工程菌株HZ-ΔlovF1的基因组PCR验证结果；B为切除HZ-ΔlovF1中的pyrGAn筛选标记的PCR验证结果。
图4为继续敲除第二个lovF基因拷贝菌株的基因组PCR验证结果；
其中，A为继续敲除第二个lovF基因拷贝获得的工程菌株HZ-ΔlovF2的基因组PCR验证结果；B为切除HZ-ΔlovF2中的pyrGAn筛选标记的PCR验证结果。
图5为继续敲除第三个lovF基因拷贝菌株的基因组PCR验证结果；
其中，A为继续敲除第三个lovF基因拷贝获得的工程菌株HZ-ΔlovF3的基因组PCR验证结果；B为切除HZ-ΔlovF3中的pyrGAn筛选标记的PCR验证结果。
图6为过表达lovE基因工程菌株的构建示意图及基因组PCR验证结果；
其中，A为构建示意图，B为基因组PCR验证结果，lovE表达元件和pyrGAn筛选标记替换了原本位于ku80位点的ptrA筛选标记。
图7为不完全敲除lovF基因工程菌株的发酵液HPLC分析结果。
图8为曲霉菌工程菌株产他汀化合物的发酵结果；
其中，A为部分工程菌株发酵液的HPLC分析结果；B为各菌株发酵结果的统计图，其中，HZ-ΔlovF3-1和HZ-ΔlovF3-2为两株HZ-ΔlovF3工程菌株，HZ-ΔlovF3-lovE-1和HZ-ΔlovF3-lovE-2为两株HZ-ΔlovF3-lovE工程菌株。
图9为土曲霉的洛伐他汀生物合成途径示意图；
其中，聚酮合酶LovF负责合成洛伐他汀的2-甲基丁酸侧链，酰基转移酶LovD则负责将2-甲基丁酸侧链转移到莫纳可林J上生成洛伐他汀。
图10为曲霉工程菌株在两种培养基中产莫纳可林J的发酵结果；
其中，培养基A是洛伐他汀发酵培养基A，培养基B是洛伐他汀发酵培养基B， HZ-ΔlovF3-1和HZ-ΔlovF3-2是两株HZ-ΔlovF3工程菌株，HZ-ΔlovF3-lovE-1和 HZ-ΔlovF3-lovE-2是两株HZ-ΔlovF3-lovE工程菌株，HZ-PcEST-58是有洛伐他汀残留的产莫纳可林J土曲霉菌株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
曲霉菌HZ01(Aspergillus sp.HZ01)于2016年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.12970，分类命名为曲霉菌Aspergillus sp.。该菌是一株土曲霉。
IPM液体培养基：60g/L葡萄糖，2g/L NH4NO3，20mg/L(NH4)2HPO4，20mg/L FeSO4，0.4g/L MgSO4，4.4mg/L ZnSO4，0.5g/L玉米浆，余量为去离子水，pH 3.5，121℃高压灭菌20分钟。
酶解液：称取0.4g纤维素酶(Sigma产品，产品目录号：C1184)、0.4g裂解酶(Sigma产品，产品目录号：L1412)、0.2g蜗牛酶(生工生物工程(上海)股份有限公司产品，产品目录号：SB0870)溶解于50mL的0.6M MgSO4水溶液中，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。
本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6942-01)，DNA片段回收是采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒(D6492-01)，凝胶回收是采用OMEGA 公司Gel Extraction Kit试剂盒(D2500-01)。
pXH-106质粒序列如SEQ ID No.5所示。
pXH2-1质粒序列如SEQ ID No.37所示。
PDB顶层琼脂：24g/L马铃薯土豆培养基PDB干粉(BD公司产品，产品目录号：7114771)，1.2M山梨醇，4g/L琼脂糖，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟后48℃保温。
PDA平板：39g/L马铃薯土豆培养基PDA干粉(BD公司产品，产品目录号：633840)，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟，待冷却至约60℃制备平板。
PDAS平板：39g/L马铃薯土豆培养基PDA干粉(BD公司产品，产品目录号：633840)，1.2M山梨醇，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟，待冷却至约60℃制备平板。
CD平板：3g/L NaNO3，2g/L KCl，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.02g/LFeSO4·7H2O，10g/L葡萄糖，20g/L琼脂，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟，待冷却至约60℃制备平板。
CD上层琼脂：3g/L NaNO3，2g/L KCl，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.02g/LFeSO4·7H2O，10g/L葡萄糖，1.2M山梨醇，4g/L琼脂糖，121℃高压灭菌20分钟后48℃保温。
CD-SFU：CD平板+1.2M山梨醇+1g/L 5-氟乳清酸+10mM尿苷。
CD-FU：CD平板+1g/L 5-氟乳清酸+10mM尿苷。
洛伐他汀发酵种子培养基：9g/L葡萄糖，10g/L蔗糖，1g/L酵母抽提物，1g/L蛋白胨，1g/L乙酸钠，0.04g/L KH2PO4，0.1g/L MgSO4，5g/L豆粕，1.5g/L碳酸钙，pH6.8，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟。
洛伐他汀发酵培养基A：70g/L葡萄糖，20g/L蔗糖，1.5g/L酵母抽提物(安琪酵母股份有限公司产品，产品目录号：FM888)，20g/L蛋白胨，7g/L乙酸钠，0.5g/L KH2PO4， 0.5g/LMgSO4，5g/L豆粕，5g/L碳酸钙，0.1mL/L泡敌(烟台恒鑫化工科技有限公司产品，产品目录号：THIX-298)，pH6.2，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟。
洛伐他汀发酵培养基B：70g/L葡萄糖，20g/L蔗糖，1.5g/L酵母抽提物(OXOID，产品目录号：LP0021)，5g/L蛋白胨，7g/L乙酸钠，0.5g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4，20g/L 豆粕，5g/L碳酸钙，0.1mL/L泡敌(烟台恒鑫化工科技有限公司，产品目录号：THIX-298)， pH7.2，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟。
HZ-PcEST-58为公开号CN108118042A、发明名称为“2-甲基丁酸侧链水解酶和产莫纳可林J的曲霉菌株及其构建方法与应用”的发明专利申请的58#工程菌株，公众可从浙江海正药业股份有限公司获得。
实施例1、曲霉菌遗传转化
一、原生质体制备
将曲霉菌HZ01的孢子接种至50mL IPM液体培养基中，使孢子浓度约为107个/mL，在200rmp、32℃培养12-18h。用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6M MgSO4溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50ml三角瓶中，根据菌丝重量加入适量酶解液(每1g菌丝加入10ml酶解液)，在30℃、60rpm处理1-3h。将上述酶解后的混合液先用8层擦镜纸过滤，收集滤液。在4℃、4000rpm离心收集原生质体，用预冷1.0M 山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC(STC组成：1.0M山梨醇，50mM Tris-HCl(pH 8.0)， 50mM CaCl2)洗涤一次，最后把原生质体重悬于预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为5×107个/mL，得到原生质体悬液。
二、高效基因打靶平台的构建
参照公开号CN104894165A、发明名称为“一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用”的发明专利申请的实施例2对步骤一制备的曲霉菌HZ01的原生质体悬液进行处理，敲除曲霉菌HZ01的ku80，构建了基因打靶高效的曲霉菌HZ02(HZ01, Δku80::ptrA)，进一步参照该专利申请的实施例5敲除pyrG基因构建了可基于尿嘧啶营养缺陷型进行遗传转化筛选的底盘细胞菌株曲霉菌HZ03(HZ01,Δku80::ptrA,ΔpyrG)，除了将宿主菌从土曲霉CICC40205替换为曲霉菌HZ01外，上述操作与专利申请CN104894165A 的实施例中的步骤完全一致。
实施例2、完全敲除lovF基因
敲除lovF基因至完成所有拷贝的敲除，所有引物位置及基因敲除策略流程如图1所示。
一、敲除第一个lovF拷贝
(一)lovF基因打靶元件lovF-KO1的构建
根据土曲霉NIH2624基因组信息(GenBank:AAJN00000000.1)和曲霉菌HZ01洛伐他汀合成基因簇信息，设计并合成如下引物：
U1-lovF-F:5’-gctcccatagctatggttggc-3’(SEQ ID No.1)；
U1-lovF-R:5’-GTTCAATCACCATCTCCCTTAgagtcttcaagacgatcgcagc-3’(SEQ IDNo.2)；
D1-lovF-F:5’-CGTATTTCTCCGCCTGTGTGatctgcgagtggctggtcgatc-3’(SEQ IDNo.3)；
D1-lovF-R:5’-gcatctcagaacgggatgctg-3’(SEQ ID No.4)。
以曲霉菌HZ01基因组DNA为模板，采用pfu DNA聚合酶(Fermentas,产品目录号:EP0501)进行PCR扩增，用引物对U1-lovF-F/U1-lovF-R可以扩增获得大小约为1.2kb的lovF基因的上游同源臂U1-lovF，用引物对D1-lovF-F/D1-lovF-R可以扩增获得大小为1.2kb 的lovF基因下游同源臂D1-lovF。
以质粒pXH-106(图谱如图2B所示，序列如SEQ ID No.5所示)为模板，用引物对pyrGAn-F(5’-taagggagatggtgattgaactag-3’(SEQ ID No.6))和pyrGAn-R(5’-cacacaggcggagaaatacgaagc-3’(SEQ ID No.7))进行PCR扩增，获得大小约为2.2kb的黑曲霉 pyrGAn基因表达元件作为筛选标记，即pyrGAn片段。
将所有PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U1-lovF片段、D1-lovF片段和pyrGAn片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以C1-lovF-F(5’-tcccatagctatggttggcatg-3’(SEQ ID No.8))和C1-lovF-R (5’-tccgcgactttggcgatcgttc-3’(SEQ ID No.9))作为引物对扩增获得大小约为3.5kb的lovF基因打靶元件lovF-KO1片段(序列如SEQ ID No.10所示)，可用于lovF的第一次敲除工作。
(二)原生质体转化及筛选验证
参照实施例1的步骤一制备曲霉菌HZ03的原生质体悬液，向150μl该原生质体悬液中加入10μl的DNA片段lovF-KO1(约2μg)。再加入50μl冰浴的PSTC(PSTC组成： 40％PEG4000，1.2M山梨醇，50mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM CaCl2)，轻轻混匀，冰浴 30min。加入1mL常温的PSTC，混匀后室温放置20min。然后与30mL的PDB顶层琼脂混合后倾注于10块PDAS平板上进行再生筛选培养，在30℃、黑暗条件下培养5-7天。
从转化筛选平板上挑取生长状况良好的转化子转接至PDA平板上，在30℃培养5天进行传代纯化，连续传代2次。选取稳定传代的3个候选转化子进行单孢分离纯化，选择得到的单菌落孢子接种于IPM液体培养基中，30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组DNA。分别以这3个候选转化子的基因组DNA为模板，用引物对U1-lovF-F/D1-lovF-R进行PCR验证，同时用HZ02作为对照。理论上，以HZ02的基因组 DNA为模板(其未敲除lovF基因)能扩增出大小约8.1kb条带，以3个候选转化子的基因组DNA为模板(敲除lovF基因后)应该能扩增出大小约为3.7kb的条带。
结果如图3A所示。图3A中，M为DNA Marker，1-3泳道分别为3个候选转化子，4 泳道为对照菌株HZ02，条带a为未敲除的野生型lovF条带，条带b为敲除lovF后的目的条带(其中具有pyrGAn筛选标记)。
由图3A可知，1-3泳道的候选转化子均为敲除了lovF基因的阳性转化子，但是又都像 HZ02一样有一条约8kb条带，这说明lovF基因存在多个拷贝，仍然有完整的lovF基因未被敲除。将该步骤得到的敲除第一个lovF基因拷贝的工程菌株记为HZ-ΔlovF1。
(三)工程菌株HZ-ΔlovF1的pyrGAn筛选标记切除
以曲霉菌HZ01的基因组DNA为模板，用引物对U1-lovF-F/U1-lovF-R和D1.5-lovF-F (5’-taagggagatggtgattgaacatctgcgagtggctggtcgatc-3’(SEQ ID No.11))/D1-lovF-R分别进行 PCR扩增，获得上游同源臂片段U1-lovF和下游同源臂片段D1.5-lovF并进行回收纯化。用融合PCR的方法将U1-lovF片段、D1.5-lovF片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以C1-lovF-F和C1-lovF-R作为引物对扩增用于切除pyrGAn筛选标记的切除元件pyrGAn-KO1.5片段(序列如SEQ ID No.12所示)。
制备工程菌株HZ-ΔlovF1的原生质体悬液，向150μl该原生质体悬液中加入10μl的 DNA片段pyrGAn-KO1.5(约2μg)。再加入50μl冰浴的PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL常温的PSTC，混匀后室温放置20min。然后与30mL CD上层琼脂混合后倾注于10块CD-SFU上，在30℃静置培养5-7天。
选取转化子转接于CD-FU平板上传代纯化两次。选取稳定传代的3个候选转化子进行单孢分离纯化，选择得到的单菌落孢子接种于补充了10mM尿苷的IPM液体培养基中， 30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组DNA。分别以这3个候选转化子的基因组DNA为模板，用引物对U1-lovF-F/D1-lovF-R进行PCR验证，同时用菌株HZ-ΔlovF1、对照菌株HZ02进行该实验。理论上，以HZ02的基因组DNA为模板(其未敲除lovF基因) 应该能扩增出大小约为8.1kb的条带，以HZ-ΔlovF1的基因组DNA为模板应该能多扩增出一条敲除lovF后的3.7kb条带(其中具有pyrGAn筛选标记)，该3.7kb条带在切除pyrGAn筛选标记后应该消失，取代的应该是一条约2.2kb条带。
结果如图3B所示。图3B中，M为DNA Marker，1-3泳道分别为3个候选转化子，4 泳道为菌株HZ-ΔlovF1，5泳道为对照菌株HZ02，条带a为未敲除的野生型lovF条带，条带b为敲除lovF后的目的条带(其中具有pyrGAn筛选标记)，条带c为切除pyrGAn筛选标记后的目的条带。
由图3B可知，1-3泳道的候选转化子均扩增出一条约2.2kb和一条约8.1kb的条带，而未扩增到大小为3.7kb条带，这说明这三个候选转化子都是成功切除了pyrGAn筛选标记之后的尿嘧啶营养缺陷型菌株，将该步骤获得的敲除第一个lovF拷贝并且切除了其中的pyrGAn筛选标记的工程菌株记为HZ-ΔlovF1-ΔpyrGAn。
二、敲除第二个lovF拷贝
(一)lovF基因打靶元件lovF-KO2的构建
根据土曲霉NIH2624基因组信息和曲霉菌HZ01洛伐他汀合成基因簇信息，设计并合成如下引物：
U2-lovF-F:5’-gtgcgagacggagacccgatc-3’(SEQ ID No.13)；
U2-lovF-R:5’-GTTCAATCACCATCTCCCTTAcatttccttgatatatccatc-3’(SEQ IDNo.14)；
D2-lovF-F:5’-CGTATTTCTCCGCCTGTGTG ttcacaaagcgcaatgtggac-3’(SEQ IDNo.15)；
D2-lovF-R:5’-aacaagatacgacacgttagg-3’(SEQ ID No.16)。
以曲霉菌HZ01基因组DNA为模板，采用pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，用引物对 U2-lovF-F/U2-lovF-R可以扩增获得大小约为1.0kb的拟敲除片段的上游同源臂U2-lovF，用引物对D2-lovF-F/D2-lovF-R可以扩增获得大小约为1.0kb的拟敲除片段的下游同源臂 D2-lovF。
按照步骤一的方法获得pyrGAn片段。
将所有PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U2-lovF片段、D2-lovF片段和pyrGAn片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以C2-lovF-F(5’-gaaacggcaatcaaccaagac-3’(SEQ ID No.17))和C2-lovF-R (5’-aaatagtggcattcgttcctg-3’(SEQ ID No.18))作为引物扩增获得大小约为3.5kb的lovF基因打靶元件lovF-KO2片段(序列如SEQ ID No.19所示)，可用于lovF的第二次敲除工作。
(二)原生质体转化及筛选验证
参照实施例1的步骤一制备工程菌株HZ-ΔlovF1-ΔpyrGAn的原生质体悬液，向150μl 该原生质体悬液中加入10μl的DNA片段lovF-KO2(约2μg)。再加入50μl冰浴的PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL常温的PSTC，混匀后室温放置20min。然后与30mL 的PDB顶层琼脂混合后倾注于10块PDAS平板上，在30℃静置培养5-7天。
选取转化子转接于PDA平板上传代纯化两次，选取稳定传代的3个候选转化子进行单孢分离纯化，选择得到的单菌落孢子接种于5mL IPM液体培养基中，30℃、200rpm培养 48小时，收集菌丝提取基因组DNA。用引物U2-lovF-F/D2-lovF-R进行PCR验证，同时用 HZ02作为对照。理论上，以HZ02的基因组DNA为模板(其未敲除lovF基因)能扩增出大小约5.8kb条带，而以3个候选转化子的基因组DNA为模板(敲除lovF基因后)应该能扩增出大小约为3.7kb的条带。
结果如图4A所示。图4A中，M为DNA Marker，1-3泳道分别为3个候选转化子，4 泳道为对照菌株HZ02，条带a为未敲除的野生型lovF条带，条带b为敲除lovF后的目的条带(其中具有pyrGAn筛选标记)。
由图4A可知，1-3泳道的候选转化子均为敲除了第二个lovF基因拷贝的阳性转化子，但是又都像对照菌株HZ02一样有一条5.8kb条带，这说明基因组仍然有其他lovF基因拷贝存在，仍然有完整的lovF基因未被敲除。将该步骤得到的敲除两个lovF基因拷贝的工程菌株记为HZ-ΔlovF2。
(三)工程菌株HZ-ΔlovF2的pyrGAn筛选标记切除
以曲霉菌HZ01基因组DNA为模板，分别用引物对U2-lovF-F/U2-lovF-R和 D2.5-lovF-F(5’-taagggagatggtgattgaac ttcacaaagcgcaatgtggac-3’(SEQ ID No.20))/D2-lovF-R 进行PCR扩增，获得上游同源臂片段U2-lovF和下游同源臂片段D2.5-lovF并进行回收纯化。用融合PCR的方法将U2-lovF片段、D2.5-lovF片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以C2-lovF-F和C2-lovF-R作为引物对扩增用于切除pyrGAn筛选标记的切除元件pyrGAn-KO2.5片段(序列如SEQ ID No.21所示)。
制备工程菌株HZ-ΔlovF2的原生质体悬液，向150μl该原生质体悬液中加入10μl的 DNA片段pyrGAn-KO2.5(约2μg)。再加入50μl冰浴的PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL常温的PSTC，混匀后室温放置20min。然后与30mL CD上层琼脂混合后倾注于10块CD-SFU上，在30℃静置培养5-7天。
选取转化子转接于CD-FU平板上传代纯化两次。选取稳定传代的3个候选转化子进行单孢分离纯化，选择得到的单菌落孢子接种于补充了10mM尿苷的IPM液体培养基中， 30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组DNA。分别以这3个候选转化子的基因组DNA为模板，用引物对U2-lovF-F/D2-lovF-R进行PCR验证，同时用菌株HZ-ΔlovF2、对照菌株HZ02进行该实验。理论上，以HZ02的基因组DNA为模板(其未敲除lovF基因) 应该能扩增出大小约为5.8kb的条带，以HZ-ΔlovF2的基因组DNA为模板应该能多扩增出一条敲除lovF后的3.7kb条带(其中具有pyrGAn筛选标记)，该3.7kb条带在切除pyrGAn筛选标记后应该消失，取代的应该是一条约2.2kb条带。
结果如图4B所示。图4B中，M为DNA Marker，1-3泳道分别为3个候选转化子，4 泳道为菌株HZ-ΔlovF2，5泳道为对照菌株HZ02，条带a为未敲除的野生型lovF条带，条带b为敲除lovF后的目的条带(其中具有pyrGAn筛选标记)，条带c为切除pyrGAn筛选标记后的目的条带。
由图4B可知，1-3泳道的候选转化子均扩增出一条约2.2kb和一条约5.8kb的条带，而未扩增到大小为3.7kb条带，这说明这三个候选转化子都是成功切除了pyrGAn筛选标记之后的尿嘧啶营养缺陷型菌株，将该步骤获得的敲除两个lovF基因拷贝并且切除了其中的pyrGAn筛选标记的工程菌株记为HZ-ΔlovF2-ΔpyrGAn。
三、敲除第三个lovF拷贝
(一)lovF基因打靶元件lovF-KO3的构建
设计并合成如下引物：
U3-lovF-F:5’-cacgatctgatcggattgcag-3’(SEQ ID No.22)；
U3-lovF-R:5’-GTTCAATCACCATCTCCCTTActttccatggcctcttgaatg-3’(SEQ IDNo.23)；
D3-lovF-F:5’-CGTATTTCTCCGCCTGTGTGtggacatcgaggacgatccag-3’(SEQ IDNo.24)；
D3-lovF-R:5’-gaatcgaggagcccaggagtc-3’(SEQ ID No.25)。
以曲霉菌HZ01基因组DNA为模板，用引物对U3-lovF-F/U3-lovF-R进行PCR扩增获得大小约为1.0kb的拟敲除片段的上游同源臂U3-lovF，用引物对D3-lovF-F/D3-lovF-R进行PCR扩增获得大小约为1.0kb的拟敲除片段的下游同源臂D3-lovF。
按照步骤一的方法获得pyrGAn片段。
将所有PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U3-lovF片段、D3-lovF片段和pyrGAn片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以C3-lovF-F(5’-catggcacaatgtgcttcgtg-3’(SEQ ID No.26))和C3-lovF-R (5’-caggagatgctggctgtcctg-3’(SEQ ID No.27))作为引物扩增获得大小约为3.5kb的lovF基因打靶元件lovF-KO3片段(序列如SEQ ID No.28所示)，可用于lovF的第三次敲除工作。
(二)原生质体转化及筛选验证
参照实施例1的步骤一制备工程菌株HZ-ΔlovF2-ΔpyrGAn的原生质体悬液，向150μl 该原生质体悬液中加入10μl的DNA片段lovF-KO3(约2μg)。再加入50μl冰浴的PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL常温的PSTC，混匀后室温放置20min。然后与30mL 的PDB顶层琼脂混合后倾注于10块PDAS上，在30℃静置培养5-7天。
选取转化子转接于PDA平板上传代纯化两次，选取稳定传代的3个转化子进行单孢分离纯化，选择得到的单菌落孢子接种于5mL IPM液体培养基中，30℃、200rp培养48小时，收集菌丝提取基因组DNA。分别以这3个候选转化子的基因组DNA为模板，用引物对U3-lovF-F/D3-lovF-R进行PCR验证，，同时用HZ02作为对照。理论上，以HZ02的基因组DNA为模板(其未敲除lovF基因)能扩增出大小约2.5kb条带，以3个候选转化子的基因组DNA为模板(敲除lovF基因后)应该能扩增出大小约为3.7kb的条带。
结果如图5A所示。图5A中，M为DNA Marker，1-3泳道分别为3候选转化子，4泳道为对照菌株HZ02，条带a为敲除lovF后的目的条带(其中具有pyrGAn筛选标记)，条带b为未敲除的野生型lovF条带。
由图5A可知，1-3泳道的候选转化子都只扩增到一条单一的3.7kb条带，这说明这三个候选转化子都是敲除了第三个lovF基因拷贝的阳性转化子，而且这三个转化子都没有像对照菌株HZ02一样扩增到约2.5kb的条带，这说明lovF基因被完全敲除了。将该步骤得到的lovF基因完全敲除的工程菌株记为HZ-ΔlovF3。
(三)工程菌株HZ-ΔlovF3的pyrGAn筛选标记切除
以曲霉菌HZ01基因组DNA为模板，用引物对U3-lovF-F/U3-lovF-R和D3.5-lovF-F(5’-taagggagatggtgattgaac tggacatcgaggacgatccag-3’(SEQ ID No.29))/D3-lovF-R分别进行 PCR扩增，获得上游同源臂片段U3-lovF和下游同源臂片段D3.5-lovF并进行回收纯化。用融合PCR的方法将U3-lovF片段和D3.5-lovF片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以C3-lovF-F和C3-lovF-R作为引物扩增用于切除pyrGAn筛选标记的切除元件pyrGAn-KO3.5片段(序列如SEQ ID No.30所示)。
制备工程菌株HZ-ΔlovF3的原生质体悬液，向150μl该原生质体悬液中加入10μl的 DNA片段pyrGAn-KO3.5(约2μg)。再加入50μl冰浴的PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL常温的PSTC，混匀后室温放置20min。然后与30mL CD上层琼脂混合后倾注于10块CD-SFU上，在30℃静置培养5-7天。
选取转化子转接于CD-FU平板上传代纯化两次。选取稳定传代的3个候选转化子进行单孢分离纯化，选择得到的单菌落孢子接种于补充了10mM尿苷的IPM液体培养基中， 30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组DNA。分别以这3个候选转化子的基因组DNA为模板，用引物对U3-lovF-F/D3-lovF-R进行PCR验证，同时用菌株HZ-ΔlovF3、对照菌株HZ02进行该实验。理论上，以HZ02的基因组DNA为模板(其未敲除lovF基因) 应该能扩增出大小约为2.5kb的条带，以HZ-ΔlovF3的基因组DNA为模板应该能扩增出一条敲除lovF后的3.7kb条带，该3.7kb条带在切除pyrGAn筛选标记后应该消失，取代的应该是一条约2.1kb条带。
结果如图5B所示。图5B中，M为DNA Marker，1-3泳道分别为3个候选转化子，4 泳道为菌株HZ-ΔlovF3，5泳道为对照菌株HZ02，条带a为敲除lovF后的目的条带(其中具有pyrGAn筛选标记)，条带b为未敲除的野生型lovF条带，条带c为切除pyrGAn筛选标记后的目的条带。
由图5B可知，1-3泳道的候选转化子均只扩增出一条约2.1kb条带，而未扩增到大小为3.7kb条带，这说明这三个候选转化子都是成功切除了pyrGAn筛选标记之后的尿嘧啶营养缺陷型菌株，将该步骤获得的敲除三个lovF基因拷贝并且切除了其中的pyrGAn筛选标记的工程菌株记为HZ-ΔlovF3-ΔpyrGAn。
实施例3、过表达特异性转录调控因子LovE菌株的构建
一、设计并合成如下引物：
Uku80-F：5’-agcacaaacatattgatcagc-3’(SEQ ID No.31)；
pyrGAn-R:5’-GGATCCTCCCAGAGTGTAAgcatcaaatcgtcgtaccgca-3’(SEQ IDNo.32)；
TtrpC-F3:5’-aagcttgagatccacttaacgttactgaaatcatc-3’(SEQ ID No.33)；
Dku80-R:5’-gaaggcgaaaagtagtctcgtg-3’(SEQ ID No.34)。
以质粒pXH-106为模板，分别用引物对Uku80-F/pyrGAn-R和TtrpC-F3/Dku80-R进行PCR扩增得到上游同源臂Uku80-pyrGAn和下游同源臂TtrpC-Dku80。
二、设计并合成如下引物：
lovE-F:5’-ACAACTCATCAATCATCAC atggctgcagatcaaggtat-3’(SEQ ID No.35)；
lovE-R:5’-GTTAAGTGGATCTCAAGCTTcatggaggaatattgttga-3’(SEQ ID No.36)。
以曲霉菌HZ01基因组DNA为模板，用引物对lovE-F和lovE-R进行PCR扩增得到lovE基因片段。
三、以质粒pXH2-1(图谱如图2A所示，序列如SEQ ID No.37所示)为模板，用引物对PgpdAt-F743(5’-ttacactctgggaggatccaggtac-3’(SEQ ID No.38))/PgpdAt-R1 (5’-tgtgatgattgatgagttgttg-3’(SEQ ID No.39))进行PCR扩增，得到启动子PgpdAt。
四、用融合PCR方法将Uku80-pyrGAn、PgpdAt、lovE和TtrpC-Dku80进行融合，以融合产物为模板，用引物对C-ku80-F3(5’-ttccagagacgaatgactaacaag-3’(SEQ ID No.40))和C-ku80-R3(5’-gcgaaaggatcttgtgatcaatgc-3’(SEQ ID No.41))进行PCR扩增定点过表达lovE 的打靶元件Uku80-pyrGAn-PgpdAt-lovE-TtrpC-Dku80(SEQ ID No.42)。如图6A所示，该片段可利用上下游同源臂Uku80和Dku80于ku80基因位点上发生同源重组，并同时引入 lovE的表达元件，实现lovE的定点过表达。
五、制备工程菌株HZ-ΔlovF3-ΔpyrGAn的原生质体悬液，向150μl该原生质体悬液中加入10μl的DNA片段Uku80-pyrGAn-PgpdAt-lovE-TtrpC-Dku80(约2μg)。再加入50μl冰浴的PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL常温的PSTC，混匀后室温放置20min。然后与30mL的PDB顶层琼脂混合后倾注于10块PDAS上，在30℃静置培养5-7天。
选取转化子转接于PDA平板上传代纯化两次，选取稳定传代的4个转化子进行单孢分离纯化，选择得到的单菌落孢子接种于5mL IPM液体培养基中，30℃、200rpm培养48 小时，收集菌丝提取基因组DNA。用引物Uku80-F/Dku80-R进行PCR验证，同时用 HZ-ΔlovF3-ΔpyrGAn作为对照。理论上，以HZ-ΔlovF3-ΔpyrGAn的基因组DNA为模板，应该能扩增出一条约4.1kb条带，以3个候选转化子的基因组DNA(整合有lovE表达元件) 为模板，应能扩增出大小约为7.0kb的条带(Uku80-pyrGAn-PgpdAt-lovE-TtrpC-Dku80)。
结果如图6B所示。图6B中，M为DNA Marker，1-3泳道分别为3个候选转化子，4 泳道为HZ-ΔlovF3-ΔpyrGAn。
由图6B可知，1-3泳道的候选转化子均是在HZ-ΔlovF3-ΔpyrGAn菌株的ku80位点上定点整合了lovE表达元件的阳性转化子，将其记为HZ-ΔlovF3-lovE。
实施例4、曲霉菌菌株发酵产莫纳可林J的产量分析
将构建的工程菌株(实施例2制备的HZ-ΔlovF1、HZ-ΔlovF2、HZ-ΔlovF3以及实施例 3制备的HZ-ΔlovF3-lovE)和对照菌株HZ02分别接种于PDA固体平板，30℃培养7天获得孢子。将孢子分别接种于35ml洛伐他汀发酵种子培养基(250mL三角瓶)，28℃、22rpm 震荡培养48小时。
将3.5mL种子液分别接种于30mL洛伐他汀发酵培养基A(250mL三角瓶)，28℃，220rpm震荡培养8天，得到各菌株的发酵液。
发酵液样品处理：分别取0.8mL发酵液(用剪头的枪头)加入至15mL离心管中，加入8mL无水甲醇和0.8mL的0.2M NaOH溶液，置于混匀仪上翻转震荡4小时，用0.22μm 有机相滤器过滤处理样品，送HPLC分析。HPLC分析方法为：液相色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18液相色谱柱883975-902(4.6×150mm,5μm)，流动相为乙腈/0.1％H3PO4＝0.7/0.3，流速为0.5ml/min，紫外检测器(237nm)，25℃。
不完全敲除lovF基因工程菌株的发酵液HPLC分析结果如图7所示。
由图7可知，对照菌株HZ02发酵液中的产物主要为洛伐他汀，莫纳可林J很少，敲除第一个lovF基因拷贝的工程菌株HZ-ΔlovF1的洛伐他汀含量下降，但是莫纳可林J的含量并没有提高。而进一步敲除第二个lovF基因拷贝的工程菌株HZ-ΔlovF2，洛伐他汀含量进一步下降，但是莫纳可林J显著积累，这说明敲除两个lovF基因拷贝后可阻断洛伐他汀合成而显著积累莫纳可林J。
部分工程菌株产他汀化合物的发酵结果如图8所示。
由图8可知，在完全敲除lovF的工程菌株HZ-ΔlovF3的发酵液中完全检测不到洛伐他汀，而莫纳可林J则大量积累，发酵第8天浓度可高达10mM，这说明阻断莫纳可林J合成洛伐他汀这一过程可以实现莫纳可林J的积累。由土曲霉的洛伐他汀合成途径可知(图 9)，lovF在莫纳可林J生成洛伐他汀的过程中起着不可或缺的关键作用，本发明敲除lovF 能阻断洛伐他汀的合成而实现莫纳可林J的积累。
HZ-ΔlovF3-lovE工程菌株是在完全敲除lovF基因的工程菌株HZ-ΔlovF3基础上进一步过表达转录调控因子lovE的工程菌株。各菌株发酵结果的统计图如图8B所示。由图8B 可知，HZ-ΔlovF3-lovE的莫纳可林J产量显著高于HZ-ΔlovF3菌株，HZ-ΔlovF3菌株的产量约为9.5mM到10.24mM，过表达LovE之后产量提高到14.45mM到15.81mM，提高了约57％，这说明过表达转录调控因子可以进一步提高洛伐他汀合成途径的代谢通量，提高产物的产量。
实施例5、过表达LovE曲霉菌菌株的发酵稳定性分析
此外，还分析了lovF完全敲除菌株HZ-ΔlovF3和过表达lovE工程菌株HZ-ΔlovF3-lovE 在不同发酵培养基中的产莫纳可林J的能力，有洛伐他汀残留的产莫纳可林J土曲霉菌株 HZ-PcEST-58是另外一个对照菌株。将菌株的孢子分别接种于35ml洛伐他汀发酵种子培养基(250mL三角瓶)，28℃、220rpm震荡培养48小时。将各菌株的3.5mL种子液分别接种于洛伐他汀发酵培养基A和洛伐他汀发酵培养基B两种不同的发酵培养基中(250mL 三角瓶装30mL培养基)，28℃、220rpm震荡培养10天，按照实施例4中的发酵液样品处理方法和HPLC分析方法对发酵液中的莫纳可林J含量进行分析。
结果如图10所示。
由图10可知，两株HZ-ΔlovF3工程菌株(HZ-ΔlovF3-1和HZ-ΔlovF3-2)和HZ-PcEST-58 菌株在不同发酵培养基中合成莫纳可林J的含量差异较大，而过表达lovE的两株HZ-ΔlovF3-lovE工程菌株(HZ-ΔlovF3-lovE-1和HZ-ΔlovF3-lovE-2)的莫纳可林J含量显著高于HZ-ΔlovF3菌株，并且在两种培养基中的产量比较一致，在15mM至15.5mM之间。这说明过表达lovE不仅能够提高菌株的莫纳可林J产量，还能提高生产稳定性。
因为次级代谢产物合成通常受环境因素的干扰比较明显，一些未知的环境因素小差异可能会对次级代谢产物的合成产生较大影响。洛伐他汀是一种聚酮类次级代谢产物，其合成途径受特异性转录调控因子lovE的调控，因此环境因素可以通过影响lovE的转录表达来影响整个洛伐他汀合成途径，从而使得洛伐他汀合成对未知的环境变化敏感。三磷酸甘油醛脱氢酶是糖酵解途径中的一个关键酶，其编码基因是一个管家基因，转录水平高且受外界环境影响相对较小，因此使用其启动子PgpdAt来控制lovE表达可以实现lovE的稳定高水平表达，从而使得整个洛伐他汀合成途径处于稳定高效的活跃状态，从而可以提高洛伐他汀产量，并且提高合成过程抵抗环境因素的影响，最终使菌株能更高效、更稳定的生产莫纳可林J。
本发明是以洛伐他汀高产菌株曲霉菌HZ01作为原始菌株来实施的，改造前其洛伐他汀产量约为11.4mM(约5g/L)，该产量和普通产洛伐他汀菌株(如土曲霉ATCC20542等) 相比具有明显产量优势。在产莫纳可林J菌株HZ-ΔlovF3的基础上进一步过表达转录调控因子lovE，使得菌株的平均莫纳可林J产量从9.87mM提高到了15.13mM，提高了5.26mM (如图8所示)，这一增量在普通的菌株中是很难实现的。因为，相较于普通低产菌株，对高产菌株进行改造并取得显著效果的难度更大，在低产菌株中有效的改造策略在高产菌株中未必可行。在低产菌株进行遗传改造取得的显著效果对于高产菌株而言则未必显著，未必具有实际应用价值，例如对洛伐他汀初始产量为100μM的菌株进行遗传改造，使得产量提高1倍也只是增加了100μM，最终产量也只有200μM，而这100μM的改造增量对于初始产量为10mM的菌株而言仅有1％，即便在高产菌株中实现了这100μM增量效果，也并不具有显著应用价值。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，在不脱离本发明精神和范围内，本领域技术人员都可以在此基础上做出各种改动与变型，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
浙江海正药业股份有限公司
<120> 一种产莫纳可林J的曲霉菌及其构建方法与应用
<130> DP1F181168ZX
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctcccatag ctatggttgg c 21
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttcaatcac catctccctt agagtcttca agacgatcgc agc 43
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtatttctc cgcctgtgtg atctgcgagt ggctggtcga tc 42
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcatctcaga acgggatgct g 21
<210> 5
<211> 8979
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatgcttaag gcggccgcgg gtttctagaa gtcacatcag cacgacatgc gtgtaaagat 60
acttgaagga gtaatccaat tatcctatta gggggagtca gttcataccc tggtggtttc 120
tctctatcat ggtattgacg gtgagcggac gcagcacaaa catattgatc agcccagcaa 180
ccgcggtcac ggccaaggga agaagtgtct tgcagcagtt ctccgcattc agaagcccag 240
ataccccaat gggctttgcg ttcttgctgg cggtcagggc tactaggact ggcagagctg 300
actggagaga aaagtagatg gggaatgtcg accgttgcag ggctgcgaag tgtggccgcg 360
gcagggacct gaaggccact attccagaga cgaatgacta acaagtaaat gtcagaagtg 420
acaacatgaa agctcgtgat tgtcgatgtc tacctggtag agttggacac ccaggagggt 480
accataacta gtcaacgtca gtctgtcgag atcatttcaa ttggggtgga gcaaacagac 540
ctcacgatgt gaaatggacg agggtcaatc atgttgatga gaaggaaggt tttatctcta 600
actaacggtg tatactatgt agtcaggaga aaagtgtcta gaagaaggtt gcggatgatg 660
tgatgtactt gatggaggaa cggcctggcg gaactgtgga actgtggagg tggtacgatt 720
ctcttatttt cacgtggaaa ttgtatgaca gagcgctaat gccacaaact atccgggctc 780
atatataatg ccacttatat acggctatac agacgcacct ttagtcgcca tgatgtcatg 840
tgcctgcgcg taccgcctag tcccagattg gaaatatcgc gcgtctgcct gaacgaccgt 900
gtcgctccat cctctgttgc ctccccgtgt ctgcctatta aagtgcgcac atccaacaga 960
gggctctcgg agctgtcttc tgctccagtt ccaccatggc cgacaaggaa gcaacggtat 1020
atatcgtcga cgtgggaagg tcgatggggg ttcagcgcaa tggccgttca gtcacagatc 1080
tggaatgggc catgcagtat gtctgggacc gcattacggt aacggtgggt acctggactt 1140
tgatatcctt ttggacggtc gactaagcca agatataggt cgctacagga cggaagacgg 1200
ccatgctggg cgttatcgga cttcggacag atggtgaggt tgctcctaaa cagatatacc 1260
actccacact aaccgaaggt aggaacctcc aacgaacttg aagatgatcc ccatttctcg 1320
aatatttcgg ttctgtcgaa tatcaaacag tatgttctac aagtgataat tgataatttc 1380
cattatccta agtgacggtc aaggtttctc atgccagaca tccgcaagtt agacgatgat 1440
ctcaaaccca gccagaccga taagggagat ggtgattgaa ctagtataac ttcgtataat 1500
gtatgctata cgaagttatg ctagcgcagg gaatacgagc tccaatggac ctcgggagtg 1560
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ggcggagcaa tccacccccg atgtggctgg tgcgtggagg ggctcgcgat gattttactg 1680
agcttgcttt tcttgtcgac attgaacatt gtccttggtc ttccttcaga tttaagggtc 1740
agtcactgct acatttctca gtagtatccg cgcacgtctc tggatttacg aatcagggtc 1800
caccagtcga aacttcgaac tactctcatt atacaatcct ctttccattc ccgcattaac 1860
ccctccatca acaccatgtc ctccaagtcg caattgacct acactgcccg tgccagcaag 1920
catcccaatg ctctggcgaa gaggctgttc gagattgccg aggccaagaa gaccaatgtg 1980
actgtctcgg ctgacgttac caccactaag gagctactag atcttgctga ccgtaggccg 2040
acccgctact ctgcctgatt atgctgcatg caaacttatt aacggtgata ccggactgca 2100
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gtagtcagac tgcggcatcg gatgtccaaa cggtattgat cctgcaggct actatggtgt 2940
ggcacaagga tcaatgcggt acgacgattt gatgcgctag cataacttcg tataatgtat 3000
gctatacgaa gttataagct tcgtatttct ccgcctgtgt ggagctacca tccaataacc 3060
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ccgggggatc cacttaacgt tactgaaatc atcaaacagc ttgacgaatc tggatataag 4260
atcgttggtg tcgatgtcag ctccggagtt gagacaaatg gtgttcagga tctcgataag 4320
atacgttcat ttgtccaagc agcaaagagt gccttctagt gatttaatag ctccatgtca 4380
acaagaataa aacgcgtttc gggtttacct cttccagata cagctcatct gcaatgcatt 4440
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cttagcagag tctattttca ttttcgggag acgagatcaa gcagatcaac ggtcgtcaag 4560
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cttctgtagt ctgccgaacc attagtataa gtccatgtga acaactggaa agaatccata 5580
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gtcctgttcc tccatcgtct gccgctgcag ctgcagtacg ccctggttat ccaactcgcg 5760
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gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 7260
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gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 7440
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 7500
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<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacacaggcg gagaaatacg aagc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcccatagct atggttggca tg 22
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<211> 22
<212> DNA
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<400> 9
tccgcgactt tggcgatcgt tc 22
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<212> DNA
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<400> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcccatagct atggttggca tgggctgcag atttggcgga ggcgcaacag atccccagaa 60
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caatgtcggc ggggtctacc accccaatgg ccagcgggta ggatcggtga gtatgaagga 180
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cgcggggcgc gatatctcat cattctgtct cgaactgctc gcgtggaccc ggtcgtgacg 1140
agtctccaag agcggggctg caccgtttct gtacaggcgt gtgatgtggc cgatgaaagc 1200
cagcttgaag cggctctcca acagtgtcgg gcggaggaaa tgcctccgat tcggggcgtc 1260
atccaagggg caatggttct caaggacgcc ctcgtctcgc aaatgacggc ggacgggttc 1320
catgccgccc tgcggcccaa ggttcaggga agttggaatc tgcaccgaat tgcatcggac 1380
gtggatttct tcgtgatgct ctcatccttg gtgggtgtca tgggaggcgc aggacaagcc 1440
aactacgcgg ctgccggagc gtttcaggac gcgctcgcag agcaccgcat ggctcacaac 1500
cagccagcgg tcaccatcga cctcggaatg gtccagtcaa ttgggtatgt agcagagaca 1560
gattctgctg tggcggaacg actccaacgg atcggctatc aacccttgca cgaagaggag 1620
gttctggacg tcctcgagca agctatatct cctgtgtgtt cccctgccgc acccacacgg 1680
cctgctgtca tcgtcaccgg catcaacacc cgcccaggcc ctcactgggc acacgccgac 1740
tggatgcaag aggctcgctt tgcggggatc aagtatcgtg atccgttgag ggacaatcat 1800
ggagctttgt cgctgacccc ggcggaagat gacaatcttc acgccaggct gaaccgtgca 1860
atcagccaac aggagtcaat cgccgtgatc atggaggcga tgagctgcaa gctcatctca 1920
atgttcggcc tgacggatag cgaaatgtcc gccactcaga cattggcggg gatcggcgtg 1980
gactccctgg tcgccattga gctccggaac tggatcacag ctaagttcaa tgttgatatc 2040
tcagttttcg agttgatgga gggccgaacg atcgccaaag tcgcgga 2087
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtgcgagacg gagacccgat c 21
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gttcaatcac catctccctt acatttcctt gatatatcca tc 42
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgtatttctc cgcctgtgtg ttcacaaagc gcaatgtgga c 41
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aacaagatac gacacgttag g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaacggcaa tcaaccaaga c 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaatagtggc attcgttcct g 21
<210> 19
<211> 3571
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaaacggcaa tcaaccaaga cggccggacc ccagccatca gcacgccgag cggcgaggcc 60
caggagtgcc tgatccaaga ttgctatcag aaggcccagt tggacccaaa acagacttcg 120
tacgttgagg cccatgggac gggaaccaga gcaggagatc cgctggagct tgcagtcatc 180
tcggccgcgt ttccgggaca gcagatacag gtgggctccg tgaaagccaa tatcgggcat 240
acagaggctg tcagtggtct ggcgagtttg ataaaggtgg ctctggctgt tgaaaagggg 300
gttatcccgc ctaatgcaag gttcctccag ccgagcaaga agttgctcaa ggacactcat 360
atccaggtag cattatcttc acgatttttt cctctcattc tattctttct attccagctc 420
ctcgctgatt tacaaacaga ttccactgtg tagccaatca tggataccaa ccgatggtgt 480
ccgtcgcgca tcaataaaca acttcggttt cggaggcgca aatgctcatg caatcgtgga 540
gcaatatggc ccgtttgcag aaacatcgat ctgcccacct aatggttatt ctggcaacta 600
tgatggcaat ttaggaacgg atcaagcgca tatatatgtg ctgagtgcca aggatgagaa 660
cagttgcatg agaatggttt caaggctgtg cgactatgct acccacgcca gaccagccga 720
cgatttgcaa ttgctcgcga atatagcata cacgcttggt tctcgtcgct cgaacttccg 780
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aggcatgcgg ccaagcaagt cagccgacca agtaagactg ggatgggtgt tcacaggcca 900
gggagcgcaa tggtttgcaa tgggtcgtga gttgattgag atgtatcctg tctttaaaga 960
ggccctgctg gaatgcgatg gatatatcaa ggaaatgtaa gggagatggt gattgaacta 1020
gtataacttc gtataatgta tgctatacga agttatgcta gcgcagggaa tacgagctcc 1080
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tatgcagagc ggccagcacg ttgggaagat tgttgtgaca gtagcccccg atgacgcggt 3540
cctcgttcgt caggaacgaa tgccactatt t 3571
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
taagggagat ggtgattgaa cttcacaaag cgcaatgtgg ac 42
<210> 21
<211> 2011
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaaacggcaa tcaaccaaga cggccggacc ccagccatca gcacgccgag cggcgaggcc 60
caggagtgcc tgatccaaga ttgctatcag aaggcccagt tggacccaaa acagacttcg 120
tacgttgagg cccatgggac gggaaccaga gcaggagatc cgctggagct tgcagtcatc 180
tcggccgcgt ttccgggaca gcagatacag gtgggctccg tgaaagccaa tatcgggcat 240
acagaggctg tcagtggtct ggcgagtttg ataaaggtgg ctctggctgt tgaaaagggg 300
gttatcccgc ctaatgcaag gttcctccag ccgagcaaga agttgctcaa ggacactcat 360
atccaggtag cattatcttc acgatttttt cctctcattc tattctttct attccagctc 420
ctcgctgatt tacaaacaga ttccactgtg tagccaatca tggataccaa ccgatggtgt 480
ccgtcgcgca tcaataaaca acttcggttt cggaggcgca aatgctcatg caatcgtgga 540
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<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cacgatctga tcggattgca g 21
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gttcaatcac catctccctt actttccatg gcctcttgaa tg 42
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgtatttctc cgcctgtgtg tggacatcga ggacgatcca g 41
<210> 25
<211> 21
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<400> 25
gaatcgagga gcccaggagt c 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
catggcacaa tgtgcttcgt g 21
<210> 27
<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
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<210> 28
<211> 3624
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
catggcacaa tgtgcttcgt gtgtcagatt tgccatggct acgcgaccac gtcgtcggct 60
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gtcaccaacg acgacttcac acttttgacc tcaatgctac agctggctgg gggaacttta 3300
tgggtcaccc aaggagcgac aatgaagtct gatgatcccc tgaaggctct acacctcgga 3360
ttactacgta ccatgcgtaa tgaaagccat ggcaagcgat ttgtctcact tgacctcgac 3420
ccttcgcgta atccatggac aggcgattcg cgcgatgcca ttgtcagtgt tctggattta 3480
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cctcgggcat ttagtgactc catcaatgga ggcgaggaag acgggtatgc cttggagcca 3600
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<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctaccgagg gccaaatatg cgtattcctt ggagaggtgg aacactccat gcttggttca 1680
gtcaccaacg acgacttcac acttttgacc tcaatgctac agctggctgg gggaacttta 1740
tgggtcaccc aaggagcgac aatgaagtct gatgatcccc tgaaggctct acacctcgga 1800
ttactacgta ccatgcgtaa tgaaagccat ggcaagcgat ttgtctcact tgacctcgac 1860
ccttcgcgta atccatggac aggcgattcg cgcgatgcca ttgtcagtgt tctggattta 1920
attagcatgt cagatgaaaa ggagtttgac tatgcagagc gggatggagt tatccatgtt 1980
cctcgggcat ttagtgactc catcaatgga ggcgaggaag acgggtatgc cttggagcca 2040
ttccaggaca gccagcatct cctg 2064
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcacaaaca tattgatcag c 21
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggatcctccc agagtgtaag catcaaatcg tcgtaccgca 40
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aagcttgaga tccacttaac gttactgaaa tcatc 35
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaaggcgaaa agtagtctcg tg 22
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acaactcatc aatcatcaca tggctgcaga tcaaggtat 39
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gttaagtgga tctcaagctt catggaggaa tattgttga 39
<210> 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa agaagcatga cggcaagtgg 420
acgattgacc tcgagccgta gggatggcca taatggagat ggtatccact gcgaaagaaa 480
aaaaaagtgt tgcgaaaaaa atagattgaa gaagattaca aatagaccaa tctttaatta 540
cctactaatg ggtcagatga aaaataaacc cagcgcgtga tcgaagagca tggcgacagg 600
ctgtccggtg aaggtttctg gagtccggag aagaccctcc atgcatggaa agggagttcc 660
agccctttga agaggccgga cacatattgt tccatcccga cgtatgggcc gaaagcggca 720
tggccggacg tgcccctcct tgtagggtga tggatggtgg gatgttgatg gcgttacact 780
ctgggaggat ccaggtactt ccattcttac taggaagtat ttcggcctag actaatacaa 840
cgaaagaaac tgttcgattc tacgggaaaa gtactccaat tccattacat catcgcattc 900
tccctctcgt aaggtaccta ccacaaaccc ccactatcgt tcatccgtcc ccggttacaa 960
cgggaagaaa aagcccgggg agagggggaa gaagaaaatc ccaagggacg ggaatagccg 1020
tgcggaagag aagacgatta gcctaggtag aagcctcatg gccgaccatt tgattccgaa 1080
aagctggcaa aacattcacg agatagacac agtgaggacc cggacgatgc cctatgcggc 1140
gcgctgattg gccaggccgg gcagtgccga agcagcaaat atcgtgagtc tcctgctttg 1200
cccggtgtat gaaaccggaa agggttgctg gggagctggt cagcggcgca agccgggagg 1260
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gcctgctgcg cctcccattg ggtcttcccc aacgtgactg ggtcgttgcg tcagtccatg 1380
tcgctgcctt tttcttcctc cccctccccc gctgtccttc ttcttcttct tcttctctct 1440
ttctcccatc atcctctcat cctctgcctt tcccatcgaa ctcacttctt ctaccaacaa 1500
ctcatcaatc atcacaacat gttgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 1560
atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 1620
gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 1680
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ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 1980
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ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 2160
aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tcacggcatg 2220
gacgagctgt acaagtaaag cggccgggag atctaagctt gcggccgcgg atccacttaa 2280
cgttactgaa atcatcaaac agcttgacga atctggatat aagatcgttg gtgtcgatgt 2340
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gtataaacct cgaaaatcat tcctactaag atgggtatac aatagtaacc atggttgcct 2880
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tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt 3060
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tgccagttgt tcccagtgat cttcgtttcg aagatggaca ctcccaattt gtgcaagtta 3240
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ctggcgttga ggatgtcagc gaaactcggc ccggcaagtg acacccgaaa agtatcgact 3480
ccggctgccc gtttcaagct agtggcttcc tcatcagcga gtcggccaag gagacgtgaa 3540
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atctgctgct tggtgcacga taacttggtg cgtttgtcaa gcaaggtaag tgaacgaccc 4380
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tccggaagtg cttgacattg gggaattcag cgagagcctg acctattgca tctcccgccg 4740
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ggtcgcggag gccatggatg cgatcgctgc ggccgatctt agccagacga gcgggttcgg 4860
cccattcgga ccgcaaggaa tcggtcaata cactacatgg cgtgatttca tatgcgcgat 4920
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cgcgcaggct ctcgatgagc tgatgctttg ggccgaggac tgccccgaag tccggcacct 5040
cgtgcacgcg gatttcggct ccaacaatgt cctgacggac aatggccgca taacagcggt 5100
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cgcaatcgtc cgatccggag ccgggactgt cgggcgtaca caaatcgccc gcagaagcgc 5400
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tacctcttcc agatacagct catctgcaat gcattaatgc attggacctc gcaaccctag 5760
tacgcccttc aggctccggc gaagcagaag aatagcttag cagagtctat tttcattttc 5820
gggagacgag atcaagcaga tcaacggtcg tcaagagacc tacgagactg aggaatccgc 5880
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tactctgata gcttgactat gaaaattccg tcaccagccc ctgggttcgc aaagataatt 6000
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ctcgaaaatc attcctacta agatgggtat acaatagtaa ccatggttgc ctagtgaatg 6120
ctccgtaaca cccaatacgc cggccgaaac ttttttacaa ctctcctatg agtcgtttac 6180
ccagaatgca caggtacact tgtttagagg taaccttctt tctagaaatc tccagaggat 6240
cgccgggaac cgaggacgag ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 6300
tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 6360
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ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 6480
cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 6540
cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 6600
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gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 6720
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 6780
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gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 7020
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ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 7140
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 7200
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gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 7800
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gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 8280
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tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 8494
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ttacactctg ggaggatcca ggtac 25
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgtgatgatt gatgagttgt tg 22
<210> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ttccagagac gaatgactaa caag 24
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gcgaaaggat cttgtgatca atgc 24
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ttccagagac gaatgactaa caagtaaatg tcagaagtga caacatgaaa gctcgtgatt 60
gtcgatgtct acctggtaga gttggacacc caggagggta ccataactag tcaacgtcag 120
tctgtcgaga tcatttcaat tggggtggag caaacagacc tcacgatgtg aaatggacga 180
gggtcaatca tgttgatgag aaggaaggtt ttatctctaa ctaacggtgt atactatgta 240
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ggcctggcgg aactgtggaa ctgtggaggt ggtacgattc tcttattttc acgtggaaat 360
tgtatgacag agcgctaatg ccacaaacta tccgggctca tatataatgc cacttatata 420
cggctataca gacgcacctt tagtcgccat gatgtcatgt gcctgcgcgt accgcctagt 480
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tccccgtgtc tgcctattaa agtgcgcaca tccaacagag ggctctcgga gctgtcttct 600
gctccagttc caccatggcc gacaaggaag caacggtata tatcgtcgac gtgggaaggt 660
cgatgggggt tcagcgcaat ggccgttcag tcacagatct ggaatgggcc atgcagtatg 720
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actaagccaa gatataggtc gctacaggac ggaagacggc catgctgggc gttatcggac 840
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atcaaacagt atgttctaca agtgataatt gataatttcc attatcctaa gtgacggtca 1020
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ctccgccttt gcaggtgtgg ctgaacccca cgggtcggag gcggagcaat ccacccccga 1260
tgtggctggt gcgtggaggg gctcgcgatg attttactga gcttgctttt cttgtcgaca 1320
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aggctgttcg agattgccga ggccaagaag accaatgtga ctgtctcggc tgacgttacc 1620
accactaagg agctactaga tcttgctgac cgtaggccga cccgctactc tgcctgatta 1680
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cgacgatttg atgcttacac tctgggagga tccaggtact tccattctta ctaggaagta 2640
tttcggccta gactaataca acgaaagaaa ctgttcgatt ctacgggaaa agtactccaa 2700
ttccattaca tcatcgcatt ctccctctcg taaggtacct accacaaacc cccactatcg 2760
ttcatccgtc cccggttaca acgggaagaa aaagcccggg gagaggggga agaagaaaat 2820
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cagctacgac tggtcgtgga cctcgattgg cactgacgag gctattgaca ctgactgctg 3780
ggggctgtcc caatgtgatg gaggcttcag ctgtcagtta gagccaacgc tgccggatct 3840
accttcgccc ttcgagtcta cggttgaaaa agctccgttg ccaccggtat cgagcgacat 3900
tgctcgtgcg gccagtgcgc aacgagagct tttcgatgac ctgtcggcgg tgtcgcagga 3960
actggaagag atccttctgg ccgtgacggt agaatggccg aagcaggaaa tctggacccg 4020
tgcgtcgccg cattccccaa ctgcttcccg tgagaggata gcacagcgcc gacaaaacgt 4080
atgggcaaac tggctaacag acttgcatat gttctcacta gatcccatcg gaatgttttt 4140
caatgcgtca cgacggcttc ttactgtcct gcgccaacaa gcgcaggccg actgccatca 4200
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attgaatgtg cggattttga ccgccatatc ggagttgctc ctgtcgcaaa ttaggcggac 4320
ccagaacagc catatgagcc cactggaagg gagtcgatcc cagtcgccga gcagagacga 4380
caccagcagc agcagcggcc acagcagtgt tgacaccata cccttcttta gcgagaacct 4440
ccctattggt gagctgttct cctatgttga ccccctgaca cacgccctat tctcggcttg 4500
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