一种基于透明质酸修饰氟化石墨烯的靶向药物载体的制备方法
阅读说明：本技术 一种基于透明质酸修饰氟化石墨烯的靶向药物载体的制备方法 (Preparation method of targeted drug carrier based on hyaluronic acid modified fluorinated graphene ) 是由 周旸 徐城锋 黄芊蔚 胡锦华 王秉 万军民 于 2019-10-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医用材料领域,公开了一种基于透明质酸修饰氟化石墨烯的靶向药物载体的制备方法,本发明先以鳞片石墨为原料制备得到氧化石墨烯,然后通过溶液法以二乙氨基三氟化硫为氟化剂制得部分氟化石墨烯,其表面所拥有的大量含氧的亲水官能团,有助于其通过氢键对药物进行负载和提高生物相容性。随后通过超声波处理得到部分氟化石墨烯水溶液。在氟化石墨烯上接上PEI,后利用透明质酸对其修饰,得到靶向药物载体。(The invention relates to the field of medical materials, and discloses a preparation method of a targeted drug carrier based on hyaluronic acid modified fluorinated graphene. And then obtaining a partially fluorinated graphene aqueous solution through ultrasonic treatment. PEI is connected to the fluorinated graphene, and then the fluorinated graphene is modified by hyaluronic acid to obtain the targeted drug carrier.)
技术领域
本发明涉及医用材料领域，尤其涉及一种基于透明质酸修饰氟化石墨烯的靶向药物载体的制备方法。
背景技术
氟化石墨烯自从2010年由Geim课题组第一次成功制备后，就作为石墨烯的新型衍生物，被人们广泛关注，它与其类似，仍然具有良好的力学性能，同时其基础上引入了氟原子，从而获得了很多独特而优异的性能。它拥有着优秀的电子、光学和机械性能，同时还有降低界面能的作用，以及很好的热稳定性以及抗氧化性。这让氟化石墨烯主要的研究热点在光学、电子学和理论计算等领域。
氟化石墨烯不仅继承了石墨烯材料的优异性能，而且具有其他碳材料所不具备的显著优势(如：稳定的顺磁性，稳定的光致发光，氟在医学上特殊的功效)，具有作为新型肿瘤药物的载体的潜在价值。但疏水性导致的生物相容性差，苛刻的制备条件以及繁琐的合成步骤等因素严重限制了氟化石墨烯在生物领域的应用。因此探究如何将氟化石墨烯应用于生物领域具有重大有意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于透明质酸修饰氟化石墨烯的靶向药物载体的制备方法，本发明首先以鳞片石墨为原料，通过改进hummers法以及一系列后处理制备得到氧化石墨烯，然后通过溶液法以二乙氨基三氟化硫为氟化剂，将氧化石墨烯部分含氧基团转化为含氟基团，制备了可稳定分散在水中的亲水性的部分氟化石墨烯。氧化氟化石墨烯片层表面所拥有的大量含氧的亲水官能团，这有助于使其通过氢键对药物进行负载和提高生物相容性。随后将所得部分氟化石墨烯分散在水中，通过超声处理得到均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯水溶液。后向溶液中加入氢氧化钠和次氯酸钠，将-OH转化为-COOH，得到部分氟化石墨烯-COOH。再将氟化石墨烯-COOH粉末分散在DMSO中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐对-COOH进行活化，加入PEI制得氟化石墨烯-PEI，向经过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化的透明质酸中逐滴加入氟化石墨烯-PEI，得到最终产物。
本发明的具体技术方案为：一种基于透明质酸修饰氟化石墨烯的靶向药物载体的制备方法，包括以下步骤：
1)将容器在冰水浴中降温到0-5℃，加入20-25mL浓硫酸；然后加入0.5-2g鳞片石墨粉与0.2-1g硝酸钠，超声处理20-30min。
2)搅拌反应，保持反应温度低于10℃，然后称取2-4g高锰酸钾，在25-30min内分批次加入，反应1.5-2.5h。
本发明分批次加高锰酸钾可以使反应较为温和，便于控制反应体系温度，防止反应过于猛烈，产生不必要的杂质。同时能在其氧化作用下被硫酸插层，生成石墨-硫酸一阶插层物。
3)升温至35-40℃，反应25-30min。
4)量取70-120mL水，经冰水浴降温至0-5℃后加入；然后调温至90-95℃，继续搅拌反应25-30min。
本发明将步骤3)中制得的氧化石墨，通过与水反应，同时水进入层间替代其中的酸从而剥离得到氧化石墨烯。
5)加入50-70mL水中止反应，再加入20-30mL体积浓度为25-35％的H2O2溶液，继续搅拌反应15-20min。
6)加入30-50mL体积浓度为8-12％的HCl溶液，静置4-5天。
本发明在步骤6)中将产物静置4-5天，使下层沉淀中的酸等杂质分离渗透到上清液中，从而减少离心时间。
7)先除去溶液的上清液，再取下层粘稠液离心处理，直至粘稠液呈中性，将粘稠液倒冷冻干燥24-48h，得到氧化石墨烯片。
8)将氧化石墨烯片研磨成氧化石墨烯粉。
9)另取容器加入0.5-1.5g氧化石墨烯粉和20-40mL二氯甲烷或1，2-二氯乙烷，搅拌10-14h使其均匀分散。
本发明在步骤9)中以二氯甲烷或1，2-二氯乙烷为溶剂，使氧化石墨烯粉末能在其中均匀分散。
10)滴加0.5-1mL二乙氨基三氟化硫，然后在室温下超声处理4-6h，搅拌反应24-72h。
本发明以二乙氨基三氟化硫为氟化剂，具有很强的氟化作用，能在常温常压下将氧化石墨烯中的含氧官能团部分转化为含氟官能团。制备了亲水性的部分氟化石墨烯，并且可以稳定的分散在水中。氧化氟化石墨烯片层表面所拥有的大量含氧的亲水官能团，这有助于使其通过氢键对药物进行负载和提高生物相容性。
11)加入15-30mL甲醇终止反应，过滤得到部分氟化石墨烯产物，并用乙醇和去离子水充分洗涤，于50-70℃下干燥。
12)称取25-30mg部分氟化石墨烯分散于45-60mL水中，超声处理，得到部分氟化石墨烯溶液。
本发明利用超声波细胞粉碎机得到在水中均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯溶液，为后面透明质酸的修饰带来了方便。
13)取1-1.5g氢氧化钠和1.2-1.5g次氯酸钠加入部分氟化石墨烯溶液，超声3-4h。
本发明通过加入氢氧化钠和次氯酸钠，将部分氟化石墨烯中的-OH转化为-COOH，得到部分氟化石墨烯-COOH。
14)离心并除去上清液，再加入水得到均匀分散液，加入稀盐酸至pH为中性，置于水中透析48-72h，冷冻干燥。
15)称取20-30mg氟化石墨烯分散在5-10ml DMSO中，加入10-15ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化搅拌反应3-5h，得到活化氟化石墨烯溶液。
16)另取35-40mg PEI溶解在15-25ml DMSO中，在搅拌下将所得PEI溶液逐滴加入活化氟化石墨烯溶液中，在室温条件下超声搅拌反应24-36h，透析除去未反应的杂质，冷冻干燥，得到氟化石墨烯-PEI。
17)称取0.1-0.12g透明质酸溶解在5-10ml水中，并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化搅拌反应3-5h，得到活化透明质酸溶液。
18)称取20-30mg氟化石墨烯-PEI分散于5-15ml水中，在搅拌下将所得氟化石墨烯-PEI溶液逐滴加入到活化透明质酸溶液中，在室温条件下搅拌反应24-36h，透析除去未反应的杂质。
本发明通过PEI与氟化石墨烯先结合，再加入经过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化过的透明质酸，得到氟化石墨烯-PEI-HA，具有靶向功能。
19)使用pH＝7.8-8.5的碳酸氢钠溶液对步骤18)所得溶液透析处理，每3-4h换一次水，48-60h后将其转移至水中继续透析24-36h。
20)采用旋转蒸发法去除溶液中的水分，干燥后得到基于透明质酸修饰氟化石墨烯的靶向药物载体。
作为优选，步骤2)中，搅拌速率为400-800rpm，搅拌20-40min。
作为优选，步骤6)中，静置过程中，每1-2d除去上清液，加入等量去离子水。
作为优选，步骤7)中，离心过程具体为：使用高速离心机，分别在4000rpm，6000rpm，8000rpm，10000rpm，12000rpm下各离心10min，每次离心后除去离心管中上清液并加入等量去离子水。
作为优选，步骤9)、步骤10)、步骤11)中，各反应均在室温下进行。
作为优选，步骤12)中，超声处理具体为：利用超声波细胞粉碎机在600-650W功率下超声波处理2.5-3h，得到均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯溶液。
作为优选，步骤13)中，超声条件为：在550-600W功率下超声3-4h。
作为优选，步骤14)和步骤19)中，透析所用的透析袋规格为8000-14000D。
作为优选，步骤20)中，旋转蒸发的转速为2-3rpm/s，温度为35-45℃。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明首先以鳞片石墨为原料，通过改进hummers法以及一系列后处理制备得到氧化石墨烯，然后通过溶液法以二乙氨基三氟化硫为氟化剂，将氧化石墨烯部分含氧基团转化为含氟基团，制备了可稳定分散在水中的亲水性的部分氟化石墨烯。氧化氟化石墨烯片层表面所拥有的大量含氧的亲水官能团，这有助于使其通过氢键对药物进行负载和提高生物相容性。随后将所得部分氟化石墨烯分散在水中，通过超声处理得到均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯水溶液。后向溶液中加入氢氧化钠和次氯酸钠，将-OH转化为-COOH，得到部分氟化石墨烯-COOH。再将氟化石墨烯-COOH粉末分散在DMSO中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐对-COOH进行活化，加入PEI制得氟化石墨烯-PEI，向经过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化的透明质酸中逐滴加入氟化石墨烯-PEI，得到最终产物。
附图说明
图1为实施例1-3过程中制得的氟化石墨烯(未经过透明质酸修饰，分别记为氟化石墨烯1-3)的红外检测谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1)将烧杯在冰水浴中降温到0℃，加入磁子，用量筒量取20mL的浓硫酸加到250mL烧杯中；接着称取0.5g鳞片石墨粉与0.2g硝酸钠加入烧杯；然后进行超声，持续20min；
2)将步骤1)中烧杯置于磁力搅拌水浴锅中在400rpm的转速下搅拌20min，保持反应温度低于10℃，然后在电子天平上称取2g高锰酸钾，在25min内分批次缓慢加入；该阶段反应1.5h；
3)将步骤2)中水浴锅温度升至35℃，反应25min；
4)量取70mL去离子水，经过冰水浴降温至0℃后，慢慢加到步骤3)中烧杯内；然后调节步骤3)水浴锅温度至90℃左右后，在搅拌辅助下继续反应25min；
5)向步骤4)中烧杯加入50mL的蒸馏水中止反应，再加入20mL体积分数为25％的H2O2溶液，继续搅拌反应15min；
6)用量筒量取30mL体积分数为8％的HCl溶液，然后将其加到步骤5)中烧杯。将产物在烧杯中静置4d，每1d除去上清液，加入等量去离子水；
7)先用滴管除去步骤6)中烧杯里的上清液，再取下层粘稠液使用高速离心机，分别在4000rpm，6000rpm，8000rpm，10000rpm，12000rpm下离心10min，每次离心后除去离心管中上清液并加入等量去离子水，至氧化石墨烯粘稠液呈中性，将离心管内的粘稠液倒入蒸发皿中，冷冻干燥24h得到氧化石墨烯片；
8)将步骤7)中氧化石墨烯片研磨成粉末；
9)向100mL烧瓶中加入0.5g步骤8)中氧化石墨烯和20mL的二氯甲烷或1，2-二氯乙烷，并放入磁子；搅拌10h使其均匀分散；
10)向步骤9)中烧瓶滴加0.5mL的氟化剂二乙氨基三氟化硫，然后在室温下超声处理4h，搅拌反应24h；
11)向步骤10)中烧瓶加入15mL甲醇终止反应后，过滤得到部分氟化石墨烯产物，并用乙醇和去离子水充分洗涤，放入50℃烘箱中干燥一晚；
12)称取25mg步骤11)中的部分氟化石墨烯分散在45mL去离子水中，利用超声波细胞粉碎机630W功率下超声波处理2.5h得到均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯溶液；
13)取1g的氢氧化钠和1.2g的次氯酸钠加入至盛有步骤12)中部分氟化石墨烯溶液，使用超声清洗仪，在550W功率下超声3h；
14)对步骤13)中超声后溶液进行离心并除去上清液，再加入去离子水得到均匀分散液，加入稀盐酸至pH为中性，将分散液装入规格为11000D的透析袋中置于去离子水中透析48h，冷冻干燥；
15)称取20mg氟化石墨烯分散在5ml DMSO中，加入10ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化搅拌反应3h；
16)另称取35mg PEI溶解在15ml DMSO中，在搅拌的情况下，将PEI溶液逐滴加入已活化的氟化石墨烯溶液中，在室温条件下超声搅拌反应24h，透析除去未反应的杂质，冷冻干燥；
17)称取0.1g透明质酸溶解在5ml蒸馏水中，并加入适量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化搅拌反应3h；
18)称取20mg氟化石墨烯-PEI溶解于5ml蒸馏水中，在搅拌的情况下，将氟化石墨烯-PEI溶液逐滴加入到活化过的透明质酸溶液中，在室温条件下搅拌反应24h。透析除去未反应的杂质；
19)使用pH＝8的碳酸氢钠溶液对步骤18)中所得溶液透析处理，每3h换一次水，48h后将其转移至去离子水中继续透析24h；透析袋规格为MWCO＝8000D；
20)采用旋转蒸发法去除溶液中的水分，置于35℃下干燥，得到透明质酸修饰氟化石墨烯具有靶向功能的药物载体。
实施例2
1)将烧杯在冰水浴中降温到0℃，加入磁子，用量筒量取23mL的浓硫酸加到250mL烧杯中；接着称取1.25g鳞片石墨粉与0.6g硝酸钠加入烧杯；然后进行超声，持续25min；
2)将步骤1)中烧杯置于磁力搅拌水浴锅中，在600rpm的转速下搅拌30min，保持反应温度低于10℃，然后在电子天平上称取3g高锰酸钾，在28min内分批次缓慢加入；该阶段反应2h；
3)将步骤2)中水浴锅温度升至38℃，反应28min；
4)量取100mL去离子水，经过冰水浴降温至0℃后，慢慢加到步骤3)中烧杯内；然后调节步骤3)水浴锅温度至93℃左右后，在搅拌辅助下继续反应27min；
5)向步骤4)中烧杯加入60mL的蒸馏水中止反应，再加入25mL体积分数为30％的H2O2溶液，继续搅拌反应18min；
6)用量筒量取40mL体积分数为10％的HCl溶液，然后将其加到步骤5)中烧杯。将产物在烧杯中静置4.5d，每1.5d除去上清液，加入等量去离子水；
7)先用滴管除去步骤6)中烧杯里的上清液，再取下层粘稠液使用高速离心机，分别在4000rpm，6000rpm，8000rpm，10000rpm，12000rpm下离心10min，每次离心后除去离心管中上清液并加入等量去离子水，至氧化石墨烯粘稠液呈中性，将离心管内的粘稠液倒入蒸发皿中，冷冻干燥36h得到氧化石墨烯片；
8)将步骤7)中氧化石墨烯片研磨成粉末；
9)向100mL烧瓶中加入1g步骤8)中氧化石墨烯和30mL的二氯甲烷或1，2-二氯乙烷，并放入磁子；搅拌12h使其均匀分散；
10)向步骤9)中烧瓶滴加0.8mL的氟化剂二乙氨基三氟化硫，然后在室温下超声处理5h，搅拌反应36h；
11)向步骤10)中烧瓶加入23mL甲醇终止反应后，过滤得到部分氟化石墨烯产物，并用乙醇和去离子水充分洗涤，放入60℃烘箱中干燥一晚；
12)称取28mg步骤11)中的部分氟化石墨烯分散在53mL去离子水中，利用超声波细胞粉碎机630W功率下超声波处理2.5h得到均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯溶液；
13)取1.3g的氢氧化钠和1.3g的次氯酸钠加入至盛有步骤12)中部分氟化石墨烯溶液，使用超声清洗仪，在570W功率下超声3.5h；
14)对步骤13)中超声后溶液进行离心并除去上清液，再加入去离子水得到均匀分散液，加入稀盐酸至pH为中性，后将分散液装入规格为12000D的透析袋中置于去离子水中透析60h，冷冻干燥；
15)称取25mg氟化石墨烯分散在8ml DMSO中，加入13ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化搅拌反应4h；
16)另称取38mg PEI溶解在20ml DMSO中，在搅拌的情况下，将PEI溶液逐滴加入已活化的氟化石墨烯溶液中，在室温条件下超声搅拌反应30h，透析除去未反应的杂质，冷冻干燥；
17)称取0.11g透明质酸溶解在8ml蒸馏水中，并加入适量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化搅拌反应4h；
18)称取25mg氟化石墨烯-PEI溶解于10ml蒸馏水中，在搅拌的情况下，将氟化石墨烯-PEI溶液逐滴加入到活化过的透明质酸溶液中，在室温条件下搅拌反应30h。透析除去未反应的杂质；
19)使用pH＝8的碳酸氢钠溶液对步骤18)中所得溶液透析处理，每3.5h换一次水，56h后将其转移至去离子水中继续透析30h；透析袋规格为MWCO＝11000D；
20)采用旋转蒸发法去除溶液中的水分，置于40℃下干燥，得到透明质酸修饰氟化石墨烯具有靶向功能的药物载体。
实施例3
1)将烧杯在冰水浴中降温到0℃，加入磁子，用量筒量取25mL的浓硫酸加到250mL烧杯中；接着称取2g鳞片石墨粉与1g硝酸钠加入烧杯；然后进行超声，持续30min；
2)将步骤1)中烧杯置于磁力搅拌水浴锅中，在800rpm的转速下搅拌40min，保持反应温度低于10℃，然后在电子天平上称取4g高锰酸钾，在30min内分批次缓慢加入；该阶段反应2.5h；
3)将步骤2)中水浴锅温度升至40℃，反应30min；
4)量取120mL去离子水，经过冰水浴降温至0℃后，慢慢加到步骤3)中烧杯内；然后调节步骤3)水浴锅温度至95℃左右后，在搅拌辅助下继续反应30min；
5)向步骤4)中烧杯加入70mL的蒸馏水中止反应，再加入30mL体积分数为30％的H2O2溶液，继续搅拌反应20min；
6)用量筒量取50mL体积分数为12％的HCl溶液，然后将其加到步骤5)中烧杯。将产物在烧杯中静置5d，每2d除去上清液，加入等量去离子水；
7)先用滴管除去步骤6)中烧杯里的上清液，再取下层粘稠液使用高速离心机，分别在4000rpm，6000rpm，8000rpm，10000rpm，12000rpm下离心10min，每次离心后除去离心管中上清液并加入等量去离子水，至氧化石墨烯粘稠液呈中性，将离心管内的粘稠液倒入蒸发皿中，冷冻干燥48h得到氧化石墨烯片；
8)将步骤7)中氧化石墨烯片研磨成粉末；
9)向100mL烧瓶中加入1.5g步骤8)中氧化石墨烯和40mL的二氯甲烷或1，2-二氯乙烷，并放入磁子；搅拌14h使其均匀分散；
10)向步骤9)中烧瓶滴加1mL的氟化剂二乙氨基三氟化硫，然后在室温下超声处理6h，搅拌反应72h；
11)向步骤10)中烧瓶加入30mL甲醇终止反应后，过滤得到部分氟化石墨烯产物，并用乙醇和去离子水充分洗涤，放入70℃烘箱中干燥一晚；
12)称取30mg步骤11)中的部分氟化石墨烯分散在60mL去离子水中，：利用超声波细胞粉碎机630W功率下超声波处理3h得到均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯溶液；
13)取1.5g的氢氧化钠和1.5g的次氯酸钠加入至盛有步骤12)中部分氟化石墨烯溶液，使用超声清洗仪，在600W功率下超声4h；
14)对步骤13)中超声后溶液进行离心并除去上清液，再加入去离子水得到均匀分散液，加入稀盐酸至pH为中性，后将其置于去离子水中透析72h，冷冻干燥；
15)称取30mg氟化石墨烯分散在10ml DMSO中，加入15ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化搅拌反应5h；
16)另称取40mg PEI溶解在25ml DMSO中，在搅拌的情况下，将PEI溶液逐滴加入已活化的氟化石墨烯溶液中，在室温条件下超声搅拌反应36h，透析除去未反应的杂质，冷冻干燥；
17)称取0.12g透明质酸溶解在10ml蒸馏水中，并加入适量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化搅拌反应5h；
18)称取30mg氟化石墨烯-PEI溶解于15ml蒸馏水中，在搅拌的情况下，将氟化石墨烯-PEI溶液逐滴加入到活化过的透明质酸溶液中，在室温条件下搅拌反应36h。透析除去未反应的杂质；
19)使用pH＝8的碳酸氢钠溶液对步骤18)中所得溶液透析处理，每4h换一次水，60h后将其转移至去离子水中继续透析36h；透析袋规格为MWCO＝14000D；
20)采用旋转蒸发法去除溶液中的水分，置于45℃下干燥，得到透明质酸修饰氟化石墨烯具有靶向功能的药物载体。
红外检测：
对实施例1-3过程中制得的氟化石墨烯(未经过透明质酸修饰，分别记为氟化石墨烯1-3)进行红外检测，氟化石墨烯和氧化石墨烯的结构通过傅里叶变换红外光谱分析结果如图1所示，由该分析结果可以看到原料氧化石墨烯中出现了三个吸收峰，它们分别以3430cm-1及1730cm-1与1630cm-1为中心，通过分析可以确定3430cm-1处的吸收峰为羧基和羟基O-H的伸缩振动。1730cm-1处的吸收峰可以判定为羧基和酮基中的C＝O的伸缩振动。1630cm-1处的吸收峰也为C＝C的伸缩振动。这个结果表明由石墨烯到氧化石墨烯的转化是成功的。
对比氟化石墨烯与氧化石墨烯的红外谱图可以发现，它们在1221cm-1出现了一个新的吸收峰，可以判定为C-F的特征振动，同时这三个样品仍然存在以3430cm-1及1730cm-1与1630cm-1为中心的吸收峰，这说明氟化石墨烯中还是存在这O-H、C＝O等这些含氧基团的，这也表明并不是所有的含氧官能团都转化为了含氟官能团。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。