一种酶解南极磷虾蛋白制备ace抑制肽的方法

文档序号：1500174 发布日期：2020-02-07 浏览：15次 >En<

阅读说明：本技术 一种酶解南极磷虾蛋白制备ace抑制肽的方法 ([db:专利名称-en]) 是由赵玉勤于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及活性多肽制备技术领域,公开了一种酶解南极磷虾蛋白制备ACE抑制肽的方法,包括如下步骤：(1)酶解：将南极磷虾粉溶于水中制成南极磷虾溶液,向南极磷虾溶液中加入蛋白酶,酶解得到酶解液,所述蛋白酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种；(2)高温灭活；(3)离心分离；(4)干燥：步骤(3)的上清液干燥后得到所述ACE抑制肽。本发明以南极磷虾作为原料制备ACE抑制肽,具有极高的利用价值和经济效益；使用胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胃蛋白酶酶解南极磷虾,并精确选择酶解条件,制得的ACE抑制肽具有高得抑制活性和抑制率。([db:摘要-en])

一种酶解南极磷虾蛋白制备ACE抑制肽的方法

技术领域

本发明涉及活性多肽制备技术领域，尤其是涉及一种酶解南极磷虾蛋白制备ACE抑制肽的方法。

背景技术

血管紧张素转换酶(ACE)是一种锌蛋白酶，在调节血压中起着重要作用。ACE抑制剂通过抑制人体内ACE酶的活性，钝化舒缓激肽的，减少血管紧张素Ⅱ的合成，达到使血压上升的目的。人工合成的血管紧张素转换酶抑制剂，如卡托普利、依那普利和赖诺普利已被用于治疗高血压，但同时在临床上会带来显著的副作用，如头痛，恶心，发热，皮疹等。因此，目前正在开发可通过食品蛋白酶水解获得的ACE抑制肽，其具有安全，低毒，低过敏性等优势，以ACE抑制肽作为主要成分开发具有降血压效果的保健食品，在临床上可作为一种预防和辅助治疗高血压的新型手段。

南极磷虾位于南大洋西南大西洋地区，是鲸鱼、企鹅和海豹的主要食物，也是商业捕鱼物种(如鲭鱼、冰鱼)的主要食物来源，南极磷虾也是一种渔业目标物种。南极磷虾的蛋白含量为11.9％～15.4％，含有全部的人体必需氨基酸，必需氨基酸的总量达到212.1mg/g蛋白质，具有极高的利用价值和经济效益。因此，如果可以从南极磷虾中制备ACE抑制肽，具有较大的应用价值。

ACE抑制肽在原蛋白序列中不具有活性，但是可以通过酶水解方法从原蛋白中释放出来。例如，在中国专利文献上公开的“一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法”，其公告号CN106755242A，方法为：将魔芋蛋白溶液的pH值调节为6-9，加入胶原蛋白酶进行酶解，在30℃-45℃下进行酶解，得到酶解液；将酶解液进行灭酶，然后调节pH值至魔芋蛋白等电点，然后进行离心，收集上清液；将离心后收集的上清液进行冷冻干燥，得到ACE抑制肽粗品；将ACE抑制肽粗品经过凝胶层析分离，得到魔芋蛋白ACE抑制肽。

但现有技术中制备出的ACE抑制肽的抑制率交底，且目前还没有利用南极磷虾蛋白制备ACE抑制肽的研究，而已知ACE抑制肽没有固定或统一氨基酸序列组成，并且酶解产物中的组分也较为复杂，不同的原蛋白制备出的ACE抑制肽的抑制活性差异很大，增加了ACE抑制肽的制备难度，因此，从南极磷虾中制备、筛选高效的ACE抑制肽具有显著的应用价值和理论意义，值得进一步深入研究。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中人工合成的血管紧张素转换酶抑制剂在临床上会带来显著的副作用，如头痛，恶心，发热，皮疹等，需要用通过食品蛋白酶水解获得的安全、低毒、低过敏性的ACE抑制肽代替的问题，提供一种酶解南极磷虾蛋白制备ACE抑制肽的方法，从南极磷虾中成功制备和筛选出高效的ACE抑制肽，为南极磷虾的高值化利用、功能性食品和新型降压药物的研发提供了基础。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种酶解南极磷虾蛋白制备ACE抑制肽的方法，包括如下步骤：

(1)酶解：将南极磷虾粉溶于水中制成南极磷虾溶液，向南极磷虾溶液中加入蛋白酶，酶解得到酶解液，所述蛋白酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种；

(2)高温灭活；

(3)离心分离；

(4)干燥：步骤(3)的上清液干燥后得到所述ACE抑制肽。

作为优选，蛋白酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶时，酶解时的pH为7.5～8.5，酶解温度45～55℃；蛋白酶为中性蛋白酶时，酶解时的pH为6.5～7.5，酶解温度35～45℃；蛋白酶为胃蛋白酶时，酶解时的pH为2.0～2.5，酶解温度35～40℃。

作为优选，胰蛋白酶活力100000～200000u/g，碱性蛋白酶活力100000～160000u/g，中性蛋白酶活力40000～60000u/g，胃蛋白酶活力200000～300000u/g。

作为优选，步骤(1)中南极磷虾溶液中的料液质量比为1：(10～20)。

作为优选，步骤(1)中加入的蛋白酶的质量分数为2～4％。

作为优选，步骤(1)中的酶解时间为4～6h。

作为优选，步骤(2)中的灭活温度为95～105℃，灭活时间10～20min。

作为优选，步骤(3)中离心速度3000～4000rpm，离心时间20～30min。

作为优选，步骤(4)中的干燥方法为冷冻干燥，干燥温度-60～-110℃，干燥时间20～30h。

本发明以南极磷虾作为原材料，先通过步骤(1)使用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶对其进行酶解，然后通过步骤(2)高温灭活使酶失去活性，最后通过步骤(3)分离和步骤(4)干燥制得ACE抑制肽，通过对温度、时间、加酶量、料液比和pH的精确选择，优化酶解工艺，使得制得的ACE抑制肽的抑制率大大提高，最高可达38.8193％，为南极磷虾的高值化利用、功能性食品和新型降压药物的研发提供了基础。

因此，本发明具有如下有益效果：

(1)南极磷虾是一种常见的鱼类食物，其蛋白含量为11.9％～15.4％，含有全部的人体必需氨基酸，必需氨基酸的总量达到212.1mg/g蛋白质，以南极磷虾作为原料制备ACE抑制肽，具有极高的利用价值和经济效益；

(2)使用胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胃蛋白酶酶解南极磷虾，并精确选择酶解条件，制得的ACE抑制肽具有高得抑制活性和抑制率。

附图说明

图1是马尿酸标准品色谱图；

图2是HHL色谱图；

图3是马尿酸与HHL混合进样色谱图；

图4是马尿酸标准曲线；

图5是实施例和对比例对ACE的抑制率；

图6是温度50℃，pH＝8，料液比1:15时温度、时间和ACE抑制率的响应面图；

图7是温度50℃，pH＝8，料液比1:15时时间、温度和ACE抑制率的等高线图；

图8是温度50℃，料液比1:15时pH、时间和ACE抑制率的响应面图；

图9是温度50℃，料液比1:15时时间、pH和ACE抑制率的等高线图；

图10是加酶量3％，温度50℃，料液比1:15时加酶量、时间和ACE抑制率的响应面图；

图11是加酶量3％，温度50℃，料液比1:15时加酶量、时间和ACE抑制率的等高线图；

图12是加酶量3％，温度50℃时料液比、时间和ACE抑制率的响应面图；

图13是加酶量3％，温度50℃时料液比、时间和ACE抑制率的等高线图；

图14是pH＝8，加酶量3％，料液比1:15时pH、温度和ACE抑制率的响应面图；

图15是pH＝8，加酶量3％，料液比1:15时pH、温度和ACE抑制率的等高线图；

图16是pH＝8，料液比1:15时，加酶量、温度和ACE抑制率的响应面图；

图17是pH＝8，料液比1:15时，加酶量、温度和ACE抑制率的等高线图；

图18是酶解时间5h，pH＝8，加酶量3％时料液比、温度和ACE抑制率的响应面图；

图19是酶解时间5h，pH＝8，加酶量3％时料液比、温度和ACE抑制率的等高线图；

图20是酶解时间5h，温度50℃，料液比1:15时加酶量、pH和ACE抑制率的响应面图；

图21是酶解时间5h，温度50℃，料液比1:15时加酶量、pH和ACE抑制率的等高线图；

图22是加酶量3％，温度50℃时料液比、pH和ACE抑制率的响应面图；

图23是加酶量3％，温度50℃时料液比、pH和ACE抑制率的等高线图；

图24是温度50℃，料液比1:15时加酶量、料液比和ACE抑制率的响应面图；

图25是温度50℃，料液比1:15时加酶量、料液比和ACE抑制率的等高线图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。

本发明采用HPLC法测定ACE抑制活性：

1、检测原理：

在体外37℃条件下，ACE能催化其底物类似物马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)产生马尿酸(HA)，HA在228nm处有特征吸收峰。当有ACE抑制剂(ACEI)存在时，ACE活性受到抑制，HA的生成量会减少，可通过判断HA的生成量来评价ACE抑制活性的大小。

HPLC法测定时，通过计算加人ACEI前后马尿酸的峰面积差值来确定ACE抑制率。

2、试剂的配制：

0.1mol/L硼酸缓冲液(pH 8.3，0.3mol/L NaCl)：

(1)称取12.37g硼酸固体，加热溶解后定容至100mL备用；

(2)称取1.907g硼砂(Na2B4O7.10H2O)，加热溶解后定容至100mL备用；

(3)量取17.5mL硼砂溶液和32.5mL硼酸溶液混匀，HCl或者NaOH调节PH至8.3，然后再加入1.7532g NaCl，定容至100mL即可；

1mmol/L马尿酸标准液：称取适量的马尿酸标准品，以超纯水为溶剂，配制成1mmol/L马尿酸标准液，置于4℃冰箱，备用；

0.1U/mL ACE溶液：将0.1U ACE溶于1mL 0.1mol/L硼酸缓冲液(pH 8.3，0.3mol/LNaCl)中，即可得到0.1U/mL ACE溶液，-20℃保存备用；

5mmol/L HHL溶液：称取适量的HHL，以0.1mol/L硼酸缓冲液(pH8.3，含0.3mol/L NaCl)为溶剂，配成5mmol/L的HHL溶液，-20℃保存备用。

3、色谱条件：

色谱柱:ZORBAX SB-C18分析型色谱柱(填料粒径5μm 4.6×250mm)；检测波长:228nm，流速:1.0mL/min；

流动相A：乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：超纯水(含0.1％三氟乙酸)，采用等度洗脱方式，流动相A与流动相B的流动相体积比为25：75；

柱温：25℃；自动进样，进样量：10μL。

4、检测方法：

采用HPLC法测定ACE抑制活性，所有实验均在1.5ml EP管中进行。将180μL HHL溶液和30μL样品溶液置于1.5ml EP管中，于37℃水浴中预热5min，加入15μL 0.1U/mL的ACE溶液于37℃恒温水浴反应1h，反应完成后加入225μL 1mol/L HCl溶液停止反应，即可得到抑制剂反应液。反应液通过0.45μm的滤膜，置于进样瓶中，加入进样系统。同时用30μL硼酸缓冲盐溶液(0.1mol/L，pH 8.3，含0.3mol/L NaCl)替代抑制剂溶液作空白对照组。

ACE抑制活性计算公式如下：

式中:A₀为空白组中马尿酸的峰面积(mAU.s)；A₁为抑制剂组中马尿酸的峰面积(mAU.s)；

IC₅₀指的是在一定条件下抑制ACE酶活性一半时所需要的抑制剂的浓度。并且得出的抑制率与制剂浓度之间并不存在一个线性关系，因此必须通过做出有关抑制剂浓度与抑制率关系的曲线图，再从图中查出IC₅₀，并对得出的结果进行3次重复测量，经过实验，本发明实施例中IC₅₀取18nM。

5、方法验证：

(1)马尿酸与HHL保留时间确定：

将马尿酸标准品和HHL溶液按照上述色谱条件和方法进样，确定二者保留时间，结果如图1-图3所示。

(2)马尿酸标准曲线和线性回归：

将1mmol/L马尿酸标准液用超纯水稀释成系列梯度浓度的马尿酸溶液：0.5、0.1、0.05、0.01以及0.005mmol/L，经0.45μm滤膜过滤后依照上述色谱方法进样，并以马尿酸峰面积y对马尿酸标准溶液的浓度x进行线性回归，结果如图4所示。

实施例1：

(1)酶解：将南极磷虾粉溶于水中制成南极磷虾溶液，料液质量比为1：15；调节南极磷虾溶液的pH至8.0，向南极磷虾溶液中加入质量分数为3％的胰蛋白酶，酶活力200000u/g，50℃下酶解5h得到酶解液；

(2)高温灭活：100℃下灭活15min；

(3)离心分离：3500rpm下离心25min；