阅读说明：本技术 一种巴戟天提取物在制备抗骨骼肌疲劳剂中的应用 (Application of morinda officinalis extract in preparation of anti-skeletal muscle fatigue agent ) 是由 赵玉勤 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及中药提取物及其应用领域,公开了一种巴戟天提取物在制备抗骨骼肌疲劳剂中的应用,抗骨骼肌疲劳剂的组分包括巴戟天提取物0.1～2.5mg/mL、NaCl 6～7mg/mL,KCl 0.13～0.15mg/mL,NaHCO<Sub>3</Sub> 0.1～0.3mg/mL,CaCl<Sub>2</Sub> 0.1～0.3mg/mL,NaH<Sub>2</Sub>PO<Sub>4</Sub> 0.01～0.02 mg/mL,葡萄糖1～3mg/mL和水。本发明用传统中草药巴戟天提取物作为抗骨骼肌疲劳剂中的主要成分,可以使骨骼肌达到疲劳状态的时间延长,有效提高骨骼肌的抗疲劳活性,并且无需添加兴奋剂,是一种安全高效的抗疲劳药物。(The invention relates to the field of traditional Chinese medicine extracts and application thereof, and discloses application of a morinda officinalis extract in preparation of an anti-skeletal muscle fatigue agent, wherein the anti-skeletal muscle fatigue agent comprises the components of 0.1-2.5 mg/mL of the morinda officinalis extract, 6-7 mg/mL of NaCl, 0.13-0.15 mg/mL of KCl and NaHCO 3 0.1～0.3mg/mL，CaCl 2 0.1～0.3mg/mL，NaH 2 PO 4 0.01-0.02 mg/mL, 1-3 mg/mL glucose and water. The invention uses traditional Chinese herbal medicine morinda officinalis extract as the main component of the anti-fatigue agent for skeletal muscles, can prolong the time for the skeletal muscles to reach a fatigue state, effectively improves the anti-fatigue activity of the skeletal muscles, does not need to add an excitant, and is a safe and efficient anti-fatigue drug.)

一种巴戟天提取物在制备抗骨骼肌疲劳剂中的应用

技术领域

本发明涉及中药提取物及其应用领域，尤其是涉及一种巴戟天提取物在制备抗骨骼肌疲劳剂中的应用。

背景技术

现代社会中，随着各种外界压力和心理压力不断地增加，各个年龄段都开始表现出不同层面的疲劳。轻则出现困乏症状，但通过补充营养，休息睡眠等的方式就可以对其进行缓解；重则出现内分泌失调、器官病变甚至精神上的疾病，严重的威胁了人们的身心健康。伴随着科学的发展，针对疲劳的各项研究正在不断深入，抗疲劳药品也在不断地涌出。但是由于某些抗疲劳药物中含有***等成分，可能会给机体造成一定的危害，故而这类抗疲劳药物的应用也受到了很大的限制。

眼下也正在努力研发更安全、有效的抗疲劳药物。我国的传统中草药因为其副作用少、不存在添加***而造成隐患的优势而成为近几年来研发这类药物的焦点。巴戟天(Morinda officinalis)，是我国传统的中草药，现如今依旧被广泛应用于中医领域，其主要用作壮筋骨、祛风湿还有补气血等等。另外经检测，巴戟天还富含糖类、蒽醌类、环烯醚萜类、黄酮类化合物以及其它化学成分，现代药理学研究也显示，由于其功能的多样性，巴戟天不仅限于上述中医功效，还对抗衰老，增强人体免疫力，抗心肌缺氧以及抗癌具有一定的辅助作用。例如，一种在中国专利文献上公开的“巴戟天提取物在制备免疫佐剂的应用”，其公告号CN103372208B，该专利公开了巴戟天提取物可作为主要有效成分用于制备免疫佐剂，即巴戟天提取物可用于制备免疫佐剂，是一种可以增强抗原免疫保护效果的安全有效的疫苗佐剂。可应用于传统的减毒疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗及灭活蛋白疫苗的免疫保护中。

但现有的研究中尚未有巴戟天提取物在抗疲劳药物中的应用，如果可以将巴戟天中的有效成分进行提取并用于制备抗疲劳药物中，可以大大减轻抗疲劳药物的副作用，使得抗疲劳药物更加安全，具有极高的应用价值和经济开发价值。

发明内容

本发明是为了克服现有技术的抗疲劳药物中含有***等成分，服用后会给机体造成一定的危害，亟需寻找一种副作用少、不添加***的安全高效抗疲劳药物的问题，提供一种巴戟天提取物在制备抗骨骼肌疲劳剂中的应用，用传统中草药巴戟天提取物作为抗骨骼肌疲劳剂中的主要成分，巴戟天提取物可刺激骨骼肌内过氧化氢酶的生成并提高过氧化氢酶活力，使骨骼肌达到疲劳状态的时间延长，有效提高骨骼肌的抗疲劳活性，并且无需添加***，是一种安全高效的抗疲劳药物。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种巴戟天提取物在制备抗骨骼肌疲劳剂中的应用，抗骨骼肌疲劳剂的组分包括巴戟天提取物、NaCl、KCl、NaHCO₃、CaCl₂、NaH₂PO₄、葡萄糖和水。

作为优选，巴戟天提取物在抗骨骼肌疲劳剂中的浓度为0.1～2.5mg/mL。

作为优选，抗骨骼肌疲劳剂中各组分的浓度为：NaCl 6～7mg/mL，KCl 0.13～0.15mg/mL，NaHCO₃ 0.1～0.3mg/mL，CaCl₂ 0.1～0.3mg/mL，NaH₂PO₄ 0.01～0.02mg/mL，葡萄糖1～3mg/mL。

作为优选，巴戟天提取物的制备方法包括如下步骤：

(1)粗提：向巴戟天药材粉末中加入水，超声提取后过滤得一次滤液和一次滤渣，将一次滤渣按相同方法再提取三次，将三次所得的滤液与一次滤液混合，浓缩并干燥得到巴戟天粗提物；

(2)精提：向巴戟天粗提物中加入乙醇，醇沉后过滤得二次滤液，将二次滤液浓缩并干燥后得到所述巴戟天提取物。

作为优选，步骤(1)中巴戟天药材粉末与水的质量比为1：(5～10)。

作为优选，步骤(1)中的超声功率800～1000W，频率40～60Hz，提取时间20～40min。

作为优选，步骤(1)和步骤(2)中过滤时使用孔径为30～50μm的滤纸。

作为优选，步骤(2)中巴戟天粗提物与乙醇的质量比为2：(3～5)。

作为优选，步骤(2)中醇沉时间6～12h。

疲劳分为周围神经性疲劳和中枢疲劳。有许多因素可以导致周围神经性疲劳，现有研究中讨论最多的是与肌肉收缩所需的能量有关。我们日常生活所需的所有能量都由糖类、脂质、蛋白质这三种物质提供。运动伴随着能量的消耗，这些物质同时也大量减少，若未能及时补给，则会引发疲劳。而三者中的糖类又是维持人体生命活动的主要能源物质，总是优先被利用，导致血糖水平下降，于是疲劳也就随之而来。

导致中枢疲劳的其中一个因素是大脑中发生的氧化反应给大脑造成了损害，为了防止这种损伤，大脑做出了相对应的防御机制，由此产生了疲劳。在日常的体育锻炼过程中，大脑内活性氧的含量增加，进一步促进了氧化反应的发生。对于活性氧造成的损害高度敏感的器官来说，易氧化分子的数量决定了其损害程度。

另外自由基和脂质过氧化也会导致疲劳产生，自由基是生物体内发生氧化反应时所产生的一种会对机体造成损害的物质，并伴有极强的氧化性，能氧化体内各种物质以及改变化合物的构型。自由基氧化反应发生的原因可能是活性氧自由基与细胞质膜上的不饱和脂肪酸结合，造成了脂质的过氧化反应，生成脂质过氧化物，然后继续降解成丙二醛(MDA)和烷烃等终末产物，产物积累使细胞膜受损，最终导致细胞损伤至衰亡，引起各种病理改变。体内自由基氧化破坏细胞膜的反应发生的同时，人体内会产生能与这种氧化性物质发生特异性结合的酶——过氧化氢酶(CAT)，这种酶的数量会大幅度增加，以达到抗氧化的目的。此外，过氧化氢酶(CAT)是重要的抗氧化酶，可清除体内氧自由基，防止细胞结构损伤。已知骨骼肌运动所产生自由基会引起CAT活力的变化，因此CAT活力大小与骨骼肌疲劳密切相关。

使用本发明中的方法得到的巴戟天提取物中含有多种蒽醌及环烯醚萜类化合物，环烯醚萜类化合物的母环上都含有碳碳双键，因为碳碳双键具有易被氧化的化学性质，所以这类化合物应具有一定的抗氧化活性；另外，巴戟天提取物中还含有多种可溶性多糖，作为生命活动的主要的供能物质之一，糖类在维持机体正常生命活动中扮演着非常重要的角色，骨骼肌收缩时也需要糖类的供能；多糖类化合物是自然界大分子中占数量最大的一类物质，它们可以作为保护剂来对抗氧化反应，作为衰老反应的延缓剂，并且可以改变营养代谢，释放肠激素，调节免疫系统以及肠道微生物；另外，本发明在抗骨骼肌疲劳剂中添加K⁺、Ca²⁺、Na⁺等无机离子，这些离子与骨骼肌的收缩有着密切的联系。

因此，将本发明中制备出的巴戟天提取物以适当浓度应用在抗骨骼肌疲劳剂中，可以使骨骼肌达到疲劳状态的时间延长，有效提高骨骼肌的抗疲劳活性。

因此，本发明具有如下有益效果：

(1)用传统中草药巴戟天提取物作为抗骨骼肌疲劳剂中的主要成分，可以使骨骼肌达到疲劳状态的时间延长，有效提高骨骼肌的抗疲劳活性，并且无需添加***，是一种安全高效的抗疲劳药物；

(2)本发明中的方法得到的巴戟天提取物中含有多种蒽醌、环烯醚萜类化合物、多糖，辅助以抗骨骼肌疲劳剂中的K⁺、Ca²⁺、Na⁺等无机离子，具有一定的抗氧化活性，并可以为骨骼肌的收缩供能，其作为抗骨骼肌疲劳剂中的主要成分，可以有效缓解骨骼肌疲劳。

附图说明

图1是实施例1中的巴戟天提取物的红外图谱；

图2是实施例1中的巴戟天提取物的高效液相色谱图；

图3是标准样品高效液相色谱图；

图4是实施例1-3中的抗骨骼肌疲劳剂对蟾蜍的腓肠肌收缩力的影响图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。

实施例1：

一种巴戟天提取物在制备抗骨骼肌疲劳剂中的应用，抗骨骼肌疲劳剂的组分包括0.1mg/mL巴戟天提取物、6mg/mL NaCl、0.13mg/mL KCl、0.1mg/mL NaHCO₃、0.1mg/mL CaCl₂、0.01mg/mL NaH₂PO₄、1mg/mL葡萄糖和水。

巴戟天提取物的制备方法包括如下步骤：

(1)粗提：向巴戟天药材粉末中加入水，巴戟天药材粉末与水的质量比为1:5，800W，40Hz条件下超声提取40min后，用孔径为30μm的滤纸过滤得一次滤液和一次滤渣，将一次滤渣按相同方法再提取三次，将三次所得的滤液与一次滤液混合，浓缩并干燥得到巴戟天粗提物；

(2)精提：向巴戟天粗提物中加入乙醇，巴戟天粗提物与乙醇的质量比为2:3，醇沉6h后过滤得二次滤液，将二次滤液浓缩并干燥后得到巴戟天提取物。

实施例2：

一种巴戟天提取物在制备抗骨骼肌疲劳剂中的应用，抗骨骼肌疲劳剂的组分包括0.5mg/mL巴戟天提取物、6.5mg/mL NaCl、0.14mg/mL KCl、0.2mg/mL NaHCO₃、0.2mg/mLCaCl₂、0.01mg/mL NaH₂PO₄、2mg/mL葡萄糖和水。

巴戟天提取物的制备方法包括如下步骤：

(1)粗提：向巴戟天药材粉末中加入水，巴戟天药材粉末与水的质量比为1:8，900W，50Hz条件下超声提取30min后，用孔径为40μm的滤纸过滤得一次滤液和一次滤渣，将一次滤渣按相同方法再提取三次，将三次所得的滤液与一次滤液混合，浓缩并干燥得到巴戟天粗提物；

(2)精提：向巴戟天粗提物中加入乙醇，巴戟天粗提物与乙醇的质量比为2:4，醇沉10h后过滤得二次滤液，将二次滤液浓缩并干燥后得到巴戟天提取物。

实施例3：

一种巴戟天提取物在制备抗骨骼肌疲劳剂中的应用，抗骨骼肌疲劳剂的组分包括2.5mg/mL巴戟天提取物、7mg/mL NaCl、0.15mg/mL KCl、0.3mg/mL NaHCO₃、0.3mg/mL CaCl₂、0.02mg/mL NaH₂PO₄、3mg/mL葡萄糖和水。

巴戟天提取物的制备方法包括如下步骤：

(1)粗提：向巴戟天药材粉末中加入水，巴戟天药材粉末与水的质量比为1:10，1000W，60Hz条件下超声提取20min后，用孔径为50μm的滤纸过滤得一次滤液和一次滤渣，将一次滤渣按相同方法再提取三次，将三次所得的滤液与一次滤液混合，浓缩并干燥得到巴戟天粗提物；

(2)精提：向巴戟天粗提物中加入乙醇，巴戟天粗提物与乙醇的质量比为2:5，醇沉12h后过滤得二次滤液，将二次滤液浓缩并干燥后得到巴戟天提取物。

一、巴戟天提取物的成分分析

1、巴戟天提取物的红外光谱鉴定

取1mg实施例1中制得的巴戟天提取物粉末置于玛瑙研钵中，然后再加入KBr粉末，将两者混合、研细并放入压片机中压片。将压好的样品进行红外测定，红外光谱图如图1所示。

通过图1可以看出，在3363cm^-1处有比较钝的强吸收峰，根据资料显示，巴戟天含有黄酮类化合物，结合谱图分析可能为羟基的伸缩振动所造成的吸收峰。在2927cm^-1波数处有强度中等波形较为尖锐的红外吸收峰，提取物中可能含有C-H键，该峰可能是由碳氢键的伸缩振动所造成的吸收峰。在2361cm^-1处出现强度中等波形尖锐的吸收峰，由文献资料可知，除环烯醚萜以外巴戟天还含有蒽醌类化合物，该峰可能为累积双键伸缩振动峰。1648cm^-1处可能为C-C双键的伸缩振动造成的吸收峰。1153cm^-1处的三个吸收峰可能为C-O-C的伸缩振动峰，推测巴戟天提取物中含有糖环。

2、巴戟天提取物单糖组成的测定

取0.1g实施例1中制得的巴戟天提取物粉末于试管中，再加入2mL 2mol/mL的TFA。溶解后，将塞子盖紧并将其放置在110℃的环境条件下，待其水解大约2h左右。2h后取出离心，只取上清液。加入0.3mol/mL的NaOH溶液调节pH至7左右。最后取10mL调节pH之后的溶液于容量瓶中，加入蒸馏水至刻度线，摇匀后即得样品溶液。将甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖(Glc)、葡糖糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、氨基葡萄糖(GlcN)、***糖(Arb)按要求配制成标准品溶液，与样品一起进行高效液相色谱分析，结果如图2和图3所示。

对照图2、图3的高效液相色谱可知，本发明制得的巴戟天提取物中，单糖组成包括甘露糖和半乳糖醛酸。

二、巴戟天提取物对骨骼肌收缩幅度的影响已知骨骼肌运动所产生自由基会引起CAT活力的变化，因此CAT活力大小与骨骼肌疲劳密切相关，本发明主要通过检测CAT活力来探究巴戟天提取物对骨骼肌疲劳的影响。

1、抗骨骼肌疲劳剂的配置

按比例称取除巴戟天提取物外的其他组分，溶于蒸馏水，配置成1000mL溶解液；取三只200mL的烧杯，用电子天平分别按比例称取实施例1-3中制得的巴戟天提取物粉末，再向烧杯中加入100mL上述配置的溶解液，配成实施例1-3中所述的抗骨骼肌疲劳剂，配好后静置备用，开始准备动物实验。

2、蟾蜍腓肠肌标本的制备

选用大小、重量相近的蟾蜍12只，用蛙针彻底破坏掉蟾蜍的中枢神经系统将其处死。处死蟾蜍后，用玻璃分针小心地游离出腓肠肌，并用医用棉线将腓肠肌与跟腱连接处固定，然后剪断连接处。以上步骤操作期间要保持用溶解液冲洗暴露出的腓肠肌，以保持肌肉活性并去除血污。处理好后将一只蟾蜍的两个腓肠肌分别作为对照组和实验组。在实验组中又随机平均分为实施例1、实施例2、实施例3组。最后将对照组蟾蜍腓肠肌置于相应溶解液中浸泡15min，实验组蟾蜍的腓肠肌分别置于实施例1-3中配置好的抗骨骼肌疲劳剂中浸泡。15min后取出，等待测定肌肉收缩力幅度下降时间。

3、仪器的连接及参数的设定

将浸泡好的蟾蜍腓肠肌从溶液中取出，把一头连接着蟾蜍腓肠肌的棉线系在张力换能器上。把刺激电极固定于暴露出的白色传出神经束上。系统设定为连续单刺激，强度设置为10V，波宽0.3ms，频率1Hz。因数据测定过程维持时间较长，所以实验中每隔2min便用胶头滴管吸取对应浸泡液滴在腓肠肌上，以保持肌肉的活性。

4、记录收缩曲线并分析

测定蟾蜍腓肠肌收缩幅度随时间的变化曲线需要用到上一步连接好的生物信号采集处理系统。观察系统上记录的收缩曲线的最大收缩幅度，并记下降时间时间。当曲线达到最大收缩幅度的90％、50％、10％时，记录下此时的时间，记作t_0.9、t_0.5、t_0.1。所有组别实验完成后求取各组达到以上记录标准时所需时间的平均数和标准差并进行分析，结果如表1和图4所示。

表1：抗骨骼肌疲劳剂对蟾蜍的腓肠肌收缩力的影响

注：不同大写字母表示同一行与对照组之间比较差异显著(P<0.05)

对照表1及图4可得知，在不同浓度的巴戟天提取物溶液中浸泡后，实施例3(2.5mg/mL)的腓肠肌收缩力下降的速度最慢，实施例2(0.5mg/mL)次之而实施例1(0.1mg/mL)下降速度最快。但总的来说，实验组三组与浸泡在溶解液中对照组相对比，肌肉收缩力下降速度均有了明显的减慢，特别是实施例3(2.5mg/mL)。从图4中可以明显看出随着浓度的增加，腓肠肌收缩力下降速度变缓，因此可以推断巴戟天提取物对于蟾蜍的骨骼肌疲劳有一定的缓解作用。

5、骨骼肌中CAT活力的测定

将测定完的各组腓肠肌的同一部分剪下。称取其中的0.1g，然后用15％的KCl溶液将其清洗干净，再用定性滤纸吸去血污及多余的溶液。处理好后，将腓肠肌转移至5mL大小的EP管中，然后用移液枪加入再0.1mL的15％KCl溶液。将装有样品的EP管置于冰上，用相同力度甚至相同方向，研磨样品10min左右直至其被制成匀浆。最后将该EP管置于4℃的离心机中用3000r/min的速度离心。离心完成后取上清液。将上清液收好并置于冰箱中冷冻，待其他各组实验完成后一起进行CAT活力检测，结果如表2所示。

表2：蟾蜍的腓肠肌生化指标

注：不同大写字母表示不同列与对照组之间比较差异显著(P<0.05)

由表2可知，与对照组相比，实施例中的骨骼肌细胞中CAT活力呈递增趋势，且随着浓度的提高，CAT活力也随之提高。过氧化氢酶(CAT)是人体内重要的过氧化物清除酶，在维持生物体内自由基的产生与消除的动态平衡中扮演着重要的角色。通常而言，酶的活力是指催化化学反应的能力，酶的活力大小可以用某一反应的条件下，该化学反应的催化反应速率来表示。酶的催化化学反应速率越大，酶的活力越高；反之，则越小。一般来说，在底物充足的情况下，酶的活力与其产物的量呈线性相关，在进行运动之后，机体内氧自由基的含量增加，CAT活力也会随之升高。所以作为评定体内氧自由基代谢的重要指标之一，根据以上实验结果可以合理推测巴戟天提取物在抗氧化方面有着明显的作用。综合以上信息，在证明本发明中的巴戟天提取物对CAT活力有着明显的提高作用的同时，也说明了巴戟天提取物对骨骼肌疲劳可能有一定的抑制作用。