一种含膦大环化合物及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种含膦大环化合物及其制备方法与应用 (Macrocyclic compound containing phosphine and preparation method and application thereof ) 是由 徐伟 吴曙光 于 2021-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种含膦大环化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂合物。本发明提供的化合物能够有效抑制ALK激酶以及相关突变激酶的活性,且能够有效抑制癌细胞增殖。(The present invention relates to a phosphine-containing macrocyclic compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof. The compound provided by the invention can effectively inhibit the activity of ALK kinase and related mutant kinase, and can effectively inhibit cancer cell proliferation.)
本申请要求于2020年06月17日提交中国专利局的申请号为202010554936.4、名称为“一种含膦大环化合物及其制备方法与应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及癌症的预防和治疗领域，具体涉及一种含膦大环化合物及其制备方法与应用。
背景技术
间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)属于受体酪氨酸激酶中胰岛素受体超家族之一。正常情况下，ALK在大脑的发育和生长中起着重要的作用。ALK的异常与肿瘤的发生发展密切相关。ALK通过基因突变、基因扩增以及基因重排的机理引起细胞异常增殖而诱发肿瘤。
非小细胞肺癌(Nonsmall cell lung cancer，NSCLC)是致命的恶性肿瘤之一，预后差，死亡率高。85％的NSCLC患者中，约有5％存在ALK基因突变、基因扩增和重排。约3-7％的NSCLC有棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)-ALK融合蛋白的表达。60％的间变性细胞淋巴瘤有第2和第五号染色体的易位产生结合基因NPM-ALK的表达。这些融合表达均可促使肺癌发生和发展。ALK激酶在肿瘤发生中的关键作用使其成为重要的药物分子靶点。
ALK抑制剂已批准用于ALK基因突变、基因扩增以及基因重排的非小细胞肺癌的治疗。但是大多数患者在治疗后由于ALK基因发生突变，出现耐药而导致治疗失败。因此，急需新的ALK抑制剂用于药物引起突变耐药的患者的治疗。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种含膦大环化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂合物。
本发明提供的化合物的结构如式I或式II所示：
其中：
X、Y各自独立地选自C、O、S、N；当X或Y是C或N时，可以被一个或两个R13取代；
n是0、1、2、3的整数；
m是1或2的整数；
G是C或N；当G是C时，可被R10取代；
E是C或N；当E是C时，可被R9取代；
U是C或N；当U是C时，可被R7取代；
A、T、Q、W各自独立地选自C或N，当A、T、Q或W是C时，可被或R6取代；
K是O、S、N或羰基，当K是N时，可被R14取代；
R1、R2各自独立地选自氢、卤素、氰基、氨基、羟基、烷基或取代的烷基、烷氧基或取代的烷氧基、烯基或取代的烯基、炔基或取代的炔基、环烷基或取代的环烷基；
R3、R11各自独立地选氢、C1-4烷基；
R4、R5各自独立地选氢、C1-5烷基、羟基、C3-7环烷基和C1-5烷氧基；
R6选自氢、卤素、C1-5烷基、烯基、炔基、环烷基、氰基、硝基、氨基、烷氧基；
R7、R9、R10各自独立地选自氢、C1-5烷基、羟基、C3-7环烷基和C1-5烷氧基；
R8为含有至少一个氮杂五元环、氮杂六元环或氮杂七元环的基团；
R12选自氢、卤素、羟基、氰基、Cl-5烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、氨基；
R13选自氢、烷基、羟基、氰基、氨基、环烷基、氧代；
R14选自氢、烷基、羟基、氨基、环烷基。
作为本发明的优选方案，X、Y均代表C，n代表0或1。
作为本发明的优选方案，K代表O，m代表1或2。
作为本发明的优选方案，G、E、U均代表C。
作为本发明的优选方案，A、Q、W、T均代表C。进一步优选地，A可被取代。
作为本发明的优选方案，R1、R2各自独立地选自氢、卤素、氰基、氨基、羟基、C1-3烷基或取代的C1-3烷基、C1-3烷氧基或取代的C1-3烷氧基。进一步优选地，R1代表氢或C1-3烷基或取代的C1-3烷基，R2代表氢、卤素、氰基、氨基、羟基、C1-3烷基或取代的C1-3烷基、C1-3烷氧基或取代的C1-3烷氧基。其中，所述卤素更优选为F或Cl。其中，所述C1-3烷基更优选为甲基，所述C1-3烷氧基更优选为甲氧基。
作为本发明的优选方案，R3代表氢。
作为本发明的优选方案，R4、R5各自独立地代表C1-5烷基，优选为Cl-3烷基。更优选地，R4、R5均为甲基。
作为本发明的优选方案，R7代表氢。
作为本发明的优选方案，所述R8选自如下基团：
作为本发明的优选方案，R9、R10各自独立地选自氢、C1-5烷基、C1-5烷氧基。进一步优选地，R9代表氢，R10代表氢、C1-5烷基或C1-5烷氧基。其中，所述C1-5烷基优选为C1-3烷基，更优选为甲基。其中，所述C1-5烷氧基优选为C1-3烷氧基，更优选为甲基。
作为本发明的优选方案，R11代表氢。
作为本发明的优选方案，R12代表Cl-5烷基，优选为Cl-3烷基，更优选为甲基。所述R12的取代位置优选为K原子的邻位。
作为本发明的优选方案，所述化合物选自如下结构：
本发明的第二目的是提供本发明所述化合物的制备方法。
当所述化合物具有通式I所示的结构时，其制备方法包括如下步骤：
碘化物与膦氧化物反应，得到氧化膦化合物，然后与二氯嘧啶发生亲核取代反应；所得产物与溴代苯胺发生亲核取代反应；所得产物在钯试剂、P(OMe-Ph)3、碱和溶剂存在下加热，发生Heck偶联反应得到大环化合物中间体；加氢还原得到终产物I。
当所述化合物具有通式II所示的结构时，其制备方法包括如下步骤：
碘化物与膦氧化物反应，得到氧化膦化合物，然后与二氯嘧啶发生亲核取代反应；所得产物与溴代苯并呋喃发生亲核取代；所得产物在钯试剂、P(OMe-Ph)3、碱和溶剂存在下加热，发生Heck偶联反应得到大环化合物中间体；加氢还原得到终产物II。
本发明的第三目的是提供一种药物组合物，其包括本发明提供的化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂合物，以及赋形剂。
本发明的第四目的是提供所述化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂合物或所述药物组合物，在抑制ALK基因突变、抑制ALK基因重排和/或抑制ALK基因扩增中的用途。
本发明的第五目的是提供所述化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂合物或所述药物组合物，在制备抑制ALK活性的药物中的用途。
本发明的第六目的是提供所述化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂合物或所述药物组合物，在制备用于治疗由ALK基因突变、ALK基因重排和/或ALK基因扩增引起疾病的药物中的用途。所述疾病优选为癌症，优选为非小细胞肺癌或血液肿瘤。本发明提供的化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂合物或所述药物组合物，针对应用ALK抑制剂后出现耐药性的癌症具有显著效果。
本发明的第七目的是提供一种抑制ALK基因突变、抑制ALK基因重排和/或抑制ALK基因扩增的方法，该方法包括如下步骤：向目标动物施用有效量的本发明所述的化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂合物或本发明所述的药物组合物。
本发明的第八目的是提供一种治疗由ALK基因突变、ALK基因重排和/或ALK基因扩增引起疾病的方法，该方法包括如下步骤：向目标动物施用有效量的本发明所述的化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂合物或本发明所述的药物组合物。所述疾病优选为癌症，优选为非小细胞肺癌或血液肿瘤。本发明提供的化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂合物或所述药物组合物，针对应用ALK抑制剂后出现耐药性的癌症具有显著效果。
本发明的第九目的是提供一种ALK抑制剂，所述抑制剂包含本发明所述的化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂合物或本发明所述的药物组合物。优选地，所述抑制剂抑制ALK基因突变、抑制ALK基因重排和/或抑制ALK基因扩增。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行详细描述，但实施例仅对本发明的实施方案进行描述，而不是限制本发明的范围。本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括但不限于本发明实施例采用的方法以及本领域技术人员所熟知的替代方法，所优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。本领域中专业技术人员在本发明设计思路的前提下，对本发明的技术方案做出的各种改变和替换，均属于本发明的保护范围。
定义
除非另有定义，本文使用的术语和技术的含义与本发明所属领域的技术人员的理解相同。
本文中使用的“ALK”是指间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase)。
术语“烷基”指由1-10个碳原子的直链和支链脂族基团，任选被一个或多个取代基取代；示例性的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基等。
术语“亚烷基”是指上述定义的烷基位于两个化学基团之间并连接这两个化学基团的基团；示例性的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚丁基等。
术语“卤代烷基”指一个或多个氢被卤素替代的烷基链；示例性的卤代烷基的例子包括但不于三氟甲基等。
术语“羟基烷基”是指-烷基-OH；
术语“烷氧基”指-O-C1-C5-烷基；
术语“环烷基”是指具有3-12个碳组成的饱和的和部分饱和的环状烃基团，可任选被取代。示例性的环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基等。
术语“杂烷基”指上述定义的烷基基团其中一个或多个碳原子被O、S或N原子取代。
术语“杂环基”或“杂环基团”是指成环的原子中除碳原子外还含有一个或多个氮原子、氧原子和硫原子的3-12元环的基团。“杂环基”或“杂环基团”是单环、双环、螺环或桥环；所述“杂环基”或“杂环基团”可任选在一个或多个位置的碳或氮上被取代；
术语“杂环基烷基”是指通过与杂环基相连的烷基再与分子其他部分连接的基团。
术语“芳基”是指含1-3个芳环组成的基团,可任选被取代；
术语“芳烷基”是指与烷基共价连接的芳基基团，可独立任选被取代；示例性芳烷基基团是(C6-C10)芳基(C1-C5)烷基；
术语“杂芳基”是指由5-14个环原子组成的单环、双环或三环基团；这些由“杂芳基”组成的单环、双环或三环基团在芳杂环化合物的环状阵列中共用6个或10个或14个π电子；组成环的原子中，除碳原子外还含有1个或多个选自N、O和S中的杂原子；
术语“杂芳基烷基”基团指通过与杂芳基相连的烷基再与分子其他部分连接的基团，其中杂芳基烷基基团的每一个均可被独立地任选被取代。
药物组合物
本发明的化合物(包括消旋体、对映异构体、立体异构体、氘代物)或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、前药及其在药学上可接受的载体或辅剂制备成有利于给药的药物组合物。
本发明的药物组合物，其包括本发明的抑制ALK活性的化合物和药学上可接受的赋形剂或载体，其给药途径可以为：1)口服：例如片剂、胶囊等；2)注射：例如静脉注射、皮下注射、肌肉注射、眼球注射等；3)直肠内：例如栓剂、凝胶剂等；4)鼻孔吸入：例如喷雾剂、气雾剂等；还可以脂质体、缓释技术、控释技术等药物释放系体系给药。
“药学上可接受的盐”是指能维持本发明化合物所具有的生物活性而不表现出不希望的毒理学效应的盐。其示例性例子包括但不限于与盐酸，硫酸，磷酸、硝酸、氢漠酸等无机酸形成的酸加成盐，以及与乙酸、苹果酸、酒石酸、草酸、琥珀酸、苯甲酸、鞣酸、藻酸、聚谷氨酸等有机酸形成的盐；本发明化合物还能以药学上可接受的季铵盐给药。
本文中的药物组合物除了含本发明化合物或其在药学上可接受的盐外，还含有缓冲剂、稀释剂、填充剂、稳定剂、增溶剂等本领域公开的物质。
本发明化合物组成的药物组合物的剂型采用医药工业中常用的方法制备，包括但不限于混合、溶解、制粒、研磨、乳化、糖衣和冷冻干燥等。
“药学上可接受的载体”是指药物组合物中的非活性成分，包括但不限于磷酸钙、碳酸钙、乳糖或甘露醇等各种糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、丙烯酸聚合物、甲基丙烯酸聚合物、凝胶、乙二醇、蓖麻油、芝麻油、玉米油、花生油等。
本发明提供的含抑制ALK活性的化合物和药物组合物及其制备的方法可用于治疗ALK基因的突变、基因扩增以及基因重排从而引发的肿瘤及其相关疾病。
本发明的化合物和其药学上可接受的盐，以及含这样化合物和盐的药物组合物可与其它抗肿瘤药物或方法如放疗或化疗联合应用。
制备方法：通式I化合物
在反应方案I中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11如本文所定义。中间体碘化物1在钯试剂和Xantphos等存在下与膦氧化物反应，得到氧化膦2；2与二氯嘧啶在合适的碱(如NaOH)和溶剂(如DMF)存在下，发生亲核取代反应得到3；3与溴取代的苯胺在酸存在下加热发生亲核取代反应生成4；在钯试剂，P(OMe-Ph)3，适合的碱(如Et3N)和溶剂(如CH3CN)存在以及加热条件下，乙烯基和溴发生Heck偶联反应得到大环化合物5；5加氢还原得到终产物I。
制备方法：通式II化合物
在反应方案II中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12如本文所定义。中间体碘化物1在钯试剂和Xantphos等存在下与膦氧化物反应，得到氧化膦2；2与二氯嘧啶在合适的碱(如NaOH)和溶剂(如DMF)存在下，发生亲核取代反应得到3；3与溴取代的苯并呋喃发生亲核取代在酸存在下加热发生亲核取代反应生成4；在钯试剂，P(OMe-Ph)3，适合的碱(如Et3N)和溶剂(如CH3CN)存在以及加热条件下，乙烯基和溴发生Heck偶联反应得到大环化合物5；5加氢还原得到终产物II。
实施例1
10-二甲基氧膦基-6-氯-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-19-甲氧基-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯；MS(ESI)m/z 610.27[M+H]+。
步骤1：将浓硝酸(25.9mmol)冷却至0℃，缓慢加入化合物1(1g，4.31mmol)，继续搅拌4h，将反应液倒入冰水中，过滤固体，水洗，在真空下用五氧化二磷干燥，粗产品重结晶(0.45g，37％)，LC/MS:278。
步骤2：将甲基三苯基溴化膦(7.22mmol)溶于10mlTHF中，降温至-78℃，缓慢加入正丁基锂(5.78mmol)，室温反应30min。反应液降温至-78℃，将化合物2(3.61mmol)溶于4mlTHF中，缓慢滴加如上述反应液，室温继续反应。TLC监测。反应完成后，过滤，反应液浓缩，残渣用二氯甲烷萃取，有机相合并，并用Na2CO3溶液洗涤，饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，经硅胶柱纯化得化合物3(290mg，29％)，LC/MS：275.3。
步骤3：向化合物3(2.3g，8.36mmol)的THF(30ml)溶液中，加入60ml冰醋酸，缓慢添加Fe(3.04g，54mmol)，混合物在35℃反应过夜，TLC监测反应完成，反应物过滤，滤液浓缩，EA溶解残余物，饱和NaHCO3洗涤。有机相用饱和食盐水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤浓缩，得到化合物4粗产品，直接投入下一步反应。
步骤4：将化合物4(980mg，4mmol)和二甲基氧化膦(371.4mg，4.76mmol)溶于10mlDMF，依次加入磷酸钾(917mg，4.32mmol)，醋酸钯(45mg，200umol)，xantphos(115.7mg，200μmol)，反应混合物在N2保护下，120℃反应6h，TLC监测反应。反应完成后，冷却，反应混合物硅藻土过滤，固体用乙酸乙酯洗涤(10ml×2)，收集滤液，浓缩得到粗产物，经硅胶柱纯化得化合物5(458mg，58％)LC/MS:196。
步骤5：向化合物5(458mg，2.35mmol)和2,4,5-三氯嘧啶(452mg，2.46mmol)的DMF(5ml)混合物中，滴加DIPEA(776μl，4.69mmol)。70℃反应过夜，TLC监测反应完成。反应混合物用水稀释，EA萃取(40ml×3)。合并有机相，饱和食盐水洗，无水NaSO4干燥，过滤浓缩，粗产物经硅胶柱纯化，得到中间体化合物A(520mg，64％)LC/MS:343。
步骤6：将化合物6(1.32g，5.28mmol)、1-甲基-4-(4-哌啶基)哌嗪(967.7mg，5.28mmol)、K2CO3(730mg，5.28mmol)溶于10mlDMF溶液中，室温反应3h，TLC监测反应完成后，加水，EA萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，粗产品经硅胶柱纯化得化合物7(1.85g，85％)，LC/MS:414。
步骤7：化合物1B的制备参考第三步，产率达到83％，LC/MS：384。
步骤8：向化合物1A(2.36g，6.9mmol)和化合物1B(2.91g，7.59mmol)的乙二醇甲醚溶液(40ml)中，滴加甲基磺酸(581μl，8.97mmol)，105℃反应4h。TLC监测反应完成后，反应液浓缩，重新溶解于DMSO溶液中，制备液相纯化，所得化合物8溶于EA中，饱和NaHCO3洗涤，有机相无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，残余物用冷乙腈溶液打浆，过滤，少量乙腈洗涤，得到化合物8(1.23g，26％)，LC/MS：690。
步骤9：将醋酸钯(10mg，45.7umol)溶于5ml乙腈，分次加入三(邻甲基苯基)磷(86mg，283μmol)，N2保护下室温反应15min。加入化合物8(150mg，217.7μmol)，三乙胺(454μl，3.27mmol)，于微波反应仪中120℃，反应20min。经固相萃取柱过滤，分别用乙腈、甲醇洗脱后，用含有2MNH3的甲醇溶液洗脱，收集后面的甲醇溶液浓缩，乙腈洗涤，得到化合物9(52mg，39％)，LC/MS:609。
步骤10：向化合物9(156mg，1.24mmol)的吡啶(10ml)溶液中加入偶氮二甲酰胺二钾盐(1.15g，5.9mmol)，缓慢滴加冰醋酸(837μl，14.62mmol)，反应混合液室温反应72h，TLC监测反应，加入偶氮二甲酰胺二钾盐(0.57g)，冰醋酸(400μl)，升温至35℃继续反应36h，TLC监测反应完成，加水淬灭，过滤收集固体，经制备液相纯化的终产物实施例1(33mg，21％)LC/MS:611。
实施例2
19-甲氧基-10-二甲基氧膦基-6-氯-17-(4-甲基哌嗪-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例2化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-甲基-4-(4-哌啶基)哌嗪由等摩尔浓度的1-甲基哌嗪替代。MS(ESI)m/z527.20[M+H]+。
实施例3
10-二甲基氧膦基-6-氯-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例3化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-溴-2-氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-溴-1-氟-4-硝基苯替代。MS(ESI)m/z 580.26[M+H]+。
实施例4
10-二甲基氧膦基-6-氯-17-(4-甲基哌嗪-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例4化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-甲基-4-(4-哌啶基)哌嗪由等摩尔浓度的1-甲基哌嗪替代；步骤6中的1-溴-2-氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-溴-1-氟-4-硝基苯替代。MS(ESI)m/z497.19[M+H]+。
实施例5
19-甲氧基-10-二甲基氧膦基-6-氟-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21)，10,12,16,18-壬烯。
实施例5化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯-5-氟嘧啶替代。MS(ESI)m/z594.30[M+H]+。
实施例6
19-甲氧基-6-氰基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)--2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例6化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯嘧啶-5-碳腈替代。MS(ESI)m/z601.32[M+H]+。
实施例7
6-羟基-19-甲氧基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例7化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯嘧啶-5-醇替代。MS(ESI)m/z592.31[M+H]+。
实施例8
6-氨基-19-甲氧基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例8化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯嘧啶-5-胺替代。MS(ESI)m/z591.32[M+H]+。
实施例9
6，19-二甲氧基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例9化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯-5-甲氧基嘧啶替代。MS(ESI)m/z606.32[M+H]+。
实施例10
6-氨基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例10化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯嘧啶-5-胺替代；其中步骤6中的1-溴-2-氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-溴-1-氟-4-硝基苯替代。MS(ESI)m/z 561.31[M+H]+。
实施例11
6-甲基-19-甲氧基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例11化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯-5-甲基嘧啶替代。MS(ESI)m/z590.33[M+H]+。
实施例12
5-甲基-6-氨基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例12化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-溴-2-氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-溴-1-氟-4-硝基苯替代；其中步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯-6-甲基嘧啶-5-胺。MS(ESI)m/z 575.33[M+H]+。
实施例13
6-甲基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例13化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯-5-甲基嘧啶替代；步骤6中的1-溴-2氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-溴-1-氟-4-硝基苯替代，反应由室温改成100℃反应24h。MS(ESI)m/z560.32[M+H]+。
实施例14
5-甲基-6-氨基-19-甲氧基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例14化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯-6-甲基嘧啶-5-胺替代。MS(ESI)m/z605.34[M+H]+。
实施列15
5-甲基-10-二甲基氧膦基-6-氯-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22)4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例15化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-溴-2氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-溴-1-氟-4-硝基苯替代；步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4,5-三氯-6-甲基嘧啶替代。MS(ESI)m/z594.28[M+H]+。
实施列16
5-甲基-10-二甲基氧膦基-6-氟-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例16化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-溴-2-氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-溴-1-氟-4-硝基苯替代；步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯-5-氟-6-甲基嘧啶替代。MS(ESI)m/z 578/.31[M+H]+。
实施例17
6-甲基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基-1,4，5,6-,四氢-1,2,4-三嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21)，10,12,16,18-壬烯。
实施例17化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-溴-2氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-溴-1-氟-4-硝基苯替代；步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯-5-甲基嘧啶替代；步骤6中的1-甲基-4-(4-哌啶基)哌嗪由等摩尔浓度的4-甲基-1-(哌啶-4-基)-1,4,5,6-四氢-1,2,4-三嗪替代。MS(ESI)m/z 559.30[M+H]+。
实施例18
5-甲基-19-甲氧基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例18化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯-6-甲基嘧啶替代；MS(ESI)m/z590.33[M+H]+。
实施例19
5-甲基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例19化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-溴-2氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-溴-1-氟-4-硝基苯替代；步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯-6-甲基嘧啶替代；MS(ESI)m/z560.32[M+H]+。
实施例20
10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20)，3(22)，4,6,9(21)，10,12,16,18-壬烯。
实施例20化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯嘧啶替代；步骤6中的1-溴-2氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-溴-1-氟-4-硝基苯替代，反应由室温改成100℃反应24h。MS(ESI)m/z 546.30[M+H]+。
实施例21
10-二甲基氧膦基-6-氯-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-19-(2-甲基-2,3-二氢苯并呋喃)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20)，3(22)，4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例21化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-溴-2氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-甲基-4-氟-5-溴-7-硝基-2,3-二氢苯并呋喃替代；1-甲基-4-(4-哌啶基)哌嗪由等摩尔浓度的N-甲基哌嗪替代；MS(ESI)m/z 553.22[M+H]+。
实施例22
10-二甲基氧膦基-6-氯-17-(1-甲基哌啶-4-基)-19-(2-甲基-2,3-二氢苯并呋喃)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例22化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-溴-2氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-甲基-4-氟-5-溴-7-硝基-2,3-二氢苯并呋喃替代；MS(ESI)m/z 552.22[M+H]+。
实施例23
10-二甲基氧膦基-6-氯-17-(4-甲基哌嗪-1-基)-19-(2-甲基-2,3-二氢苯并呋喃)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例23化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-溴-2氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-甲基-4-氟-5-溴-7-硝基-2,3-二氢苯并呋喃替代；步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯-5-甲基嘧啶替代。MS(ESI)m/z533.27[M+H]+。
实施例24
19-氨基-10-二甲基氧膦基-6-氯-17-(4-甲基哌嗪-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例24化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-溴-2-氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的4-溴-5-氟-2-硝基苯胺替代；步骤6中的1-甲基-4-(4-哌啶基)哌嗪由等摩尔浓度的1-甲基哌嗪替代；MS(ESI)m/z 512.20[M+H]+。
实施例25
19-甲基-6-氯-10-二甲基氧膦基-17-(4-甲基哌嗪-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例25化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-溴-2-氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的1-溴-2-氟-4-甲基-5-硝基苯替代；步骤6中的1-甲基-4-(4-哌啶基)哌嗪由等摩尔浓度的1-甲基哌嗪替代；MS(ESI)m/z 511.21[M+H]+。
实施例26
19-甲氧基-10-二甲基氧膦基-6-氯17-(4-甲基-1,4-二氮卓-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例26化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-甲基-4-(4-哌啶基)哌嗪由等摩尔浓度的1-甲基-1,4-二氮卓替代；MS(ESI)m/z 575.33[M+H]+。
实施例27
19-甲基-6-氨基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21),10,12,16,18-壬烯。
实施例27化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤6中的1-溴-2-氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的1-溴-2-氟-4-甲基-5-硝基苯替代；步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯嘧啶-5-胺替代；MS(ESI)m/z 575.33[M+H]+。
实施例28
6-甲基-10-二甲基氧膦基-17-(4-(4-甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-1-基)哌啶-1-基)-2,4,8,22-氮杂四环-[14.3.1.13,7.19,13]22环-1(20),3(22),4,6,9(21)，10,12,16,18-壬烯。
实施例28化合物的制备参考实施例1中步骤1至步骤10，其中步骤5中的2,4,5-三氯嘧啶由等摩尔浓度的2,4-二氯-5-甲基嘧啶替代；步骤6中的1-溴-2-氟-4-甲氧基-5-硝基苯由等摩尔浓度的2-溴-1-氟-4-硝基苯替代；步骤6中的4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶由等摩尔浓度的4-(4-甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-1-基)哌啶替代。MS(ESI)m/z 545.28[M+H]+。
实验例1：化合物抑制ALK活性测定
采用酶联免疫吸附试验测定实例化合物抑制ALK受体酪氨酸激酶活性。实验前将聚合酶(Glu：Tyr，4:1)作为底物包被于96孔板中。每孔加入50ul的激酶反应缓冲液(50mmol/L HEPES、50mmol/L MgCl2、0.5mmol/L MnC12、0.2mmol/L Na3VO4和1mmol/L DTT)，ATP溶液终浓度为l0umol/L。
用DMSO溶液将实施例1、5、11、13和21提供的化合物稀释成不同浓度，分别加入各反应孔中。然后将96孔板在37℃孵育1小时，用磷酸缓冲液洗涤96孔板三次；各反应孔加入用BSA T-PBS稀释的抗ALK磷酸酪氨酸抗体。然后在37℃孵育半小时，洗涤96孔板三次；每孔加入二抗后，再将96孔板在37℃下孵育半小时，并洗涤3次后进行显色反应。显色反应终止后，在490nm处测定吸光度值。根据吸光度值计算出激酶抑制率(％)并计算IC50值。
按照上述方法，另外检测所述化合物抑制ALK L1196M突变激酶和ALK R1275Q突变激酶的活性。结果见表1。
表1：化合物抑制ALK激酶及其突变激酶活性的活性
表1结果表明本发明提供的化合物能够有效抑制ALK激酶以及ALK L1196M突变激酶和ALK R1275Q突变激酶的活性。
实验例2：化合物抑制细胞增殖的活性测定
本实验例采用Luminometer发光法测定示例性化合物对人间变性大细胞淋巴瘤细胞Karpars299和人非小细胞肺癌细胞H358细胞的抗增殖活性。
实验试剂和仪器：RPMI 1640培养基、DMEM细胞培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化液、DMSO、青霉素-链霉素、Cell Titer-Gio检测试剂盒。Promega微孔板检测仪、细胞培养瓶、细胞培养微孔板(96或384孔)、CO2恒温培养箱。
细胞培养：复苏液氮冻存的肿瘤细胞复苏，用含10％胎牛血清，10％青霉素-链霉素的细胞培养液培养细胞，待细胞生长至指数增长期，轻轻吹打收集细胞重悬于培养液中；按每孔5000-10000个细胞数接种细胞，置于恒温37℃、5％CO2、饱和湿度二氧化碳培养箱中过夜培养。
化合物作用72h后，从37℃孵箱中取出96孔板室温下放置30min以进行CTG检测，实验过程中不要晃动板。加入100μl CTG试剂，混匀2min，然后再室温下孵育10min，GloMax 96微孔板发光仪检测记录发光值(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay，Promega)，观察细胞活力。
将本发明的实施例1、5、11、13和21提供的化合物稀释成10个浓度梯度，分别加入细胞板的相应孔中，然后将细胞板放回二氧化碳培养箱中继续培养72小时。培养结束后，向细胞板中每孔加入Promega CellTiter-Glo试剂，室温下孵育10min，采用Promega微孔板检测仪检测发光信号，并计算IC50值。本发明化合物抗增殖活性的结果以A、B表示。其中，A表示0.001μM～1μM(含两个端点值)，B表示＞1μM。结果见表2。
表2：化合物抑制细胞增殖的作用
表2结果表明,本发明提供的化合物能够有效抑制Karpars 299细胞和非小细胞肺癌H358细胞的增殖。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种钌(II)配合物及其在抗骨肉瘤药物中的应用