培养雨生红球藻生产天然虾青素的方法
阅读说明：本技术 培养雨生红球藻生产天然虾青素的方法 (Method for producing natural astaxanthin by culturing haematococcus pluvialis ) 是由 默罕默德·伊利亚斯·巴沙·卡奇 李健 于 2021-09-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及培养雨生红球藻生产天然虾青素的方法,属于微藻生物技术领域。培养雨生红球藻生产天然虾青素的方法,包括以下两个步骤：A、采用兼养培养模式在室内光生物反应器中培养雨生红球藻,生产红球藻绿色细胞种液；B、将步骤A培养的细胞种液经稀释后,接种到室外以自然光为光源的培养设施中,自养培养,诱导雨生红球藻生产虾青素。本发明能够使用低成本的室外开放式跑道培养池作为红球藻虾青素的主要生产设施,从而能够降低生产设施的固定资产投资,同时室内兼养培养的微藻种液具有生产效率高和品质高的优势,和传统的光自养两步法相比能够进一步降低红球藻虾青素的生产成本。(The invention relates to a method for producing natural astaxanthin by culturing haematococcus pluvialis, belonging to the technical field of microalgae biology. The method for producing natural astaxanthin by cultivating haematococcus pluvialis comprises the following two steps: A. culturing haematococcus pluvialis in an indoor photobioreactor in a mixotrophic culture mode to produce haematococcus pluvialis green cell liquid; B. and D, diluting the cell culture solution cultured in the step A, inoculating the diluted cell culture solution into an outdoor culture facility taking natural light as a light source, performing autotrophic culture, and inducing haematococcus pluvialis to produce astaxanthin. The method can use the outdoor open runway culture pond with low cost as a main production facility of the haematococcus pluvialis astaxanthin, thereby reducing the fixed asset investment of the production facility, simultaneously, the microalgae liquid cultured by indoor mixotrophic culture has the advantages of high production efficiency and high quality, and compared with the traditional photoautotrophic two-step method, the method can further reduce the production cost of the haematococcus pluvialis astaxanthin.)
技术领域
本发明涉及培养雨生红球藻生产天然虾青素的方法，属于微藻生物技术领域。
背景技术
虾青素(Astaxanthin)，是一种常见于水生动物体内的一种类胡罗卜素。其化学名称为：3,3’-二羟基-β,β’-胡罗卜素-4,4’-二酮，分子式为C40H52O4，分子量为596.86。虾青素分子中间是共轭双键长碳链，两端分别含有一个羟基和酮基，属于酮式类胡罗卜素，其分子结构式下所示：
由于其分子共轭双键吸收蓝光，因此虾青素呈现红色。由于含有长碳链，虾青素具有脂溶性，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于丙酮等常见有机溶剂。由于含有共轭不饱和双键系统，虾青素容易被氧化。
虾青素是目前能够大规模生产的最强的生物抗氧化剂，具有多种有益的生物学效应，被广泛用于保健食品原料、化妆品原料和饲料添加剂等，目前原材料市场规模8亿美元以上，并且高速增长。据最新市场调研报告预计在2025年，虾青素的市场会超过25亿美元。
虾青素可以用化工合成的方法生产，也可以用生物合成的方法生产。化工合成的虾青素分子结构和自然界的虾青素分子手性结构有所不同，而生物合成虾青素和自然界的分析结果完全一致，所以生物合成虾青素也被称为天然虾青素，用以区别化工合成的虾青素。
由于化工合成的虾青素有潜在的健康和环境危害，目前仅被允许用于水产饲料添加剂。天然虾青素不但没有健康和环境的危害，而且生物学效应远强于化工虾青素。天然虾青素不但可以用于水产饲料添加剂，还可以用于保教品原料、化妆品原料和药物原料等。
由于天然虾青素的巨大市场，从上个世纪80年代开始国际上就有多家公司开发天然虾青素的生产技术。上个世纪末期，有几家公司通过培养雨生红球藻实现了天然虾青素的大规模生产。
雨生红球藻是一种广泛分布于世界各地的淡水微型藻类，具有特殊的生物学习性。这种藻类在外界环境适宜的情况下能够快速分裂和生长，呈现绿色。外界环境不适宜的情况下，红球藻停止分裂，在体内开始大量积累虾青素，呈现红色。
红球藻可以用三种培养方式培养：一是给红球藻提供无机碳源和矿物质盐类营养成分，红球藻在光照条件进行光合作用生长，这种培养方式称为自养培养；二是给红球藻提供有机碳源和其它营养成分，红球藻在没有光照的条件下吸收利用有机碳源生长，这种培养方式称为异养培养；三是给红球藻提供有机碳源和其它营养成分，红球藻在有光照的条件既进行光合作用又吸收利用有机碳源生长，这种培养方式称为兼养培养。
这三种培养方式可以分别采用两种模式，即连续培养和批式培养。连续培养是向相应的培养设施中连续加入培养基，连续收获培养液。批式培养一次性向培养设施中加入培养基，一次性收获培养液。连续培养和批式培养相比虽然有不用经常清洗和组装培养设施的优点，但是对培养过程的无菌操作要求比较高，在室外培养的条件下很难实现。
大多数红球藻培养生产虾青素的工艺方法根据其生物学特性分为两步；第一步提供适宜的生产条件，让红球藻快速分裂和生长，积累生物质，提供微藻种液，成为绿色培养期；第二部改变红球藻的培养环境，胁迫红球藻停止分裂，开始积累虾青素，称为红色培养期。
早期实现红球藻培养生产虾青素的企业主要有三个，分别采用不同的专利技术。
一是美国MeraPharma公司，采用的是室外管道生物反应器和室外开放式跑道池相结合的培养专利技术(LEONARD A B P,HUNTLEY M E,NIILER P P,et al.Method ofcontrol Haematococcus spp growth process:WO/1998/000559[P].1998.)，该技术分首先在室外管道反应器内批式自养培养红球藻生产种液，然后在室外开放式跑道池内批式自养培养红球藻生产虾青素。
二是以色列Algatech公司，采用室外玻璃管道光生物反应器的培养专利技术(BOUSSIBA S,VONSHAK A,COHEN Z,et al.Procedure for large-scale production ofastaxanthin from Haematococcus.U.S.Patent No.6,022,701[P].2000-02-08.)，该技术首先在室外玻璃管道生物反应器内批式自养培养生产红球藻种液，让在相同类型的室外玻璃管道生物反应器批式自养培养红球藻生产虾青素。
三是印度ParryPharma公司采用的室外跑道池技术培养，利用红球藻袍子提供种液的专利技术(SWATI S T,SWAMINATHAN K,NAGARA J B.Process to produceastaxanthin from Haematococcus biomass:US,WO/2003/027267[P].2003.)，该就是首先利用红球藻袍子在室内自养培养生产红球藻种液，然后和MeraPharma公司一样在室外开放式跑道池内批式自养培养红球藻生产虾青素。
以上专利技术都各自在上个世纪末实现了产业化，拥有这些专利技术的公司也在一定程度上取得了商业的成功。但是直到今天，培养红球藻生产虾青素的成本依然很高，远远高于化工虾青素的成本(LI J,ZHU D,NIU J,et al.An economic assessment ofastaxanthin production by large scale cultivation of Haematococcus pluvialis[J].Biotechnology Advances,2011,29(6):568-74.)。
红球藻虾青素成本高的主要原因是用于红球藻培养的生产设施投资大，运行成本高。微藻培养的生产设施主要分为两类，一类是开放式跑道培养池；一类是封闭式光生物反应器。开放式跑道池造价和运行成本低，但是用于红球藻培养很容易受到外来生物污染而导致培养失败。封闭式光生物反应器能够很好解决外来生物污染的问题，但是造价和运行成本非常高。
印度ParryPharma公司的专利技术采用低成本的开放式跑道池作为主要生产设施，在早期取得了一定成本的成功，但是其红球藻种液生产技术很不成熟，生产工艺长期不稳定，最终导致商业失败。
以色列Algatech公司的专利技术采用室外玻璃管道光生物反应器分别用于种液的培养和虾青素的积累，能够实现稳定生产，但由于玻璃管道反应器的建造和运行成本都很高，所有天然虾青素的生产成本居高不下。
美国MeraPharma公司虽然采用开放式跑道池作为主要生产设施，但是红球藻的种液生产还是要在造价和运行成本高昂的室外光生物反应器中进行，所以总的生产成本还是很高。该公司技术能够得以产业化的一个重要原因是因为其生产地址位于美国夏威夷的国家能源实验室附近，能够获得廉价的深海冷却水，降低了室外光生物反应器的温度控制成本。这一便利条件，在世界其它地区都不具备。
近些年，红球藻培养生产天然虾青素的技术得到持续的关注，获得了以一些进展，又有一些新的专利申请和授权(Xin Li，Xiaoqian Wang，Chuanlan Dun，Shasha Yi，Zhengquan Gao，Chaowen Xiao,Spiros N.Agathos，Guangce Wang，and Jian Li，Biotechnological Production of Astaxanthin from Microalga Haematococcuspluvias.Biotechnology Advances 43:107602(2020))。
和本发明相关的是专利号为201210264946.X的中国发明专利。该专利提供了一种培养红球藻生产虾青素的方法。此方法的特点是使用发酵设备异养培养红球藻绿色细胞作为种液，然后在开放式跑道池或室外光生物反应器中用自然光诱导自养培养红球藻生产虾青素。这种方法避免在培养红球藻绿色细胞过程中使用昂贵的光生物反应器设备，从而有可能大幅降低红球藻的种液培养成本。
上述方法虽然有降低红球藻虾青素生产成本的潜力，但是还存在一些在技术上难以解决的问题。首先，异养培养的红球藻直接光诱导会导致大量细胞死亡，需要一个额外的适应过程，这无疑会增加生产过程成本(Zhang,Z.,Wang,B.,Hu,Q.,Sommerfeld,M.,Li,Y.,and Han,D.(2016).A new paradigm for producing astaxanthin from theunicellular green alga Haematococcus pluvialis.Biotechnol.Bioeng.113,2088-2099.)。其次，异养培养的红球藻细胞叶绿素含量大幅降低，导致后期光诱导过程红球藻积累虾青素的能力严重下降，从而降低红球藻生产虾青素的效率(Fang,L.,Zhang,J.,Fei,Z.,and Wan,M.(2019).Chlorophyll as key indicator to evaluate astaxanthinaccumulation ability of Haematococcus pluvialis.Bioresour.Bioprocess.6,1-7.)。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种室内兼养培养和室外自养培养相结合的红球藻生产虾青素的新方法。
培养雨生红球藻生产天然虾青素的方法，包括以下两个步骤：
A、采用兼养培养模式在室内光生物反应器中培养雨生红球藻，生产红球藻绿色细胞种液；
B、将步骤A培养的细胞种液经稀释后，接种到室外以自然光为光源的培养设施中，自养培养，诱导雨生红球藻生产虾青素。
在一种实施方式中，步骤A中，所述光生物反应器以LED为光源，其特征光谱为白色或红色，光量子强度为20～160μmol·m-2·s-1。
在一种实施方式中，步骤A中，所述兼养培养为连续兼养培养；优选的，连续兼养培养的稀释率在0.2～0.8d-1。
在一种实施方式中，步骤A中，培养所用的培养基为改进的BBM培养基，所述改进的BBM培养基为：以BBM培养基为基础培养基，调整其中硝酸钠的浓度为0.1～1.0g·L-1，再加入乙酸盐，使乙酸盐的浓度为1～10mmol/L，其余组分含量不变。
在一种实施方式中，步骤A中，雨生红球藻连续兼养培养的温度为20～25℃。
在一种实施方式中，步骤A中，连续兼养培养的通气率为0.05～0.5vvm，通入气体为二氧化碳和空气的混合气体，所述二氧化碳与空气之比为1～5％。
在一种实施方式中，步骤B中，稀释的倍数为2～6。
在一种实施方式中，步骤B中，自养培养的培养基为碳酸盐溶液，碳酸盐浓度在0.1～1.0mmol/L；培养基的pH值为6.0～8.0；优选的，通过通入CO2来控制培养基的pH值。
在一种实施方式中，步骤B中，所述以自然光为光源的培养设施是室外开放式跑道培养池；优选的，搅拌转轮转速为15～30rpm。
在一种实施方式中，步骤B中，自养培养的周期为7～14天。
本发明的有益效果：
1、本发明采用以自然光为光源的室外开放式跑道培养池为红球藻积累虾青素的主要生产设施，设备造价和运行成本低，从而能够降低红球藻虾青素的生产成本。
2、本发明采用兼养培养的方法为室外跑道池提供红球藻种液，能够保证生产工艺稳定，而且这种方法生产的绿色红球藻种液在转入红色培养阶段是不需要适应过程，能够减少过程成本。本发明方法生产的这种藻液细胞的叶绿素远高于异养培养的红球藻细胞，和自养培养的红球藻叶绿素含量水平类似，所以在转入红色培养阶段时细胞的光合作用和积累虾青素的能力得到保障。
3、本发明采用在室内以LED为光源的光生物反应器为红球藻种液的培养设施，容易实现反应器的温度控制和无菌操作，能够保证用连续兼养的方法稳定地为室外跑道池提供高质量的红球藻绿色种液，从而进一步降低藻液生产成本。
附图说明
图1为本发明所述的培养方法示意图；
图2为实施例与对照例中红球藻在反应池中生物量增长和虾青素积累变化图。
具体实施方式
培养雨生红球藻生产天然虾青素的方法，包括以下两个步骤：
A、采用兼养培养模式在室内光生物反应器中培养雨生红球藻，生产红球藻绿色细胞种液；
B、将步骤A培养的细胞种液经稀释后，接种到室外以自然光为光源的培养设施中，自养培养，诱导雨生红球藻生产虾青素。
在一种实施方式中，步骤A中，所述光生物反应器以LED为光源，其特征光谱为白色或红色，光量子强度为20～160μmol·m-2·s-1。
其中，光量子强度需要控制在20～160μmol·m-2·s-1，如果光强太弱，相当于没有光；光强太强，会导致红球藻变红，停止分裂从而影响绿色生长。
在一种实施方式中，步骤A中，所述兼养培养为连续兼养培养；优选的，连续兼养培养的稀释率在0.2～0.8d-1。
在一种实施方式中，步骤A中，培养所用的培养基为改进的BBM培养基，所述改进的BBM培养基为：以BBM培养基为基础培养基，调整硝酸钠的浓度为0.1～1.0g·L-1，再加入乙酸盐，使乙酸盐的浓度为1～10mmol/L，其余组分含量不变。
所述使用的基础培养基BBM培养基的组分为：NaNO3 250mg、KH2PO4 175mg、K2HPO475mg、MgSO4·7H2O 75mg、CaCl2·2H2O 25mg、NaCl 25mg、EDTA 50mg、KOH 31mg、FeSO4·7H2O4.98mg、H3BO3 11.42mg、ZnSO4·7H2O 8.82mg、MnCl2 1.44mg、MoO3 0.71mg、CuSO4·5H2O1.57mg、Co(NO3)2·6H2O 0.49mg，加蒸馏水补足1000mL，可以在以上组份中加入15～20g琼脂，并蒸馏水补足1L制成固体培养基。
在一种具体的实施方式中，所述乙酸盐为乙酸钠。
其中，在连续培养过程中，硝酸钠的浓度控制为0.1～1.0g·L-1，调整硝酸钠浓度是为了调整室外培养时硝酸钠在跑道池里的浓度；硝酸钠浓度太低，会导致微藻生物量上不去，太高又会导致红球藻积累虾青素变慢。
在一种实施方式中，步骤A中，雨生红球藻连续兼养培养的温度为20～25℃。
在一种实施方式中，步骤A中，连续兼养培养的通气率为0.05～0.5vvm，通入气体为二氧化碳和空气的混合气体，所述二氧化碳与空气之比为1～5％。
其中，本发明采用通入二氧化碳来补充无机碳源，避免了无机盐类碳源如碳酸氢钠等随着二氧化碳的消耗，影响培养基的pH值，从而影响了绿色细胞种液的生长。通入空气一方面是为了去除光合作用产生的氧气，另一方面是为了使藻细胞处于均匀悬浮状态，避免沉淀。
二氧化碳与空气之比控制为1～5％，如果二氧化碳浓度高，首先是浪费，其次会降低培养液的pH值，pH值降低，同样也会影响绿色细胞种液的生长。
在一种实施方式中，步骤B中，稀释的倍数为2～6。
在一种实施方式中，步骤B中，自养培养的培养基为碳酸盐溶液，碳酸盐浓度在0.1～1.0mmol/L；培养基的pH值为6.0～8.0；优选的，通过通入CO2来控制培养基的pH值。
其中，室外自养培养液也可以为碳酸盐和氯化盐的混合溶液。
在一种实施方式中，步骤B中，所述以自然光为光源的培养设施是室外开放式跑道培养池；优选的，搅拌转轮转速为15～30rpm。
在一种实施方式中，步骤B中，自养培养的周期为7～14天。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
测量方法
1、微藻生物量测量使用玻璃纤维滤膜过滤干燥的方法。
(1)将先标记好的直径3cm微孔直径5μm的玻璃纤维滤膜在鼓风干燥机中75℃干燥一天，然后取出干燥后的滤纸迅速用万分精确度的电子天平称重，稳定后读出玻璃纤维滤膜的质量M1；
(2)称取一定体积的藻液V(一般量用50～500mL)，用称重过的玻璃纤维膜抽滤并用去离子水冲洗一次。待抽滤结束后，将载有生物质的膜片放入电热干燥箱干燥24小时；
(3)干燥一天后取出装有滤纸的培养皿，迅速进行称重，待电子天平读数稳定后记录质量数据M2。
(4)藻液中的红球藻生物量浓度以下公式计算：
DW＝(M2-M1)/V；
其中DW为雨生红球藻细胞干重浓度(单位为gL-1)，M1为滤纸质量(单位为g)，M2为滤纸与细胞总质量(单位为g)，V为抽样体积(单位为L)。
2、红球藻生物质中的虾青素含量和其它色素的测量方法参考下述科技文献中的方法，并稍加改进，所述科技文献为：Pan X.S.，Wang B.B.，Duan R.，et al.Enhancingastaxanthin accumulation in Xanthophyllomyces dendrorhous by a phytohormone：metabolomic and gene expression profiles[J].Microbial Biotechnology，2020，13(5)。
具体步骤为：
(1)首先称取15mL藻液在4000r/min的条件下离心10min，倒去上清液，保留细胞沉淀物。向细胞沉淀物中加入5mL预热过的DMSO，采用混合器摇匀使之呈均质状态，置于70℃数显恒温水浴锅中，提取色素10min。
(2)水浴结束后再次4000r/min离心10min，实现固液分层，收集提取的上清液待用。若下层沉淀物仍呈现绿色或红色，可重复多次DMSO提取、水浴、离心操作。
(3)使用紫外分光光度计取样测量提取液在波长480nm、530nm、650nm、666nm下的吸光度值，然后根据参考文献中的以下经验计算公式求取总类胡萝卜素(T-Car)、叶绿素a(Chl a)，叶绿素b(Chl b)、虾青素(asta)在提取液中的浓度。虾青素在提取液中的浓度乘以测量的稀释比例和提取液的总体积可以获得15mL样品中的虾青素总质量。
CChl a(mg·L-1)＝13.34×A666-4.85×A650：
CChl b(mg·L-1)＝24.58×A650-6.65×A666：
Casta(mg·L-1)＝(A530-0.0107)/0.148；
CT-Car(mg·L-1)＝(1000×A480-1.29×CChl a-53.76×Cchl b)/220。
(4)最后根据红球藻的质量浓度测量数据和虾青素在样品中的总质量计算出虾青素在红球藻生物质中的含量，用％表示。
实施例
使用中国科学院淡水藻种库的FACHB721无菌藻株作为实验培养的藻种，利用BBM培养基在室内扩大培养，接种到如图1中所示的10L培养瓶反应器中连续兼养培养生产绿色红球藻种液(一共2组，每组5瓶，共100L)。在10L培养瓶中的培养基是改进后的BBM培养基，其特征是减少硝酸钠到0.2gL-1，增加5mmol/L的乙酸钠作为有机碳源；光源为LED白光，光量子强度为160μmol·m-2·s-1；红球藻连续兼养培养的稀释率在0.5day-1，使用计量泵通过除菌滤器泵入兼养培养基；培养的温控制在23℃；使用压缩空气向每个反应器通入1L·min-1含有3％二氧化碳的无菌空气。经过大概7-8天的连续培养，反应器中藻液浓度达到平衡，经测量在0.42g·L-1。收集反应器的流出液40L以上作为室外接种的种液备用。
室外培养所用的小型开放式跑道培养池长约2.0m，宽约0.76m，深度约0.4m。为了红球藻在跑道池中的培养，首先加入约200L自来水和1L 10％消毒液消毒清洗，之后用自来水润洗两次。其次加入自来水160L，通入臭氧消毒30min，之后调节跑道池转轮的转速至20r/min，使其运转5小时以上。最后向培养池中加入4g NaHCO3和400g NaCl，待溶解之后开始校准pH控制器，将pH控制器接通二氧化碳的pH值设置为7.8，之后打开二氧化碳接通阀。
利用软管泵将室内种液40L泵至于室外跑道池内接种，每个跑道池共培养200L(160L水+40L藻液)，用防水马克笔在200L水位线做记号，以便每次取样时补充蒸发损失水分至水位线处。接种当天取样1L，之后每天在傍晚取样，连续取样14天为一个培养周期进行质量浓度测量和虾青素含量分析。
实施例数据见表1，表明本发明所述工艺方法能够有效培养红球藻在室外开放式跑道池中生产虾青素。
对比例
对比例实验条件和实施例所用的藻种和设施完全相同，两者在室外的培养条件也完全一致。但是在室内培养部分，区别仅在于对比例培养基中没有添加乙酸钠作为有机碳源。
实施例和对比例数据说明兼养培养的红球藻种液和自养培养的种液一样能够有效培养红球藻在室外生产虾青素，兼养培养的种液表现甚至好于自养培养的种液，如表1和图2所示，兼养种液生产的红球藻生物量积累和虾青素积累要略好于自养培养藻液。
表1
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