具体实施方式

本发明提供一种级联纳米酶及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在HIRI发生过程中，内源性和外源性一氧化氮(NO)均可缓解HIRI引起的损伤，基于NO的疗法在再生医学领域已表现出巨大的应用前景，然而现有的NO制剂的靶向性低、生物利用率低。此外，肝脏因缺血再灌注产生的氧化应激可引起活性氧(ROS)如H₂O₂、O^2·-、^·OH的过量表达，过量的ROS会造成细胞的损伤和死亡，因此，如何清除ROS减少氧化应激反应，是保护细胞免受损伤的关键，提供一种能够实现ROS清除与NO调节双重保护作用的药物具有重要意义。

基于此，本发明实施例提供一种级联纳米酶，其中，所述级联纳米酶包括金属有机骨架载体、与所述金属有机骨架载体结合的一氧化氮合成酶以及与所述金属有机骨架载体结合的铂纳米颗粒。

纳米酶经济、稳定，可在体内保持良好的反应活性，然而纳米酶的催化反应类型受限，对底物的选择性较低。相对而言，天然酶对底物选择性高、生物相容性好，催化反应选择范围更广，但是天然酶稳定性较差。因此，发明人深入研究了纳米酶与天然酶的特点，进行整合与优势互补，又因金属有机骨架材料比表面积大、孔隙可调，不仅可为天然蛋白酶提供有效的保护作用，防止其在体内的失活和降解，而且可以促进分子之间的扩散和反应的进行，发明人进而以金属有机骨架材料为载体构建了纳米酶与天然酶为一体的理想型复合材料，使其分别发挥各自的优势，提高催化反应的反应活性和选择性，同时利用催化反应中反应物、产物之间的关系，建立级联反应，最终实现上述实施例中的级联纳米酶的构建。

本实施例中的级联纳米酶属于纳米尺寸，相比于小分子药物具有在肝脏被动积累的天然优势，可增加药物在肝脏的富集，具有较高的靶向性。铂纳米颗粒作为纳米酶具有优异的活性氧(ROS)清除能力，可催化活性氧产生氧气，产生的氧气在一氧化氮合成酶(iNOS，一种天然酶)的催化下与精氨酸反应原位产生NO，由于NO是原位生成的，所以提高了NO的生物利用度。因金属有机骨架载体的比表面积大、孔隙可调，其不仅可以为结合在其内部的iNOS提供有效的保护，防止其在体内失活和降解，而且可以促进分子之间的扩散和反应的进行，因为NO的合成具有氧气依赖的特点，将反应物(例如铂纳米颗粒催化ROS生成的氧气)与催化剂限定在金属有机骨架载体中，能够提升金属有机骨架载体中的氧气的含量，极大程度提高反应发生的几率，从而提高催化效率。因此，该级联纳米酶不仅提高了NO的靶向性和生物利用度，可同时实现ROS的清除和NO的调节，从而实现对肝脏缺血再灌注造成的损伤的有效干预。

发明人通过对疾病损伤机制的深入理解，利用纳米材料在肝脏组织的有效富集效应，以HIRI发生时产生的ROS为反应物，也即以ROS为刺激，触发催化反应，铂纳米颗粒催化ROS反应生成氧气，产生的氧气可在iNOS催化下进一步与精氨酸反应原位生成NO，完成整个级联反应，该级联反应过程中铂纳米颗粒催化ROS反应生成氧气实现了ROS的有效清除、产生的氧气可在iNOS催化下进一步与精氨酸反应原位生成NO，提高了NO的生物利用度。该级联反应过程可降低氧化应激损伤、抑制细胞凋亡及炎症因子的表达，最终实现对HIRI的有效干预。该活性氧激活的级联纳米酶不仅提高了NO的靶向性和生物利用度，而且其在肝脏部位富集效应触发级联反应，实现了ROS清除与NO调节的双重保护作用，为发展安全有效的HIRI治疗药物提供了新思路和临床应用前景。

在一种实施方式中，所述一氧化氮合成酶结合在所述金属有机骨架载体内部，所述铂纳米颗粒结合在所述金属有机骨架载体内部和所述金属有机骨架载体表面。

本实施方式中，所述金属有机骨架载体包括金属离子和有机配体，所述一氧化氮合成酶中的氨基与所述金属有机骨架载体中的金属离子之间形成配位作用，所述一氧化氮合成酶与所述金属有机骨架载体中的有机配体和金属离子存在电荷之间相互作用，也就是说所述一氧化氮合成酶具体是通过其氨基与所述金属有机骨架载体中的金属离子之间的配位作用和其与所述金属有机骨架载体中的有机配体和金属离子的电荷之间相互作用结合在所述金属有机骨架的内部，所述铂纳米颗粒具体是通过物理吸附的方式结合在所述金属有机骨架载体的内部和表面。由于铂纳米颗粒尺寸非常小，可以通过物理吸附的方式结合在所述金属有机骨架载体的内部和表面。所述一氧化氮合成酶结合在所述金属有机骨架载体内部更有利于其对iNOS提供有效的保护，防止其在体内的失活和降解。

在一种实施方式中，所述级联纳米酶的粒径为50-100nm。该粒径范围的级联纳米酶具有良好的分散性，可保证在肝脏部位有效聚集，提高后续产生的NO的靶向性，同时级联纳米酶中的金属有机骨架载体可在体内缓慢降解，保证催化反应的同时，能够在体内被有效地清除。

在一种实施方式中，所述铂纳米颗粒的粒径为1-10nm。铂纳米颗粒的尺寸小，比较面积大，活性位点多，作为纳米酶更有利于催化ROS产生氧气和水，从而更有利于ROS的清除，因此该粒径范围内的铂纳米粒子具有良好的模拟酶特性，此外该粒径范围内的铂纳米离子同时具有肾清除性。

在一种实施方式中，所述一氧化氮合成酶的质量占所述一氧化氮合成酶与所述金属有机骨架载体质量和的1％-10％。该比例可以保证所述一氧化氮合成酶的装载形成稳定级联纳米酶颗粒的同时，避免级联纳米酶的颗粒尺过大。此外，一氧化氮合成酶含量的增加易导致形成的复合材料颗粒聚集，分散性差。

在一种实施方式中，所述金属有机骨架中的金属的质量与所述铂纳米颗粒的质量的比为(1-10)：1。该比例范围内得到的级联纳米酶具有良好的分散性和稳定性，并且能同时保证iNOS和铂纳米颗粒的活性。

在一种实施方式中，所述金属有机骨架载体选自ZIF-8、ZIF-90中的一种，但不限于此。例如，本实施方式中的金属骨架载体可选自以锌离子、钴离子、锆离子、铜离子等中的一种作为金属离子、以2-甲基咪唑、2-醛基咪唑等中的一种作为有机配体进行配位反应得到的金属有机骨架材料。

在一种实施方式中，所述铂纳米颗粒的表面含有第一配体，所述第一配体选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物中的一种或多种，但不限于此。铂纳米颗粒表面的配体能够有效的稳定铂纳米颗粒，控制铂纳米颗粒具有很小的尺寸。铂纳米颗粒的尺寸小，比表面积大，活性位点多，作为纳米酶更有利于催化ROS产生氧气和水，从而更有利于ROS的清除。

在一种实施方式中，所述铂纳米颗粒表面含有的配体与所述铂纳米颗粒的质量比为(10-60):1。该比例可以使得表面配体更有效地稳定铂纳米颗粒，控制铂纳米颗粒具有很小的尺寸。

本发明实施例还提供一种本发明实施例所述的级联纳米酶的制备方法，其中，包括步骤：

S1、提供铂纳米颗粒水溶液；

S2、将第二配体和所述铂纳米颗粒水溶液进行混合；

S3、加入金属盐和一氧化氮合成酶的混合水溶液，反应后得到所述级联纳米酶。

本实施方式中，金属盐和一氧化氮合成酶的混合水溶液是通过将金属盐和一氧化氮合成酶加入到水中混合均匀制备得到，此过程中一氧化氮合成酶中的氨基官能团与金属离子之间存在正负电荷的相互吸引作用，然后将金属盐和一氧化氮合成酶的混合水溶液加入到第二配体和所述铂纳米颗粒水溶液的混合液中时，金属盐水溶液中的金属离子与第二配体发生配位反应，形成金属有机骨架载体，与此同时，一氧化氮合成酶与铂纳米颗粒被可原位包裹在金属有机骨架载体中，也即一氧化氮合成酶通过其氨基与金属离子的配位作用和其与金属有机骨架载体中的第二配体和金属离子的电荷之间相互作用结合在金属有机骨架内部，铂纳米颗粒通过物理吸附的方式与金属有机骨架载体结合，其不仅可以结合在金属有机骨架载体的内部还可以结合在金属有机骨架的表面。本实施方式中，采用共沉淀法制备得到了基于金属有机骨架载体的一氧化氮合成酶和铂纳米颗粒复合物，也即所述级联纳米酶。共沉淀方法的优势在于不限制蛋白质(例如iNOS)的尺寸，金属有机骨架载体在合成中条件温和，可将蛋白质等大分子包覆在其中而不会使蛋白质变性，同时蛋白质分子量不受金属有机骨架载体孔径大小的限制。

步骤S1中，提供铂纳米颗粒水溶液的具体步骤包括：采用硼氢化钠还原法制备得到铂纳米颗粒，然后将铂纳米颗粒配制成含有铂纳米颗粒的水溶液，即铂纳米颗粒水溶液。本发明中并不限于上述铂纳米颗粒的制备方法，其他能够制备得到铂纳米颗粒的制备方法也适用于本发明，例如可以是乙醇还原法等。

步骤S2中，第二配体和所述铂纳米颗粒混合，在金属有机骨架载体形成过程中铂颗粒包裹吸附在所述金属有机骨架载体内部和表面。

在一种实施方式中，所述第二配体选自2-甲基咪唑、2-醛基咪唑中的一种或两种，但不限于此。

步骤S3中，所述反应的温度为20-30℃，所述反应的时间为10min–2h。本实施例中的制备方法，在常温下即可完成，节能环保。

在一种实施方式中，所述金属盐与所述第二配体的摩尔比为1:(20-100)。

在一种实施方式中，所述金属盐选自锌盐、钴盐、锆盐、铜盐中的一种或多种，但不限于此。例如，可以是硝酸锌、硫酸钴、硫酸锆、硫酸铜等。

本实施方式中的金属有机骨架载体由锌离子、钴离子、锆离子、铜离子中的一种与2-甲基咪唑、2-醛基咪唑中的一种发生配位反应制备得到，例如，可以制备得到ZIF-8、ZIF-90等中的一种，但不限于此。

在一种实施方式中，加入金属盐水溶液反应后，得到所述级联纳米酶前，还包括步骤：

将反应后的溶液离心，得到沉淀物；

将所述沉淀物用去离子水进行洗涤，干燥后得到所述级联纳米酶。

本实施方式中，因为iNOS具有水溶性，在金属有机骨架载体表面吸附的iNOS能够通过去离子水洗涤除去，所以得到的级联纳米酶中，iNOS通过其氨基与金属离子的配位作用和其与第二配体、金属离子的电荷之间的相互作用结合在所述金属有机骨架内部，而不会吸附结合在所述金属有机骨架的表面。

下面以锌离子、2-甲基咪唑分别作为金属有机骨架载体的金属离子和有机配体为例，对所述级联纳米酶的合成路线进行说明，如图1所示，采用共沉淀法将所述锌离子、2-甲基咪唑、铂纳米颗粒(Pt NPs)和iNOS混合均匀反应后，得到所述级联纳米酶[email protected]@NOS，实现了铂纳米颗粒(Pt NPs)和iNOS的原位包裹。

本发明实施例还提供一种本发明所述的级联纳米酶在制备治疗肝缺血再灌注损伤的药物中的应用。

本实施例中级联纳米酶属于纳米尺寸，相比于小分子药物具有在肝脏被动积累的天然优势，可增加药物在肝脏的富集，具有较高的靶向性。铂纳米颗粒作为纳米酶具有优异的活性氧(ROS)清除能力，可催化活性氧产生氧气，产生的氧气在一氧化氮合成酶(iNOS)的催化下与精氨酸反应原位产生NO，提高NO的生物利用度。因金属有机骨架载体的比表面积大、孔隙可调，其不仅可以为结合在其内部的iNOS提供有效的保护，防止其在体内的失活和降解，而且可以促进分子之间的扩散和反应的进行，因为NO的合成具有氧气依赖的特点，将反应物(例如铂纳米颗粒催化ROS生成的氧气)与催化剂限定在金属有机骨架载体中，能够提升金属有机骨架载体中的氧气的含量，极大程度提高反应发生的几率，从而提高催化效率。因此，该级联纳米酶不仅提高了NO的靶向性和生物利用度，而且其在肝脏部位富集效应触发级联反应，将其作为减轻肝缺血再灌注损伤的药物时，可同时实现ROS的清除和NO的调节，从而实现对肝脏缺血再灌注造成的损伤的有效干预。具体是，以HIRI发生时产生的ROS为反应物，也即以ROS为刺激，触发催化反应，铂纳米颗粒催化ROS反应生成氧气，产生的氧气可在iNOS催化下进一步与精氨酸反应原位生成NO，完成整个级联反应，该级联反应过程中铂纳米颗粒催化ROS反应生成氧气实现了ROS的有效清除、产生的氧气可在iNOS催化下进一步与精氨酸反应原位生成NO，提高了NO的生物利用度。该级联反应过程可降低氧化应激损伤、抑制细胞凋亡及炎症因子的表达，最终实现对HIRI的有效干预。

下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。

下列实施例及测试中未注明的具体实验条件和方法，通过按照常规条件如：美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用指南、细胞实验指南等书中所述的条件和方法，或按照仪器制造厂商所建议的条件和方法。

实施例1

在10mL的1mM的氯铂酸溶液中，加入111.1mg的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，搅拌15分钟后，向其中加入新配置的200uL的100mM的硼氢化钠溶液后，搅拌12小时，溶液变为深棕色，过滤洗涤后得到铂纳米颗粒，然后将铂纳米颗粒与适量的水混合，配制得到质量浓度为1mg/mL的铂纳米颗粒水溶液。

将2-甲基咪唑(0.26g,3.15mmol)、上述铂纳米颗粒水溶液(0.1mL)一加入到0.9mL的水中混合均匀，再加入100μL的0.5M的硝酸锌和一氧化氮合成酶(0.6mg)的混合水溶液(硝酸锌摩尔数为0.05mmol)，反应后通过离心过滤、洗涤得到所述级联纳米酶，记作[email protected]@NOS，其TEM图如图2所示，[email protected]@NOS的粒径小于100nm，且可以看到均匀分布的Pt纳米颗粒。

对比例1

将2-甲基咪唑(0.26g,3.15mmol)加入到0.9mL的水中混合均匀，再加入100μL的0.5M的硝酸锌水溶液(硝酸锌摩尔数为0.05mmol)，反应后得到金属有机骨架载体，记作ZIF。

对比例2

在10mL的1mM的氯铂酸溶液中，加入111.1mg的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，搅拌15分钟后，向其中加入新配置的200uL的100mM的硼氢化钠溶液后，搅拌12小时，溶液变为深棕色，过滤洗涤后得到铂纳米颗粒，然后将铂纳米颗粒与适量的水混合，配制得到质量浓度为1mg/mL的铂纳米颗粒水溶液。

将2-甲基咪唑(0.26g,3.15mmol)加入到0.9mL的水中混合均匀，然后加入0.1mL上述铂纳米颗粒水溶液混合均匀，再加入100μL的0.5M的硝酸锌水溶液(硝酸锌摩尔数为0.05mmol)，反应后得到的产物，记作[email protected]。

对比例3

将2-甲基咪唑(0.26g,3.15mmol)加入到0.9mL的水中混合均匀，再加入100μL的0.5M的硝酸锌和一氧化氮合成酶(0.6mg)的混合水溶液(硝酸锌摩尔数为0.05mmol)，反应后得到的产物，记作[email protected]。图3为对比例1中的ZIF及对比例3中的[email protected]的XRD图。由图3可以看出，iNOS的装载不会破坏金属有机骨架的晶体结构性质。

对比例4

在10mL的1mM的氯铂酸溶液中，加入111.1mg的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，搅拌15分钟后，向其中加入新配置的200uL的100mM的硼氢化钠溶液后，搅拌12小时，溶液变为深棕色，过滤洗涤后得到铂纳米颗粒，记作Pt NPs。

下面对实施例1中的[email protected]@NOS、对比例1中的ZIF、对比例2中的[email protected]、对比例4中的Pt NPs进行测试。

测试1

Pt NPs清除活性氧的能力测试

(1)清除过氧化氢的测试

通过过氧化氢探针试剂盒(Abcam,USA)对Pt NPs清除过氧化氢的效率测试，将对比例4中的Pt NPs配制成不同浓度的水溶液分别为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，按照过氧化氢探针试剂盒造商提供的方案进行不同浓度的Pt NPs清除过氧化氢的效率测试，其结果如图4所示，由图4可以看出，Pt NPs能够有效的清除过氧化氢，并且具有浓度依赖的特性，浓度越高过氧化氢的抑制率越高。

(2)清除超氧自由基的测试

通过SOD检测试剂盒(Sigma-Aldrich,USA)对Pt NPs清除超氧自由基的效率进行测试，将对比例4中的Pt NPS配制成不同浓度的水溶液分别为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，按照SOD检测试剂盒(Sigma-Aldrich,USA)制造商提供的方案进行不同浓度的Pt NPs清除超氧自由基的效率测试，其结果如图5所示，由图5可以看出，Pt NPs能够有效的清除超氧自由基，并且具有浓度依赖的特性，浓度越高超氧自由基的抑制率越高。

测试2

[email protected]@NOS级联酶NO生成能力测试

通过Griess试剂盒方法(Promega,USA)对实施例1中的[email protected]@NOS、对比例2中的[email protected]、对比例3中的[email protected]生成NO的效率进行测试。向[email protected]水溶液、[email protected]水溶液、[email protected]@NOS(改变实施例1中的Pt加入量，使得Pt含量分别为0.58％、1.15％、2.3％)水溶液中加入精氨酸(5mg/mL)和过氧化氢(10mM)孵育24h，其中[email protected]水溶液、[email protected]水溶液、[email protected]@NOS水溶液浓度相同。按照一氧化氮试剂盒造商提供的方案进行NO生成测试，由图6可以看出，NO的生成量和Pt的负载量成正比，且[email protected]@NOS的NO生成量优于[email protected]和[email protected]。

测试3

实施例1中[email protected]@NOS的抗氧化能力测试

为了评估所制备的[email protected]@NOS纳米平台的整体抗氧化能力，基于2,2'-Azino-bis(3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid)(ABTS)测定。如图7所示，在[email protected]@NOS存在下，蓝色的ABTS^·+自由基表现出明显的吸光度降低和变色。此外，自由基清除效率与纳米颗粒浓度呈正相关。这些结果清楚地表明[email protected]@NOS具有清除ATBS自由基的良好的抗氧化能力。

测试4

[email protected]@NOS在细胞水平清除活性氧的能力及对肝实质细胞(FL38B cells)存活率的影响测试

(1)[email protected]@NOS在细胞水平清除活性氧的能力测试

将磷酸盐缓冲液(PBS)、对比例1中的ZIF、对比例2中的[email protected]、实施例1中的[email protected]@NOS分别与FL38B细胞共孵育一段时间后(细胞混合液中磷酸盐缓冲液(PBS)、ZIF、[email protected]、[email protected]@NOS的浓度相同)，分别加入H₂O₂模拟细胞内的氧化应激反应，继续孵育4h后，加入2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内的H₂O₂含量，具体通过激光共聚焦显微镜成像和流式细胞仪分析细胞内H₂O₂含量的变化，与此同时设置不加入H₂O₂的对照组。结果如图8所示，其中，DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)用来染色细胞核，DCF(2',7'-二氯荧光素)为活性氧指示剂，由图8中可以看出，过氧化氢刺激后的各组细胞与对照组(未经过过氧化氢刺激的细胞，图8中的control组)相比，[email protected]@NOS组细胞中的DCF荧光明显减弱，接近于对照组细胞，这说明[email protected]@NOS能够有效清除FL38B细胞中活性氧。将[email protected]@NOS配制成不同浓度的水溶液(分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL)，然后与FL38B细胞共孵育一段时间后，加入H₂O₂模拟细胞内的氧化应激反应，然后测试过氧化氢的含量，结果如图9所示，随着[email protected]@NOS的浓度增加，FL38B细胞中的活性氧水平显著降低。

(2)[email protected]@NOS对肝实质细胞(FL38B cells)存活率的影响测试

将FL38B细胞以每孔1×104密度接种到96孔板中，并置于37℃、5％CO₂条件下培育12h，加入不同浓度(分别为1、2、4、8μg/mL)的[email protected]@NOS水溶液孵育2h后，加入250μM H₂O₂，继续孵育24h后，采用MTT法评价[email protected]@NOS对肝细胞的毒性，具体为在每个孔中加入100μLMTT的培养基溶液(0.8mg/mL)，继续培养4h，吸出96孔板中的残余培养基，在每个孔中加入150μL DMSO溶液，轻轻摇晃后，在酶标仪上检测每孔的OD值(检测波长为570nm)，用如下公式计算细胞存活率。细胞存活率(cell viability)(％)＝(样品的OD570值/空白OD570值)×100％。结果如图10所示，将[email protected]@NOS与FL38B细胞共同孵育后再接受过氧化氢刺激，FL38B cells细胞的存活率比未与[email protected]@NOS共同孵育的FL38B细胞大幅提高，说明[email protected]@NOS能够保护肝实质细胞免受活性氧损伤。

测试5

[email protected]@NOS在小鼠体内的生物分布测试及肝脏蓄积评价

将[email protected]@NOS尾静脉注射小鼠C57BL/6(6-8周)体内，通过电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-OES)及小动物活体成像，分别测定1h、4h、12h、24h、48h等不同时间点[email protected]@NOS在小鼠主要器官的分布及肝脏组织的累积。

如图11所示，通过电感耦合等离子体原子发射光谱测试发现，尾静脉注射24h后，肝脏部位的蓄积量仍能达到22.8％ID/g，其他主要器官如心(对应图中的H)、脾(对应图中的Sp)、肺(对应图中的Lu)、肾(对应图中的K)的累积量均小于10％ID/g。如图12所示，通过小动物活体荧光观察在1h、4h、10h、24h、48h等不同时间点[email protected]@NOS在肝脏组织的累积，表明4小时至10小时具有良好的肝脏累积效果。

测试6

[email protected]@NOS对肝缺血再灌注损伤小鼠的治疗疗效和生物安全性评价

(1)[email protected]@NOS对肝缺血再灌注损伤小鼠的治疗疗效评价

构建C57BL/6(6-8周)小鼠肝缺血再灌注损伤模型，尾静脉注射给药(分为注射PBS、Pt NPs、ZIF、[email protected]、[email protected]@NOS)构成HIRI阳性组即PBS组、Pt NPs组、ZIF组、[email protected]和[email protected]@NOS组。选择最佳时间进行手术，具体操作如下：将小鼠沿腹部正中切开，暴露肝门部，使用无创血管夹夹闭包括门静脉、肝动脉和肝管的肝蒂。至肝脏缺血1h后，松开动脉夹造成再灌注。并且设置不注入任何药物不进行肝缺血再灌注损伤的空白对照组。分别在不同组小鼠术后12h采血，采用全自动生化仪测定小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)分析肝肾功能指标。

如图13和图14所示，与空白对照组相比，PBS组肝缺血再灌注损伤后，其ALT、AST水平显著升高。注射Pt NPs和ZIF的小鼠的肝损伤程度未能减缓。对比之下，[email protected]@NOS组表现出最佳的治疗效果。说明[email protected]@NOS能够有效的缓解和治疗肝缺血再灌注损伤。

(2)安全性评价-肝肾功能测试

将[email protected]@NOS尾静脉注射到小鼠C57BL/6(6-8周)体内，并设置不注射[email protected]@NOS的空白对照组，7天后，测试小鼠的ALT、AST、CRE、BUN水平。

由图15、16可知，在7天后，[email protected]@NOS治疗组的ALT、AST、CRE、BUN水平与空白对照区基本无区别，说明[email protected]@NOS不会对小鼠的肝肾功能造成损伤(图15中ALT、AST是反应肝功能的指标，图16中CRE、BUN是反应肾功能的指标)，进一步说明[email protected]@NOS具有良好的生物相容性和生物安全性。

(3)安全性评价-溶血性实验

将300μL不同质量浓度(分别为0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100μg/mL)的[email protected]@NOS的PBS等渗液与1.2mL红细胞悬浮液(红细胞浓度为4％)混合后，37℃孵育4h，以5000r/min的转速离心5min，取上清150μL于96孔板中，用酶标仪在540nm测紫外吸光度(A)值，每个浓度平行3份，以PBS为阴性对照，以蒸馏水为阳性对照。计算溶血率。溶血率＝(实验组的A值－阴性对照组A值)/(阳性对照组A值－阴性对照组的A值)。结果如图17所示，可以看出，不同质量浓度的[email protected]@NOS的PBS等渗液与红细胞悬浮液混合后，红细胞的溶血率都很低，说明[email protected]@NOS不会造成细胞溶血，具有生物相容性和生物安全性。

综上所述，本发明提供了一种级联纳米酶及其制备方法与应用，级联纳米酶属于纳米尺寸，相比于小分子药物具有在肝脏被动积累的天然优势，可增加药物在肝脏的富集，具有较高的靶向性。铂纳米颗粒作为纳米酶具有优异的活性氧(ROS)清除能力，可催化活性氧产生氧气，产生的氧气在一氧化氮合成酶(iNOS)的催化下与精氨酸反应原位产生NO，提高了NO的生物利用度。因金属有机骨架载体的比表面积大、孔隙可调，其不仅可以为结合在其内部的iNOS提供有效的保护，防止其在体内的失活和降解，而且可以促进分子之间的扩散和反应的进行，因为NO的合成具有氧气依赖的特点，将反应物(例如铂纳米颗粒催化ROS生成的氧气)与催化剂限定在金属有机骨架载体中，能够提升金属有机骨架载体中的氧气的含量，极大程度提高反应发生的几率，从而提高催化效率。因此，该级联纳米酶不仅提高了NO的靶向性和生物利用度，而且其在肝脏部位富集效应触发级联反应，可同时实现ROS的清除和NO的调节，从而实现对肝脏缺血再灌注造成的损伤的有效干预。以HIRI中过量的ROS为反应物，铂纳米颗粒催化实现了ROS的有效清除，产生的氧气可在iNOS催化下进一步与精氨酸原位生成NO。该过程可降低氧化应激损伤、抑制细胞凋亡及炎症因子的表达，最终实现对HIRI的有效干预。该活性氧激活的级联纳米酶不仅提高了NO的靶向性和生物利用度，而且实现了ROS清除与NO调节的双重保护作用，为发展安全有效的HIRI治疗药物提供了新思路和临床应用前景。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。