阅读说明：本技术 保肝中药组合物及其提取物和制药用途 (Liver-protecting traditional Chinese medicine composition, extract and pharmaceutical application thereof ) 是由 高月求 单俊杰 孙学华 李曼 陈彦旭 周振华 高亚婷 麻浩 张鑫 徐锐 聂丹 于 2018-08-03 设计创作，主要内容包括：本申请涉及保肝中药组合物及其提取物和制药用途。其中,所述中药组合物含有以下组分：巴戟天、灵芝、黄芪、猫爪草、苦参和丹参。所述中药组合物及其提取物具有抗肝损伤和免疫调节的作用,可用于治疗肝脏疾病,例如慢性乙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、代偿期肝硬化、肝癌(尤其是慢性乙型肝炎导致的原发性肝癌)及药物或毒物等引发的肝损伤,也可用作疫苗佐剂或免疫调节剂。(The application relates to a liver-protecting traditional Chinese medicine composition, an extract and a pharmaceutical application thereof. Wherein, the traditional Chinese medicine composition comprises the following components: morinda officinalis, Ganoderma lucidum, Astragalus membranaceus, Ranunculus ternatus, Sophora flavescens and Salvia miltiorrhiza. The Chinese medicinal composition and the extract thereof have the effects of resisting liver injury and regulating immunity, can be used for treating liver diseases, such as chronic hepatitis B, non-alcoholic steatohepatitis, hepatic fibrosis, compensatory liver cirrhosis, liver cancer (especially primary liver cancer caused by chronic hepatitis B) and liver injury caused by medicaments or poisons, and can also be used as vaccine adjuvants or immunomodulators.)

保肝中药组合物及其提取物和制药用途

技术领域

本申请涉及中药领域，具体涉及一种具有抗肝损伤和免疫调节作用的中药组合物，其主要包括巴戟天、灵芝、黄芪、猫爪草、苦参和丹参。所述中药组合物可用于治疗肝脏疾病，例如慢性乙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、代偿期肝硬化或肝癌(尤其是慢性乙型肝炎导致的原发性肝癌)，也可作为疫苗佐剂或免疫调节剂。

背景技术

肝脏是维持人体新陈代谢的重要脏器，对生物合成、生物转化、解毒、分泌、免疫等各生理功能起着重要作用。然而，当肝脏受病毒感染、毒物、用药不慎、不良饮食习惯或其它致病原因会导致肝功能受损肝损伤，如病毒性肝炎、非酒精性和酒精性肝病、肝纤维化、肝硬化、肝癌、药物性肝炎等肝病。

中医学认为肝属五脏之一，其主要生理功能是藏血，主疏泄，主筋华爪，开窍于目，于胆相表里。肝有贮藏血液和调节血量的功能，《素问·五脏生成篇》说:“故人卧血归于肝，肝受血而能视，足受血而能步，掌受血而能握，指受血而能摄。”病理上，如肝血不足，肝不藏血，常可见易倦乏力、不耐劳累，双目干涩，视物昏花，以及呕血、便血、鼻出血等。肝主疏泄，可调达气血，使气血环流不休，从而保证各个脏腑活动的正常进行。若肝气抑郁，气机不畅，则气滞血瘀；脾胃的消化吸收功能与肝的疏泄功能有密切的关系。如肝失疏泄，可影响到脾胃的消化，从而出现消化功能不良的病变。除了出现胸胁胀痛、急躁易怒等肝气抑郁的症状外，常常有嗳气呕恶、腹胀腹泻的症状。肝与胆互为表里关系，肝的疏泄功能正常与否，直接影响胆汁的分泌、***，若其疏泄正常，则胆汁循常道而行；反之，则胆汁既可上逆，亦可外溢而造成病变，如口苦、黄疸等。肝藏血，肾藏精，肝血有赖于肾精的滋养，肾精也不断得到肝血所化之精的填充，精与血是相互滋生的，所以有“肝肾同源”之说。在病理上，肾精与肝血的病变亦常相互影响，如肾精亏损，可导致肝血不足；肝血不足，也可引起肾精亏损，而出现腰脊酸疼、遗精、耳鸣、目眩、头晕及眼干涩等症。若肝阳上亢，或肝火旺，也可耗竭肾阴，形成肾阴不足病症。脾胃的升降、运化，有赖于肝气的疏泄。肝藏血，脾统血、主运化而为气血生化之源，肝脾相互协调，则可共同完成血液的正常运行。病理上，若肝郁气滞，疏泄失常，脾胃升降运化功能受损，就会出现：“肝胃不和”；“肝脾不和”的证候。临床常见生气以后，胸胁痞满、腹胀纳呆、暖气呕恶、倦怠乏力、大便失常。反之，脾病也影响于肝。如脾气不足，血乏生化之源；或脾不统血，失血过多，形成肝血不足。又如脾失健运，水湿内停，日久蕴而成熟，湿热郁蒸使肝胆疏泄不利可形成黄疸。由此可见，肝病传脾，脾病及肝，肝脾两脏在病理上常相互影响。心主血，肝藏血，血脉充盈，则心有所主，肝有所藏。肝气开发，肺气肃降，相互配合以维持人体气机的功能正常。综上所述，肝胆相连，脾胃相通，上系心肺，下及肾水，三焦通畅，人即安和，故现代学者研究肝病治法，重在调理脾胃，滋水涵木，畅达气机，平调阴阳，方能达到肝病治愈的目的。

中医学认为外感湿热或疫毒之邪、内伤情志、饮食、过劳等是慢性肝病的主要病因，慢性肝病的病位主要在肝，常多涉及脾、肾两脏及胆、胃、三焦等腑。病性属本虚标实，虚实夹杂。由于慢性肝病的病因、病机、病位、病性复杂多变，病情交错难愈，故应辨明“湿、热、瘀、毒之邪实与肝、脾、肾之正虚”两者之间的关系，治疗时应注意以人为本，正确处理扶正与祛邪，重点调整阴阳、气血、脏腑功能平衡。

在中医理论指导下，本发明人经过长期的临床与现代药理研究，证实补肾健脾利湿兼活血是治疗慢性乙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化(代偿期肝硬化)、乙肝导致原发性肝癌等慢性肝病的基础治法，从而得出本申请所述的中药组合物，由此完成了本申请。

发明内容

因此，在一个方面，本申请提供一种中药组合物，其含有以下组分：巴戟天、灵芝、黄芪、猫爪草、苦参和丹参。在某些优选的实施方案中，所述各组分的重量配比为：巴戟天15-35份，灵芝10-20份，黄芪25-35份，猫爪草10-20份，苦参10-20份，丹参10-20份。在某些优选的实施方案中，所述各组分的重量配比为：巴戟天30份，灵芝15份，黄芪30份，猫爪草15份，苦参15份，丹参15份。

方剂中，巴戟天温阳补肾兼补肾阴，为君药；臣以灵芝、黄芪益气健脾，以“肝肾同补、先天后天同调”，脾肾双补；佐以苦参、猫爪草清热、利湿和解毒，以“清除余邪”；以丹参行气活血，引药归经。全方合用，补肾健脾为治病之本，清热利湿为治病之标，标本兼治，兼顾行气活血，以固本回元、湿毒得清，诸症得解，疾病向愈。

在某些优选的实施方案中，所述中药组合物进一步含有下述组分中的一种或多种(例如2-10种，例如2-6种，例如2、3、4、5或6种)：仙灵脾、地黄、白术、青皮、垂盆草、葛根、枳椇子、葛花、泽兰、片姜黄、炙鳖甲、石斛、山慈菇、鸡骨草、莪术和半枝莲。

在某些优选的实施方案中，所述中药组合物进一步含有下述组分：仙灵脾、地黄、白术和青皮。在某些优选的实施方案中，所述各组分重量配比为：巴戟天15-35份，灵芝10-20份，黄芪25-35份，猫爪草10-20份，苦参10-20份，丹参10-20份，仙灵脾10-30份，地黄5-15份，白术10-30份，青皮5-10份。在某些优选的实施方案中，所述各组分重量配比为：巴戟天30份，灵芝15份，黄芪30份，猫爪草15份，苦参15份，丹参15份，仙灵脾15份，地黄10份，白术15-30份，青皮9-10份。

药理学研究证明，上述方剂可明显改善ConA和LPS致Balb/C肝损伤模型小鼠肝脏肿大等症状，并可抑制肝细胞坏死以及炎症细胞聚集，增加肝细胞的***和增生；可明显促进肝细胞增殖；也可有效抑制乙肝病毒抗原HBsAg、HBeAg的分泌；另外，其具有明显的免疫调节作用，例如对小鼠脾细胞有显著的促增殖活性，可促进T细胞和B细胞的增殖；并可促进小鼠脾细胞分泌IFN-γ、TNF-α。在临床试验中，所述方剂可明显改善HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者常见症状、显著提高患者血清ALT和AST复常率。可用于治疗肝脏疾病(例如慢性乙型肝炎)和肝损伤(尤其是药物或毒物引发的肝损伤)，并可作为免疫佐剂或免疫调节剂。

在某些优选的实施方案中，所述中药组合物进一步含有下述组分：垂盆草和葛根。在某些优选的实施方案中，所述各组分重量配比为：巴戟天15-35份，灵芝10-20份，黄芪25-35份，猫爪草10-20份，苦参10-20份，丹参10-20份，垂盆草15-30份，葛根15-30份。在某些优选的实施方案中，所述各组分重量配比为：巴戟天30份，灵芝15份，黄芪30份，猫爪草15份，苦参10份，丹参15份，垂盆草30份，葛根30份。

药理学研究表明，上述方剂可促进肝细胞增殖，具有明显的免疫调节作用，例如对小鼠脾细胞有显著的促增殖活性，可促进T细胞和B细胞的增殖。在临床试验中，所述方剂可显著提高非酒精性脂肪肝炎患者肝功能，降低血脂水平，改善肝/脾CT值分级。可用于治疗肝脏疾病(例如非酒精性脂肪肝炎)和肝损伤(尤其是药物或毒物引发的肝损伤)，并可作为免疫佐剂或免疫调节剂。

在某些优选的实施方案中，所述中药组合物进一步含有下述组分：垂盆草、葛根、枳椇子和葛花。在某些优选的实施方案中，所述各组分重量配比为：巴戟天15-35份，灵芝10-20份，黄芪25-35份，猫爪草10-20份，苦参10-20份，丹参10-20份，垂盆草15-30份，葛根15-30份，枳椇子15-30份，葛花10-20份。在某些优选的实施方案中，所述各组分重量配比为：巴戟天30份，灵芝15份，黄芪30份，猫爪草15份，苦参10份，丹参15份，垂盆草30份，葛根30份，枳椇子30份，葛花15份。

药理学研究表明，上述方剂可促进肝细胞增殖，具有明显的免疫调节作用，例如对小鼠脾细胞有显著的促增殖活性，可促进T细胞和B细胞的增殖。在临床试验中，可显著降低酒精性脂肪肝炎患者ALT、AST、GGT、总胆固醇水平，明显改善中医症候中乏力、纳差等症状。可用于治疗肝脏疾病(例如酒精性脂肪肝炎)和肝损伤(尤其是药物或毒物引发的肝损伤)，并可作为免疫佐剂或免疫调节剂。

在某些优选的实施方案中，所述中药组合物进一步含有下述组分：泽兰、片姜黄、炙鳖甲和石斛。在某些优选的实施方案中，所述各组分重量配比为：巴戟天15-35份，灵芝10-20份，黄芪25-35份，猫爪草10-20份，苦参10-20份，丹参10-20份，泽兰10-20份，片姜黄10-20份，炙鳖甲10-20份，石斛10-20份。在某些优选的实施方案中，所述各组分重量配比为：巴戟天30份，灵芝15份，黄芪30份，猫爪草15份，苦参10份，丹参15份，泽兰15份，片姜黄15份，炙鳖甲15份，石斛15份。

药理学研究表明，上述方剂可促进肝细胞增殖，具有明显的免疫调节作用，例如对小鼠脾细胞有显著的促增殖活性，可促进T细胞和B细胞的增殖。在临床试验中，可显著降低肝纤维化患者HBeAg水平，改善脂肪炎症分级。并且，可显著降低乙型肝炎肝硬化代偿期患者CTP评分，提高CLDQ积分。可用于治疗肝脏疾病(例如肝纤维化和肝硬化代偿期)和肝损伤(尤其是药物或毒物引发的肝损伤)，并可作为免疫佐剂或免疫调节剂。

在某些优选的实施方案中，所述中药组合物进一步含有下述组分：山慈菇、鸡骨草、莪术、白术和半枝莲。在某些优选的实施方案中，所述各组分重量配比为：巴戟天15-35份，灵芝10-20份，黄芪25-35份，猫爪草10-20份，苦参10-20份，丹参10-20份，山慈菇5-10份，鸡骨草15-30份，莪术5-10份，白术20-30份，半枝莲10-20份。在某些优选的实施方案中，所述各组分重量配比为：巴戟天30份，灵芝15份，黄芪30份，猫爪草15份，苦参10份，丹参15份，山慈菇6份，鸡骨草15份，莪术6份，白术15份，半枝莲15份。

药理学研究表明，上述方剂可促进肝细胞增殖，具有明显的免疫调节作用，例如对小鼠脾细胞有显著的促增殖活性，可促进T细胞和B细胞的增殖。在临床试验中，所述方剂可显著延长原发性肝癌患者生存期，降低复发率，并改善原发性肝癌术后患者中主要中医证候。可用于治疗肝脏疾病(例如肝癌，尤其是慢性乙型肝炎导致的原发性肝癌)和肝损伤(尤其是药物或毒物引发的肝损伤)，并可作为免疫佐剂或免疫调节剂。

在另一个方案，本申请通过一种中药提取物A，其通过以下方法制备得到：

将上述中药组合物中的各组分混合、加水煎煮，得水煎液；

将所述水煎液浓缩得浓缩液，即为所述中药提取物A。

在某些优选的实施方案中，所加水的体积为所述组分重量的5-20倍(以L：Kg计)(例如5、10、15或20倍)。

在某些优选的实施方案中，在加水煎煮前，还包括将所述各组分粉碎的步骤。

在某些优选的实施方案中，在粉碎后，还包括过筛(例如20目筛)的步骤。

在某些优选的实施方案中，在浓缩前，还包括将所述水煎液过滤和/或离心的步骤。

在某些优选的实施方案中，还包括将所述浓缩液干燥(例如冷冻干燥)的步骤。

在另一个方面，本申请提供一种中药提取物B，其通过以下方法制备得到：

将上述浓缩液加乙醇静置沉淀12-72h(例如12h、24h、36h、48h或72h)；

收集上清液，浓缩，得所述中药提取物B。

在某些优选的实施方案中，所加乙醇的体积为所述浓缩液体积的1-10倍(以L：Kg计)(例如2、3、5、8或10倍)。

在某些优选的实施方案中，在静置沉淀后收集上清液前，还包括离心的步骤。

在某些优选的实施方案中，在浓缩后，还包括干燥的步骤。

在另一个方面，本申请提供一种中药提取物C，其通过以下方法制备得到：

将前述浓缩液加乙醇静置沉淀12-72h(例如12h、24h、36h、48h或72h)；

收集沉淀并少量、多次溶于水中，透析截留分子量>1000Da的部分，浓缩，得所述中药提取物B。

在某些优选的实施方案中，所加乙醇的体积为所述浓缩液体积的1-10倍(例如2、3、5、8或10倍)。

在某些优选的实施方案中，所加水的总体积为药材重量的1-3倍(以L：kg计))。

在某些优选的实施方案中，在浓缩后，还包括干燥的步骤。

在另一个方面，本申请提供一种药物组合物，其含有前述的中药组合物或中药提取物，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

所述药学上可接受的载体是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。

在本申请的药物组合物中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。

当所述药物组合物通过静脉内给药时，水是示例性载体。还可以使用生理盐水和葡萄糖及甘油水溶液作为液体载体，特别是用于注射液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述药物组合物还可以视需要包含少量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。

口服制剂可以包含标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药学上可接受的载体的实例如在Remington’s PharmaceuticalSciences(1990)中所述。

本申请的药物组合物可以系统地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以适合的途径给药，例如通过注射、静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内或经皮给药；或通过口服、含服、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药。

对于这些给药途径，可以适合的剂型给药本申请的药物组合物。所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、汤剂、口服液、散剂、茶剂、酒剂、粒剂、丸剂、浸膏剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物可制成汤剂、口服液、茶剂、酒剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、散剂、丸剂或浸膏剂。

在另一个方面，本申请提供一种联合用药，其包括前述的中药组合物、中药提取物或药物组合物，以及一种或多种抗病毒药物。

在某些优选的实施方案中，所述抗病毒药物为核苷类抗病毒药物。在某些优选的实施方案中，所述抗病毒药物选自恩替卡韦、替诺福韦、替比夫定、阿德福韦和拉米夫定，优选为恩替卡韦。

在另一个方面，本申请提供一种佐剂或免疫调节剂，其含有前述的中药组合物、中药提取物或药物组合物。

所述佐剂是指，能够非特异性地增强对抗原免疫应答的物质，其先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。

所述免疫调节剂是指，能调节、平衡并恢复机体免疫功能的一类制剂，常用的免疫调节剂有免疫促进剂、免疫抑制剂和免疫双向调节剂三大类。

在另一个方面，本申请提供前述的中药组合物、中药提取物、药物组合物或联合用药在制备治疗肝损伤或肝脏疾病的药物中的用途。

在另一个方面，本申请提供前述的中药组合物、中药提取物、药物组合物或联合用药，其用于治疗肝损伤或肝脏疾病。

在另一个方面，本申请提供一种治疗肝损伤或肝脏疾病的方法，其包括向有此需要的个体施用有效量的前述的中药组合物、中药提取物、药物组合物或联合用药的步骤。

所述有效是指给药后会在一定程度上缓解所治疗疾病的一或多种症状的化合物的量。本申请所述中药组合物、中药提取物或药物组合物的剂量主要取决于所治疗的个体、病症或病况的严重性、给药的速率及处方医师的判断。一般而言，有效剂量在每日130-200g药材/日每kg体重。在一些情况下，不高于前述范围的下限的剂量水平可以是足够的，而在其它情况下，仍可在不引起任何有害副作用的情况下采用较大剂量，条件是首先将所述较大剂量分成数个较小剂量以在一整天中给药。

所述治疗(treating)意指逆转、减轻、抑制所述的疾病或症状或者这样的病疾病或症状中的一或多种症状的进展，或预防疾病或症状的一或多种症状。

所述个体包括人或非人的动物。示例性人个体包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的个体(称为患者)或正常个体。所述非人的动物包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。

某些优选的实施方案中，所述肝脏疾病选自慢性肝炎(例如慢性乙型肝炎)、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、代偿期肝硬化、肝癌(尤其是慢性乙型肝炎导致的原发性肝癌)。

在某些优选的实施方案中，所述肝损伤为药物或毒物引发的肝损伤。

前述的中药组合物、中药提取物或药物组合物作为佐剂或免疫调节剂的用途。

发明的有益效果

本申请提供一种具有抗肝损伤和免疫调节作用的中药组合物，其主要包括巴戟天、灵芝、黄芪、猫爪草、苦参和丹参。所述中药组合物具有治疗肝脏疾病、抗肝损伤和免疫调节的作用。药理学研究表明，在某些优选的实施方案中，本申请的中药组合物具有明显抗肝脏炎症损伤和氧化损伤，促进肝细胞再生，抑制肝细胞分泌HBsAg和HBeAg，并在一定程度上可抑制乙肝病毒复制。可用于治疗肝脏疾病，例如慢性肝炎(例如慢性乙型肝炎)、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、代偿期肝硬化或肝癌(尤其是慢性乙型肝炎导致的原发性肝癌)，抗肝损伤(尤其是药物或毒物引发的肝损伤)，也可用作免疫调节剂或疫苗佐剂。

附图说明

图1显示了实施例21制备的复方干浸膏对ConA诱导小鼠肝脏损伤的病理影响分析。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：汤剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参15g，猫爪草15g，丹参15g，仙灵脾15g，地黄10g，白术15g，青皮10g。混合后，加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V，kg/L，下同)，合并煎煮液，可制成汤剂。

实施例2：汤剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，垂盆草30g，葛根30g。混合后，加水煎煮2次，每次加入10倍水(W/V)，合并煎煮液，可制成汤剂。

实施例3：汤剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，垂盆草30g，葛根30g，枳椇子30g，葛花15g。混合后，加水煎煮2次，每次加入10倍水(W/V)，合并煎煮液，可制成汤剂。

实施例4：汤剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，泽兰15g，片姜黄15g，炙鳖甲15g，石斛15g。混合后，加水煎煮2次，每次加入10倍水(W/V)，合并煎煮液，可制成汤剂。

实施例5：汤剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，山慈菇6g，鸡骨草15g，莪术6g，白术15g，半枝莲15g。混合后，加水煎煮2次，每次加入10倍水(W/V)，合并煎煮液，可制成汤剂。

实施例6：颗粒剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参15g，猫爪草15g，丹参15g，仙灵脾15g，地黄10g，白术15g，青皮10g。混合和粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心，上清液浓缩至清膏，加入蔗糖和其它辅料，造粒，干燥，制成颗粒剂。

实施例7：颗粒剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，垂盆草30g，葛根30g。混合和粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心，上清液浓缩至清膏，加入蔗糖和其它辅料，造粒，干燥，制成颗粒剂。

实施例8：颗粒剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，垂盆草30g，葛根30g，枳椇子30g,葛花15g。混合和粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心，上清液浓缩至清膏，加入蔗糖和其它辅料，造粒，干燥，制成颗粒剂。

实施例9：颗粒剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，泽兰15g，片姜黄15g，炙鳖甲15g，石斛15g。混合和粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心，上清液浓缩至清膏，加入蔗糖和其它辅料，造粒，干燥，制成颗粒剂。

实施例10：颗粒剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，山慈菇6g，鸡骨草15g，莪术6g，白术15g，半枝莲15g。混合和粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心(3000r/min)，上清液浓缩至清膏，加入蔗糖和其它辅料，造粒，干燥，制成颗粒剂。

实施例11：片剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参15g，猫爪草15g，丹参15g，仙灵脾15g，地黄10g，白术15g，青皮10g。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)煎煮1.5小时。合并煎煮液，过滤，滤液浓缩至稠膏，再加入微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁适量，混合均匀。加入5％PVPK30溶液，边加边搅拌制得软材，过16目筛制粒、压片和包衣，制得片剂。

实施例12：片剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，垂盆草30g，葛根30g。加水煎煮2次，每次加入8倍水(W/V)煎煮1.5小时。合并煎煮液，过滤，滤液浓缩至稠膏，再加入微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁适量，混合均匀。加入5％PVPK30溶液，边加边搅拌制得软材，过16目筛制粒、压片和包衣，制得片剂。

实施例13：片剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，垂盆草30g，葛根30g，枳椇子30g,葛花15g。加水煎煮2次，每次加入8倍水(W/V)煎煮1.5小时。合并煎煮液，过滤，滤液浓缩至稠膏，再加入微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁适量，混合均匀。加入5％PVPK30溶液，边加边搅拌制得软材，过16目筛制粒、压片和包衣，制得片剂。

实施例14：片剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，泽兰15g，片姜黄15g，炙鳖甲15g，石斛15g。加水煎煮2次，每次加入8倍水(W/V)煎煮1.5小时。合并煎煮液，过滤，滤液浓缩至稠膏，再加入微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁适量，混合均匀。加入5％PVPK30溶液，边加边搅拌制得软材，过16目筛制粒、压片和包衣，制得片剂。

实施例15：片剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，山慈菇6g，鸡骨草15g，莪术6g，白术15g，半枝莲15g。加水煎煮2次，每次加入8倍水(W/V)煎煮1.5小时。合并煎煮液，过滤，滤液浓缩至稠膏，再加入微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁适量，混合均匀。加入5％PVPK30溶液，边加边搅拌制得软材，过16目筛制粒、压片和包衣，制得片剂。

实施例16：胶囊剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参15g，猫爪草15g，丹参15g，仙灵脾15g，地黄10g，白术15g，青皮10g。加水煎煮2次，每次加入10倍水(W/V)煎煮2小时。合并煎煮液，过滤，滤液浓缩至稠膏，低温干燥，加入辅料适量，混合均匀，干燥，装入胶囊，即制备成胶囊剂。

实施例17：胶囊剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，垂盆草30g，葛根30g。加水煎煮2次，每次加入10倍水(W/V)煎煮2小时。合并煎煮液，过滤，滤液浓缩至稠膏，低温干燥，加入辅料适量，混合均匀，装入胶囊，即制备成胶囊剂。

实施例18：胶囊剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，垂盆草30g，葛根30g，枳椇子30g,葛花15g。加水煎煮2次，每次加入10倍水(W/V)煎煮2小时。合并煎煮液，过滤，滤液浓缩至稠膏，低温干燥，加入辅料适量，混合均匀，装入胶囊，即制备成胶囊剂。

实施例19：胶囊剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，泽兰15g，片姜黄15g，炙鳖甲15g，石斛15g。加水煎煮2次，每次加入10倍水(W/V)煎煮2小时。合并煎煮液，过滤，滤液浓缩至稠膏，低温干燥，加入辅料适量，混合均匀，装入胶囊，即制备成胶囊剂。

实施例20：胶囊剂的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，山慈菇6g，鸡骨草15g，莪术6g，白术15g，半枝莲15g。加水煎煮2次，每次加入10倍水(W/V)煎煮2小时。合并煎煮液，过滤，滤液浓缩至稠膏，低温干燥，加入辅料适量，混合均匀，装入胶囊，即制备成胶囊剂。

实施例21：复方干浸膏的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参15g，猫爪草15g，丹参15g，仙灵脾15g，地黄10g，白术15g，青皮10g。混合和粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心，上清液浓缩至清膏，进行冷冻干燥或喷雾干燥，获得水煎液的干浸膏。

实施例22：复方干浸膏的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，垂盆草30g，葛根30g。混合和粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心，上清液浓缩至清膏，进行冷冻干燥，获得水煎液的干浸膏。

实施例23：复方干浸膏的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，垂盆草30g，葛根30g，枳椇子30g,葛花15g。混合和粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心(3000r/min)，上清液浓缩至清膏，进行冷冻干燥，获得水煎液的干浸膏。

实施例24：复方干浸膏的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，仙灵脾15g，地黄10g，白术30g，青皮9g。混合和粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心(3000r/min)，上清液浓缩至清膏，进行冷冻干燥，获得水煎液的干浸膏。

实施例25：复方干浸膏的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，山慈菇6g，鸡骨草15g，莪术6g，白术15g，半枝莲15g。混合和粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心(3000r/min)，上清液浓缩至清膏，进行冷冻干燥，获得水煎液的干浸膏。

实施例26：复方醇沉上清干浸膏和多糖的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参15g，猫爪草15g，丹参15g，仙灵脾15g，地黄10g，白术15g，青皮10g。粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心，上清液浓缩，然后加入浓缩液3倍体积的乙醇(V/V)，静止沉淀72小时，离心。将醇沉上清液进行减压浓缩并真空干燥，获得复方醇沉上清干浸膏。沉淀部分多次加水溶解，溶解液装入透析袋进行水透析48小时(截留分子量>1000Da)。袋内溶液浓缩，再进行冷冻干燥，制得复方多糖。

实施例27：复方醇沉上清干浸膏和多糖的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，垂盆草30g，葛根30g。粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心，上清液浓缩，然后加入浓缩液3倍体积的乙醇(V/V)，静止沉淀72小时，离心。将醇沉上清液进行减压浓缩并真空干燥，获得复方醇沉上清干浸膏。沉淀部分多次加水溶解，溶解液装入透析袋进行水透析48小时(截留分子量>1000Da)。袋内溶液浓缩，再进行冷冻干燥，制得复方多糖。

实施例28：复方醇沉上清干浸膏和多糖的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，垂盆草30g，葛根30g，枳椇子30g，葛花15g。粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心(3000r/min)，上清液浓缩，然后加入浓缩液3倍体积的乙醇(V/V)，静止沉淀72小时，离心。将醇沉上清液进行减压浓缩并真空干燥，获得复方醇沉上清干浸膏。沉淀部分多次加水溶解，溶解液装入透析袋进行水透析48小时(截留分子量>1000Da)。袋内溶液浓缩，再进行冷冻干燥，制备复方多糖。

实施例29：复方醇沉上清干浸膏和多糖的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，泽兰15g，片姜黄15g，炙鳖甲15g，石斛15g。粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心(3000r/min)，上清液浓缩，然后加入浓缩液3倍体积的乙醇(V/V)，静止沉淀72小时，离心。将醇沉上清液进行减压浓缩并真空干燥，获得复方醇沉上清干浸膏。沉淀部分多次加水溶解，溶解液装入透析袋进行水透析48小时(截留分子量>1000Da)。袋内溶液浓缩，再进行冷冻干燥，制得复方多糖。

实施例30：复方醇沉上清干浸膏和多糖的制备

按以下重量称取原料药：巴戟天30g，灵芝15g，黄芪30g，苦参10g，猫爪草15g，丹参15g，山慈菇6g，鸡骨草15g，莪术6g，白术15g，半枝莲15g。粉碎，过20目筛。加水煎煮2次，每次加入15倍水(W/V)，过滤，滤液离心(3000r/min)，上清液浓缩，然后加入浓缩液3倍体积的乙醇(V/V)，静止沉淀72小时，离心。将醇沉上清液进行减压浓缩并真空干燥，获得复方醇沉上清干浸膏。沉淀部分多次加水溶解，溶解液装入透析袋进行水透析48小时(截留分子量>1000Da)。袋内溶液浓缩，再进行冷冻干燥，制得复方多糖。

实施例31：对乙肝患者的疗效评价

1.待测样品：按实施例6方法制备的颗粒剂。

2.评价方法

病例为2012年12月-2016年3月上海中医药大学附属曙光医院肝病专科门诊的HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者，共计136例。其中男性89例，女性47例，年龄18～64岁，平均43.98岁。全部病例均符合2010年慢性乙型肝炎的诊断标准，且HBV-DNA≥10⁴和HBeAg阴性，中医辨证属肝肾不足兼湿热型，标准参照《中药新药临床研究指导原则》。采用随机方法，按照1：1的比例随机分为治疗组和对照组。其中治疗组68例，对照组68例，两组间年龄、性别构成、病程均无差异。

给药方案：治疗组和对照组均同时给予抗病毒治疗和中药治疗，疗程为30个月。

其中，抗病毒治疗：治疗组及对照组均给予恩替卡韦分散片(0.5mg/片，1片/次，1次/日，空腹，口服)进行抗病毒治疗；中药治疗：治疗组患者给予待测样品(其用量以实施例中制得的清膏计，60g清膏/日，分2次温服，早晚各1次)；对照组患者给予安慰剂(颗粒剂，为不含药的模拟制剂)，服用方法同治疗组。

3.结果

本次研究共纳入136例患者，其中治疗组68例，对照组68例，全部完成30个月的随访工作。治疗前共有79人进行了肝组织活检，治疗后有43人接受肝组织活检，完成治疗前后两次肝穿刺活检者为40人。在24周时间节点对照组失联7人，治疗组失联1人。完成96周随访为120人，治疗组60人，对照组60人。完成30个月随访，对照组为59人，治疗组为56人。

治疗30个月后，采血测定患者血清ALT和AST值，计算复常率。对照组ALT复常率为93.2％，治疗组的复常率为98.2％。治疗组HBsAg平均下降了0.187logIU/ml，对照组HBsAg平均下降了0.028logIU/ml，治疗组的下降幅度大于对照组。

根据CRF表记录的症状数据，对排名前14位的症状进行分析，其中发生率最高的症状依次为乏力、视物疲劳、腰膝酸软、急躁、目干、胁痛、失眠多梦、口苦、耳鸣、头晕、面色晦暗、善叹息、身目发黄、五心烦躁。以乏力的发生率最高，占46％；视物模糊的发生率次之，占42％；腰膝酸软发生率为40％；急躁易怒的发生率为38％；目干症状的发生率为37％；胁痛的发生率为36％；失眠、口苦、耳鸣、头晕、面色晦暗、善叹息、身目发黄、五心烦躁的发生率分别为：34％、20％、19％、16％、15％、7％、5％、3％。治疗后治疗组患者的视物疲劳、失眠多梦、乏力症状的改善情况明显优于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例32：对非酒精性脂肪性肝炎患者的疗效评价

1.待测样品：

按实施例7方法制备的颗粒剂。

2.方法

采用随机对照的试验方法，共纳入非酒精性脂肪性肝炎患者88例，随机分为治疗组(44例)和对照组(44例)，两组均在饮食、运动为干预的基础上，治疗组给予待测样品治疗(其用量以实施例中制得的清膏计，60g清膏/日，分为2次服用)，对照组以安慰剂(不含药的模拟制剂)治疗，疗程均为12周。观察患者治疗前后中医症候积分、肝功能、血脂、影像学指标(肝/脾CT值)的变化。

3.结果

(1)治疗后，治疗组患者采血，采用生化分析仪测定血清ALT、AST、GGT、TG和总胆固醇水平。结果显示治疗组较治疗前各项指标均显著降低(P<0.05或P<0.01)，治疗后治疗组和对照组的组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。具体结果见表1。

表1.两组患者治疗前后肝功能、血脂水平的变化

注：与本组治疗前比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与对照组治疗后比较，^*P<0.05。

(2)治疗后，治疗组患者的肝/脾CT值明显升高，等级明显改善(P<0.01)，治疗后两组组间比较差异有统计学意义，治疗组疗效优于对照组(P<0.01)。具体数据见表2。

表2.两组患者治疗前后肝/脾CT等级的变化

实施例33：对酒精性脂肪性肝炎患者的疗效评价

1.待测样品

按实施例8方法制备的颗粒剂。

2.方法

采用随机对照的试验方法，共纳入酒精性脂肪性肝炎患者46例，随机分为治疗组(23例)和对照组(23例)，两组均在禁酒、饮食、运动为干预的基础上，治疗组给予待测样品治疗(其用量以实施例中制得的清膏计，60g清膏/日，分为2次服用)，对照组以安慰剂(不含药的模拟制剂)治疗，疗程均为12周。观察患者治疗前后中医症候积分、肝功能、血脂、影像学指标(肝/脾CT值)的变化。

3.结果

治疗后，治疗组患者的ALT、AST、GGT、总胆固醇水平较治疗前显著降低(P<0.05或P<0.01)，治疗后两组组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。治疗组中医证候中乏力、纳差等改善明显。

实施例34：对肝纤维化患者的疗效评价

1.待测样品

按实施例9方法制备的颗粒剂。

2.方法

采用随机分组、双盲、安慰剂对照、多中心临床试验方法，收集400例CHB患者(其中95例患者治疗前后进行肝穿)，随机均分为治疗组和对照组。治疗组予恩替卡韦联合待测样品治疗(其用量以实施例中制得的清膏计，60g清膏/日，分为2次服用)，对照组予恩替卡韦联合安慰剂(不含药的模拟制剂)治疗，疗程12个月。观察两组患者HBeAg水平及肝脏病理炎症和纤维化的变化。

3.结果

(1)治疗后，两组患者HBeAg水平与治疗前比较均明显下降(P<0.001)，且治疗组HBeAg水平低于对照组(P<0.05)，治疗组的HBeAg下降幅度明显优于对照组(P<0.01)；

(2)治疗后，治疗组肝脏炎症分级≥G2的患者比例从100％降至66.67％，纤维化分期≥S3的患者比例从27.45％降至15.69％，且纤维化分期改善明显优于单用恩替卡韦的对照组(P<0.05)。

实施例35：对肝硬化代偿期患者的疗效评价

1.待测样品

按实施例9方法制备的颗粒剂。

2.方法

采用前瞻性队列研究的试验方法，共收集乙型肝炎肝硬化代偿期患者126例，其中西药+待测样品组治以待测样品(其用量以实施例中制得的清膏计，60g清膏/日，分为2次服用)叠加恩替卡韦(0.5mg/日)，待测样品组单独给予待测样品(其用量以实施例中制得的清膏计，60g清膏/日，分为2次服用)，对照组治以复方鳖甲软肝片，疗程均为12个月。观察并比较治疗前后两组患者的中医证候积分、Child-Pugh肝功能分级(CTP评分)、慢性肝病疾病特异性量表(CLDQ)评分、肝功能、前后肝穿病理的变化。

3.结果

(1)治疗后，乙型肝炎肝硬化患者的CTP评分比治疗前均有显著降低，治疗后两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，治疗组疗效优于对照组(P<0.05)(见表3)。

表3.乙型肝炎肝硬化代偿期患者治疗前后Child-Pugh分级变化(CTP评分)

注：与治疗前比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与对照组比较，*P<0.05

(2)治疗后，乙型肝炎肝硬化代偿期患者的CLDQ积分比治疗前均明显降低(P<0.01)，抗病毒患者治疗后两组比较差异有统计学意义，疗效优于对照组(P<0.05)。见表4。

表4.乙型肝炎肝硬化代偿期患者CLDQ积分治疗前后变化

注：与治疗前比较，^##P<0.01；与对照组比较，*P<0.05

实施例36：复方颗粒剂对肝癌患者的疗效评价

1.待测样品

按实施例10方法制备的颗粒剂。

2.方法

本研究从2014年9月至2017年3月，按照纳入标准从上海中医药大学附属曙光医院、上海长海医院、复旦大学附属中山医院共收集210例晚期原发性肝癌术后患者，研究过程中失访脱落18例，剔除12例，最终观察患者180例。

手术治疗(手术、介入、射频消融)后晚期原发性肝癌患者(BCLC分期B期、C期的患者)，按照国家***颁布的《原发性肝癌诊疗规范(2011年版)》，签订知情同意书，分为对照组和治疗组，对照组给予恩替卡韦(0.5mg/日)治疗，治疗组给予待测样品(其用量以实施例中制得的清膏计，60g清膏/日,分为2次服用)叠加恩替卡韦(0.5mg/日)治疗，两组患者的观察周期均为6个月。

3.结果

通过对两组患者累计生存率的生存分析比较，治疗组累计生存率为88.9％，对照组为76.7％，两组生存率有显著性差异(P<0.05)。患者治疗随访观察期间，在治疗3个月时，治疗组和对照组各死亡3例；在治疗6个月时，治疗组死亡5例，对照组死亡9例；在随访3个月时，治疗组死亡10例，对照组死亡17例；在随访6个月时，治疗组死亡10例，对照组死亡21例，对照组病死率明显高于治疗组(P<0.05)。

在治疗3个月时，治疗组患者肝癌复发8例，对照组复发13例；治疗6个月时，治疗组复发30例，对照组复发44例，两组复发率存在统计学差异(P<0.05)；在随访3个月时，治疗组复发32例，对照组复发48例，两组肝癌复发率存在统计学差异(P<0.05)。

在原发性肝癌术后患者主要中医症状改善方面，治疗组出现口淡61例，改善42例；对照组出现58例，改善25例，两组有统计学差异(P<0.05)。治疗胃部胀满者68例，改善53例；对照组62例，改善35例，两组具有统计学差异(P<0.05)。治疗组恶心呕吐38例，改善20例；对照组51例，改善15例，两组具有统计学差异(P<0.05)。治疗组倦怠乏力出现73例，改善62例；对照组出现69例，改善45例，两组具有统计学差异(P<0.05)。在中医证候疗效方面，经过治疗后，治疗组显效病例为2人，有效病例53人，无效例数为30人；对照组显效0人，有效16人，无效病例65人；两组中医证候疗效具有显著统计学差异(P<0.01)。

实施例37：抗肝损伤的活性评价

1.受试物

按实施例21制备的复方干浸膏。

2.方法

雌性Balb/C小鼠(购于北京维通利华公司)40只，随机分为四组，每组10只。(1)正常对照组；(2)ConA诱导肝损伤模型组；(3)复方干浸膏组(2.0g/kg)；(4)复方甘草酸片(北京凯因科技股份有限公司，50mg/kg)。模型组小鼠每周尾静脉注射ConA二次，剂量均为10mg/kg，连续注射2周。复方干浸膏组和复方甘草酸片组分别每天灌胃给予ConA诱导肝损伤模型小鼠复方干浸膏(2.0g/kg)和复方甘草酸片(50mg/kg)1次，连续2周。正常对照组每天灌胃给予生理盐水1次，连续两周。末次注射ConA和给药后，禁食过夜。处死小鼠。无菌取小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，测定复方干浸膏对小鼠脾细胞增殖的影响。摘取小鼠肝脏、肾脏和胸腺，称重，计算重量指数(脏器重量/小鼠体重)。肝脏和肾脏制备病理切片，观察肝脏和肾脏病理损伤状况。

脾淋巴细胞增殖实验的方法：

无菌条件下取出脾，制备脾细胞悬液，用台盼蓝染色法检测细胞存活率＞95％，进行细胞计数，调整细胞密度为5×10⁶/mL。将计数后的脾细胞悬液按每孔100μL加入到96孔细胞培养板，溶剂对照孔只加等体积的RPMI 1640培养液作为本底。各孔再加入100μL待测样品(终浓度分别为10、50和250μg/mL)、ConA(终浓度2μg/mL)和LPS(终浓度15μg/mL，每组设3复孔。将培养板置于含5％CO₂培养箱中，37℃孵育72h。加入20μL MTT 5μg/mL，继续孵育4h。弃上清液后，每孔中加入150μL DMSO，酶标仪检测A_570nm，计算细胞增殖率。

3.结果

(1)与正常对照组相比，ConA诱导肝损伤模型组小鼠肝脏和肾脏肿大，重量指数明显增加(P<0.01)，胸腺萎缩，重量指数降低。给予复方干浸膏能显著改善肝脏肿大(P<0.05)，对减轻肾脏的重大和胸腺的萎缩均有一定改善作用(见表5)。

表5.复方干浸膏对肝损伤小鼠脏器重量的影响

注：与正常组相比，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组相比，^#P<0.05，n＝10.

(2)复方干浸膏本身能促进脾脏细胞增殖(P<0.05)，对ConA和LPS刺激的T细胞和B细胞增殖也有明显协同作用(P<0.001)，具体数据见表6。

表6.复方干浸膏对肝损伤小鼠脾脏细胞增殖的影响

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001。

(3)病理分析显示：与正常对照组相比(图1中A和B)，ConA诱导肝损伤模型组小鼠肝脏出现多处肝细胞坏死区域，区域周边大量炎症细胞聚集(图1中C和D)和纤维细胞的增生；与模型组相比，小鼠给予复方干浸膏，均可使小鼠肝细胞坏死区域明显减少或不出现，炎症细胞明显减少，同时还会出现双核肝细胞，增加细胞的***和增生(图1中E～F)。

(4)复方干浸膏能降低ConA诱发小鼠肝脏ALT和AST酶活的升高(见表7)。

表7.复方干浸膏对肝损伤小鼠肝脏ALT和AST酶活的影响

注：与正常组相比，*P<0.05，***P<0.001；与模型组相比，^#P<0.05，^##P<0.01.

实施例38：对促肝细胞增殖活性评价

1.待测样品

按照实施例21和实施例26方法制备的样品。

2.方法

取对数生长期LO2肝细胞(本研究所李前教授惠赠)，经消化处理后，以1％FBS的RPMI-1640液制成单细胞悬液，用台酚蓝液染色，计数活细胞总数，接种入96孔细胞培养板，细胞密度为1×10⁴/孔。待测样品采用培养液配制，加入培养板中，使其终浓度为0、10、50和250μg·mL^-1，每个浓度平行设3个孔，置于培养箱中孵育72h。向含有培养物的96孔板中每孔加入0.5％MTT液20μL，继续培养4h，然后每孔加入100μL 10％SDS，继续37℃孵育过夜，最后采用酶标仪检测570nm波长处的OD值，计算细胞增殖率。

3.结果

复方水煎干浸膏及其多糖部位和醇沉上清部位对肝细胞的促增殖作用见表8。

表8复方干浸膏及其二个部位对人L-O2肝细胞增殖的影响

注：与溶剂对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，n＝3.

结果表明：复方水煎干浸膏及其二个部位在10～250μg/mL浓度范围内均有明显的促进肝细胞增殖活性，而且呈良好的剂量-效应关系。

实施例39：抗肝细胞损伤活性评价

1.待测样品

按照实施例21制备的复方干浸膏和实施26方法制备的复方醇沉上清和多糖。

2.方法

取对数生长期人LO2肝细胞，经消化处理后，以1％FBS的RPMI1640液制成单细胞悬液，用台酚蓝液染色，计数活细胞总数，接种入96孔细胞培养板，细胞密度为1×10⁴/孔。待测样品采用培养液配制，加入培养板中，使其终浓度为0、10、50和250μg·mL^-1，每孔再加入ConA，终浓度为500μg/mL，同时设溶剂对照组。每个浓度平行设3个孔，置于培养箱中孵育72h。向含有培养物的96孔板中每孔加入0.5％MTT液20μL，继续培养4h，然后每孔加入100μL10％SDS，继续37℃孵育过夜，最后采用酶标仪检测570nm波长处的OD值，计算细胞抑制率。

结果

与溶剂对照组相比，500μg/mL ConA能造成55.8％肝细胞死亡。加入复方干浸膏、复方多糖部位或复方醇沉上清部位，可使肝细胞死亡率显著下降，并呈浓度-效应关系。干浸膏和多糖在250μg/mL浓度还可促进肝细胞数量增加，具体数据见表9。

表9.复方干浸膏及其二个部位对人L-O2肝细胞抗损伤的影响

注：与溶剂对照组相比，^***P<0.001；与ConA组相比，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001，n＝3.

实施例40：促肝细胞增殖活性评价

1.待测样品

按照实施例22、实施例23、实施例24和实施例25方法制备的样品。

2.方法

取对数生长期LO2肝细胞，经消化处理后，以1％FBS的RPMI-1640液制成单细胞悬液，用台酚蓝液染色，计数活细胞总数，接种入96孔细胞培养板，细胞密度为1×10⁴/孔。待测样品采用培养液配制，加入培养板中，使其终浓度为0、10、50和250μg·mL^-1，每个浓度平行设3个孔，置于培养箱中孵育72h。向含有培养物的96孔板中每孔加入0.5％MTT液20μL，继续培养4h，然后每孔加入100μL 10％SDS，继续37℃孵育过夜，最后采用酶标仪检测570nm波长处的OD值，计算细胞增殖率。

3.结果

从表10中可以看出，按照实施例22-25方法制备的干浸膏样品均能显著促进人肝细胞的增殖，而且均呈良好的量-效关系。

表10.三种复方剂型浸膏对人L-O2肝细胞增殖的影响

注：与溶剂对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，n＝3.

实施例41：对乙肝抗原表达的评价

1.受试物

按照实施例21和实施26方法制备的样品。

2.方法

将处于对数生长期的HepG2.2.15细胞(中国科学院巴斯德研究所惠赠)用胰酶消化后，加入DMEM培养液(含10％FBS)终止消化，转至15ml离心管中1000rpm离心5min，去液体后加1ml DMEM培养液(含10％FBS)重悬后，计数。按照5.0×10³细胞/孔种于96孔板，每孔100μl DMEM培养液(含10％FBS)，置37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱培养24h或48h。待细胞贴壁后，弃掉原培养液，分别加入100μl/孔的待测样品培养液(按100、250和500μg/mL设3个复孔)，分别在药物干预后24小时收集细胞培养上清，采用乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)诊断试剂盒(酶联免疫法)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)诊断试剂盒(酶联免疫法)检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的水平，计算抑制率。

3.结果

复方干浸膏和复方多糖部位对乙肝病毒表面抗原(HBsAg)分泌有显著抑制作用，并呈良好浓度-效应关系；复方干浸膏及其醇沉上清和多糖二个部位对乙肝病毒e抗原(HBeAg)的分泌均有显著抑制作用，但复方干浸膏和复方多糖部位量效关系更明显。具体数据见表11和表12。

表11.复方干浸膏及二个部位对乙肝表面抗原(HBsAg)表达的影响

表12.复方干浸膏及二个部位对乙肝核心抗原(HBeAg)表达的影响

实施例42：免疫活性的评价

1.待测样品

按照实施例21和实施26方法制备的样品。

2.方法

(1)小鼠脾细胞的增殖活性评价方法

Balc/C小鼠眼球取血，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出脾，制备脾细胞悬液，用台盼蓝染色法检测细胞存活率＞95％，进行细胞计数，调整细胞密度为5×10⁶/mL。将计数后的脾细胞悬液按每孔100μL加入到96孔细胞培养板，溶剂对照孔只加等体积的RPMI 1640培养液作为本底。各孔再加入100μL待测样品(终浓度分别为10、50和250μg/mL)、ConA(终浓度2μg/mL)和LPS(终浓度15μg/mL，每组设3复孔。将培养板置于含5％CO₂培养箱中，37℃孵育72h。加入20μL MTT 5μg/mL，继续孵育4h。弃上清液后，每孔中加入150μL DMSO，酶标仪检测A_570nm，计算细胞增殖能力。结果见表13。

表13.复方水煎干浸膏及其部位对小鼠脾细胞增殖的影响

注：与溶剂对照组相比，^**P<0.01，^***P<0.001；与ConA或LPS组相比，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001，n＝3.

结果表明：复方干浸膏多糖部位和醇沉上清部位在250μg/mL浓度对小鼠脾细胞有显著促增殖活性，醇沉上清部位对ConA刺激T细胞增殖有协同促进作用，多糖部位对LPS刺激B细胞增殖有协同促进作用。

(2)细胞因子IFN-γ和TNF-α测定方法

Balb/C小鼠处死后无菌取脾脏，制备脾细胞悬液(5×10⁶/mL)。将脾细胞悬液加入24孔细胞培养板中，每孔各加入500μL。再加入500μL待测样品(终浓度分别为10、50和250μg/mL)，另设ConA(4μg/mL)和溶剂对照孔，每组设3复孔。然后置于37℃、5％CO₂培养箱中培养72h，然后取出细胞培养液，离心10min(600×g)，收集上清，按照ELISA试剂盒说明书测定脾细胞培养上清IFN-γ含量，实验结果见表14。

Balb/C小鼠处死后无菌抽取腹腔巨噬细胞，制备细胞悬液，并用含FBS的DMEM培养液调整细胞浓度为2.5×10⁵/mL。向24孔培养板中加入巨噬细胞悬液500μL，再加入500μL不同浓度待测样品(终浓度分别为10、50和250μg/mL)，另设LPS(15μg/mL)和溶剂对照孔，设3复孔，然后置于5％CO₂、37℃饱和湿度的培养箱中培养48h。收集巨噬细胞培养上清液，采用ELISA试剂盒测定细胞上清液中TNF-α的含量，实验结果见表15。

表14.复方水煎干浸膏及其部位对小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的影响

注：与溶剂对照组相比，^*P<0.05，^***P<0.001，n＝3.

表15.复方水煎干浸膏及其部位对小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的影响

注：与溶剂对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，n＝3.

结果表明：复方多糖能促进小鼠脾细胞分泌IFN-γ，复方干浸膏及其二个部位对小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α均有增强作用。

实施例43：促脾细胞增殖活性评价

1.待测样品

按照实施例22-25方法制备的样品。

2.方法

Balc/C小鼠眼球取血，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出脾，制备脾细胞悬液，用台盼蓝染色法检测细胞存活率＞95％，进行细胞计数，调整细胞密度为5×10⁶/mL。将计数后的脾细胞悬液按每孔100μL加入到96孔细胞培养板，溶剂对照孔只加等体积的RPMI 1640培养液作为本底。各孔再加入100μL待测样品(终浓度分别为10、50和250μg/mL)、ConA(终浓度2μg/mL)和LPS(终浓度15μg/mL)，每组设3复孔。将培养板置于含5％CO₂培养箱中，37℃孵育72h。加入20μL MTT 5μg/mL，继续孵育4h。弃上清液后，每孔中加入150μL DMSO，酶标仪检测A_570nm。

3.结果

数据表明：按照实施例22-25方法制备的干浸膏本身在250μg/ml浓度对小鼠脾脏细胞有明显促进增殖活性，该浓度对ConA诱导的T细胞增殖有协同促进作用，抗肝纤维化浸膏对LPS诱导的B细胞增殖也有协同作用(见表16)。

表16.四种功效复方干浸膏对小鼠脾细胞增殖的影响

注：与溶剂对照组相比，^*P<0.05，^***P<0.001；与ConA或LPS组相比，^#P<0.05，’n＝3.

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，根据已经公开的所有教导，本领域技术人员可以对本发明技术方案的细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。