阅读说明：本技术 一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用 (Host aspergillus oryzae knockout system and construction method and application thereof ) 是由 王婧臻 郑红云 楚杰 王莹 于 2019-12-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种宿主米曲霉表达系统及其构建方法与应用。所述宿主米曲霉表达系统的构建方法,步骤如下：(i)将重组质粒pBluescript-hph-rfp的多克隆位点上通过酶切连接的方法构建上敲除同源臂；(ii)将活化后的曲霉菌丝加入到细胞壁裂解酶溶液中,制得感受态原生质体；然后加入含有敲除同源臂的重组质粒,制得转化原生质体；(iii)将转化原生质体进行筛选培养,选取转化子,制得宿主米曲霉表达系统。本发明首次将RFP红色荧光蛋白应用到米曲霉基因敲除的过程当中,可以快速有效的排除掉大量假阳性的转化子。(The invention relates to a host aspergillus oryzae expression system and a construction method and application thereof. The method for constructing the host aspergillus oryzae expression system comprises the following steps: (i) constructing a knockout homologous arm on a multiple cloning site of the recombinant plasmid pBluescript-hph-rfp by a restriction enzyme digestion connection method; (ii) adding the activated aspergillus hyphae into a cell wall lyase solution to prepare a competent protoplast; then adding recombinant plasmid containing knockout homology arm to prepare transformed protoplast; (iii) and screening and culturing the transformed protoplast, and selecting a transformant to obtain a host aspergillus oryzae expression system. The RFP red fluorescent protein is applied to the gene knockout process of aspergillus oryzae for the first time, so that a large number of false positive transformants can be quickly and effectively eliminated.)

一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种宿主米曲霉表达系统及其构建方法与应用，特别涉及利用多种破壁酶降解真菌的细胞壁，用具有潮霉素抗性和RFP红色荧光蛋白的双重筛选质粒作为介导，通过原生质体转化的方法，构建的米曲霉基因敲除体系，属于分子生物学技术领域。

背景技术

米曲霉因其强大的胞外蛋白分泌能力，被广泛的应用于工业和食品产业中。米曲霉生长速度较快，初期呈现黄色或者黄绿色菌落，随着菌株生长后期变为黄褐色，能产生大量的分生孢子。米曲霉有着丰富的酶系，可产生蛋白酶、淀粉酶和果胶酶等等。由于其高效的蛋白分泌能力，优良菌株的选育和研究已经成为米曲霉研究的重要内容。

伴随着科学技术的发展，通过基因组工程技术，进行遗传改造的方法在米曲霉上也得到了广泛应用，相比于传统的化学诱变、物理诱变和原生质体融合等方法，目的性更强效率更高。现有的专利中大多使用农杆菌介导的方式进行转化，相对来讲操作步骤较多，操作相对复杂，农杆菌的培养时间较长，增加实验时间。改进现有的转化方法，以期获得更简便的操作，节省转化的时间和工作量是研究的重要内容。制备原生质体进行转化是丝状真菌中使用到的转化方法，例如CN105463009A和CN103865948A等专利中，都提到了在不同的丝状真菌中原生质体的制备方法。丝状真菌的细胞壁成分主要为几丁质、葡聚糖和甘露聚糖。对于不同的真菌，其细胞壁的成分及比例存在较大的差异。因此，针对不同的菌株要制定相对应的细胞壁酶解方案，以提高原生质体的制备效率和质量。

在米曲霉的基因改造中，常用的转化筛选方法包括营养缺陷型标记、抗性基因标记筛选法。米曲霉的营养缺陷型难以获得且操作复杂，因此限制了这一选择性标记的应用范围。药物抗性基因转入后，可使菌株在一定浓度的药物下生长，作为显性筛选标记应用相对广泛。常使用的抗生素有潮霉素，博来霉素，腐草霉素和黄安尿素等。因此使用药物抗性基因是米曲霉转化中经常使用的筛选方法。但米曲霉对多种药物具有抗性，能使用的抗性标记种类较少，在利用抗性基因筛选过程中常常观察到假阳性现象(抗生素未能完全抑制生长的非转化子)，影响阳性转化子的挑取和筛选，增加实验中的工作量。

1999年红色荧光蛋白首次被报道，与绿色荧光蛋白相比，红色荧光蛋白的激发和发射波长更长可以覆盖绿色荧光蛋白所不能涉及的波长段，更为重要的是红色荧光蛋白在细胞中成像观察时背景更低，更适用于生物学研究。因此将红色荧光蛋白应用到米曲霉的转化体系中具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用，其以潮霉素抗性和RFP荧光蛋白的双重筛选质粒作为介导，并通过原生质体制备的方式进行转化解决现有系统中存在的转化操作复杂和假阳性过高的问题。

本发明所解决的技术问题采用以下方案来实现：

一种重组质粒pBluescript-hph-rfp，采用如下方法制备：

(1)以pCSR1::hph质粒为模板，进行PCR扩增，获得潮霉素抗性基因片段；

所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述：

HPH-F：ATAAGCTTGATATCGAATTCGGAGGTCAACACATCAATGC；SEQ ID NO.1

HPH-R：ACGTCCTCGGAGGAGGCCATCTCTATTCCTTTGCCCTCGG；SEQ ID NO.2

(2)以质粒pDB790，进行PCR扩增，获得红色荧光蛋白表达基因片段；

所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述：

RFP-F：CCGAGGGCAAAGGAATAGAGATGGCCTCCTCCGAGGACGT；SEQ ID NO.3

RFP-R：GCTCTAGAACTAGTGGATCCTTAGGCGCCGGTGGAGTGGC；SEQ ID NO.4

(3)以步骤(1)制得的潮霉素抗性基因片段(HPH)和步骤(2)制得的红色荧光蛋表达基因片段(RFP)为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所述的引物经overlap PCR扩增，制得HPH+RFP表达元件；

(4)将载体pBluescript和步骤(3)制得的HPH+RFP表达元件经限制性内切酶EcoRΙ和BamHΙ双酶切，然后进行连接，制得重组质粒pBluescript-hph-rfp。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增体系如下：

PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸5min。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下：

PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，overlap PCR扩增体系如下：

Overlap PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸5min。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，连接条件为T4连接酶16℃条件下连接3h。

一种宿主米曲霉表达系统，含有上述重组质粒pBluescript-hph-rfp。

上述宿主米曲霉表达系统的构建方法，步骤如下：

(i)将重组质粒pBluescript-hph-rfp的多克隆位点上通过酶切连接的方法构建上敲除同源臂；

(ii)将活化后的曲霉菌丝加入到细胞壁裂解酶溶液中，在30℃下酶解2.5小时，过滤并离心，STC溶液悬浮，制得感受态原生质体；然后加入步骤(i)制得的含有敲除同源臂的重组质粒，在质量百分比60％的PEG4000溶液环境中，室温放置25min，制得转化原生质体；

所述细胞壁裂解酶溶液组份如下，均为质量百分比：

1％纤维素酶(cellulase)、1％裂解酶(lysing)、0.15％蜗牛酶(Snailase)、余量为浓度0.7M的NaCl水溶液；

(iii)将步骤(ii)制得的转化原生质体在26～29℃、含有潮霉素的完全培养基中进行筛选培养70～75h，选取转化子，基因验证，制得宿主米曲霉表达系统。

根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，STC溶液组份如下：

山梨醇0.8M、Tris-HCl 50mM、CaCl₂ 50mM，pH8.0。

根据本发明优选的，所述步骤(iii)中，潮霉素的浓度为600mg/ml。

根据本发明优选的，所述步骤(iii)中，完全培养基每升组份如下：

氮盐溶液50ml、葡萄糖10g、蛋白胨2g/L、酵母提取物1g/L、水解酪蛋白1g/L、琼脂粉15g/L；所述氮盐溶液每升组份如下：

NaNO₃ 120g、KCl 10.4g、MgSO₄·7H₂O 10.4g、KH₂PO₄ 30.4g。

上述宿主米曲霉表达系统在胞外表达外源蛋白中的应用。

根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：

将外源蛋白表达基因***重组质粒pBluescript-hph-rfp中的多克隆位点处，制备含有敲除同源臂的米曲霉敲除系统，然后通过培养验证，即得米曲霉敲除突变体，然后进行发酵培养，即得。

有益效果

本发明首次将RFP红色荧光蛋白应用到米曲霉基因敲除的过程当中，直接的观察转化效果，可以快速有效的排除掉大量假阳性的转化子，减少实验中因大量提取DNA所带来的工作量，弥补在基因改造过程中，因米曲霉抗性强所带来的单独使用抗性基因假阳性转化子较多所带来的实验不足。

附图说明

图1为本发明所述重组质粒pBluescript-hph-rfp的构建结构示意图；

图2为本发明中重组质粒电泳图及单酶切检测结果电泳图的结果照片；

其中：泳道1、4、6为Marker，泳道2为HPH基因，泳道3为RFP基因，泳道5为HPH基因和RFP基因ovverlap PCR后的片段；泳道7为EcoR I单酶切验证pBluescript-hph-rfp重组载体；

图3为本发明中敲除载体的构建结构示意图；

图4为本发明获得的转化子的结果照片；

图5为本发明所获得转化子荧光观察结果照片；

图6为对比例中不同方法获得的原生质体进行潮霉素抗性验证结果照片。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白清晰，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

载体来源

实施例中的pBluescript的载体，可按照文献M.A.Alting-Mees andJ.M.Short.pBluescript II:gene mapping vectors.Nucleic Acids Res.1989Nov 25；17(22):9494.中公开的内容构建获得；

pCSR1::hph载体可参照Cyclosporin A-resistance based gene placementsystem for Neurospora crassa.Fungal Genet Biol.2007May；44(5):307-14.Epub2007Jan 12.中的载体信息获得；

pDB790载体可参照Efficient disruption of Zebrafish genes using a Gal4-containing gene trap.BMC Genomics.2013Sep 14；14:619.doi:10.1186/1471-2164-14-619.中的载体信息获得。

纤维素酶购自Sigma-Aldrich公司；

裂解酶购自Sigma-Aldrich公司；

蜗牛酶购自北京索莱宝科技有限公司；

实施例

以潮霉素抗性和RFP荧光蛋白质粒介导的米曲霉基因敲除体系构建方法，具体如下：

1)构建HPH+RFP表达元件

①对潮霉素抗性基因进行克隆，序列为SEQ ID NO:5所示，所用引物核苷酸序列如下：

HPH-F：ATAAGCTTGATATCGAATTCGGAGGTCAACACATCAATGC；SEQ ID NO.1

HPH-R：ACGTCCTCGGAGGAGGCCATCTCTATTCCTTTGCCCTCGG；SEQ ID NO.2

获得的片段大小为1.4kb，在片段的两端分别加入骨架片段的20bp序列和RFP起始的20bp序列(用下划线表示)；对RFP序列进行扩增，同样引物的两端分别加入HPH序列末尾20bp序列和骨架上的20bp碱基(用下划线表示)，所用引物核苷酸序列如下：

RFP-F:CCGAGGGCAAAGGAATAGAGATGGCCTCCTCCGAGGACGT；SEQ ID NO.3

RFP-R：GCTCTAGAACTAGTGGATCCTTAGGCGCCGGTGGAGTGGC；SEQ ID NO.4

扩增获得的片段大小为0.7kb，序列为SEQ ID NO:6所示；引物设计时在两片段需要连接的位置加入20bp的重复序列(引物中加有下划线的20bp)，作为同源臂，通过HPH-F和RFP-R作为引物两个两片段作为模板，利用overlap PCR进行扩增，形成大小为2.1kb的HPH+RFP表达元件(结果如图2所示)。

②如图1中所示，将载体pBluescript和HPH+RFP表达元件均使用EcoRΙ和BamHΙ进行在37℃下进行双酶切，酶切5个小时，使得载体骨架和片段两端均形成相同的粘性末端。对酶切产物进行回收后，再利用T4连接酶对两个酶切产物进行连接，获得能够在米曲霉中表达潮霉素和红色荧光蛋白的表达载体(如图1所示)。重组的表达载体大小为5.2kb，用EcoR I进行单酶切对重组载体进行验证(结果如图2所示)。

2)敲除载体的构建

以pBluescript-hph-rfp重组载体为骨架，将所要敲除的基因两端约1000bp序列进行PCR克隆，利用酶切链接的方法分别将所敲除基因的上、下两端序列连接到pBluescript-hph-rfp重组载体中HPH+RFP表达元件的两端，形成最终敲除基因所使用的载体(如图3所示)。最终构建好的质粒可直接通过原生质体转化的方法进入到米曲霉细胞中，并进行基因重组，完成基因重组的过程。

3)米曲霉感受态细胞的制备及转化

将培养获得的米曲霉菌丝在30℃条件下160rpm培养14小时，用1层滤布(Miracloth)进行过滤，获得的菌丝加入到30mL细胞壁裂解液中(1％cellulase，1％lysing和0.15％Snailase溶解于0.7M NaCl中)中，28℃酶解3小时获得原生质体，离心后用150ul的1xSTC(20％Sucrose，50mM Tris·Cl(pH 8.0)，50mM CaCl₂)进行悬浮，即为感受态细胞。将10ug的质粒转化加入到感受态细胞中，并同时加入1mL 60％的PEG 4000，吸打混匀并室温放置25min。

4)平板培养及转化子筛选

将完全培养基加后冷却至45℃后于上一步中的产物进行混匀，并倒入培养皿中，吹干凝固后形成第一层培养基；再将加有600ug/ml潮霉素的完全培养基倒入到第一层培养基上，凝固形成上层的含药培养基，对转化子进行抗性筛选。将上述培养皿倒置摆放，在28℃黑暗条件下培养3天，即可观察到形成的转化子菌落(结果如图4所示)。

直接将生长出的转化子挑取少量菌丝放置到载玻片上，使荧光显微镜在激发光561nm下进行观察，直接观察红色荧光蛋白的表达情况，以确定基因转入的结果(荧光观察结果如图5所示)。将观察到红色荧光菌落的菌丝提取DNA进行PCR扩增，验证基因是否敲除成功。结果证明，本发明能有效降低转化子假阳性率，减少筛选工作量，克服了现有体系中抗性筛选标记不足的问题。

对比例

采用三种不同的酶解液制备原生质体，并进行潮霉素抗性筛选，观察不同方法制备的原生质体对潮霉素抗性的敏感程度，采用不含潮霉素的培养基上培养作为对照。

A：用实施例制备原生质体的方法进行潮霉素抗性验证。

B：如实施例所述制备原生质体的方法，不同之处在于，用2.5％driselase(购自Sigma-Aldrich)和0.5％lysing的酶解液在30℃下进行细胞壁酶解3小时，然后对制得的原生质体进行潮霉素抗性验证。

C：如实施例所述制备原生质体的方法，不同之处在于，用0.5％lysing配置酶解液制备原生质体，30℃条件下酶解3小时，然后对制得的原生质体进行潮霉素抗性验证。

结果如表1和图1所示，采用本发明方法制备的原生质体对潮霉素更加的敏感，这也能够在后续的筛选过程中降低米曲霉抗性强所带来的影响，减少假阳性菌落的数量。

表1

序列表

<110> 齐鲁工业大学

山东省科学院生物研究所

<120> 一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

ataagcttga tatcgaattc ggaggtcaac acatcaatgc 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

acgtcctcgg aggaggccat ctctattcct ttgccctcgg 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

ccgagggcaa aggaatagag atggcctcct ccgaggacgt 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

gctctagaac tagtggatcc ttaggcgccg gtggagtggc 40

<210> 5

<211> 1346

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

ggaggtcaac acatcaatgc ctattttggt ttagtcgtcc aggcggtgag cacaaaattt 60

gtgtcgtttg acaagatggt tcatttaggc aactggtcag atcagcccca cttgtagcag 120

tagcggcggc gctcgaagtg tgactcttat tagcagacag gaacgaggac attattatca 180

tctgctgctt ggtgcacgat aacttggtgc gtttgtcaag caaggtaagt ggacgacccg 240

gtcatacctt cttaagttcg cccttcctcc ctttatttca gattcaatct gacttaccta 300

ttctacccaa gcatccaaat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt 360

ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct 420

cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc 480

gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt 540

ccggaagtgc ttgacattgg ggagttcagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt 600

gcacagggtg tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctccagccg 660

gtcgcggagg ccatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc 720

ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt 780

gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc 840

gcgcaggctc tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc 900

gtgcatgcgg atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc 960

attgactgga gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcctcttc 1020

tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg 1080

gagcttgcag gatcgccgcg cctccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc 1140

tatcagagct tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac 1200

gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg 1260

gccgtctgga ccgatggctg tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc 1320

actcgtccga gggcaaagga atagag 1346

<210> 6

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

atggcctcct ccgaggacgt catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccctc agttccagta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacttga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggcga gttcatctac 360

aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcggatg taccccgagg acggcgccct gaagggcgag 480

atcaagatga ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg acgccgaggt caagaccacc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca agaccgacat caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgagcgcgc cgagggccgc 660

cactccaccg gcgcctaa 678