一种人抑制素b的单克隆抗体及其应用和试剂盒
阅读说明:本技术 一种人抑制素b的单克隆抗体及其应用和试剂盒 (Monoclonal antibody of human inhibin B, application and kit thereof ) 是由 汤久停 张跃峰 孙理智 李新远 刘功成 渠海 付光宇 于 2019-11-22 设计创作,主要内容包括:本发明涉及体外诊断技术领域,公开了一种人抑制素B的单克隆抗体及其应用和试剂盒。本发明所述单克隆抗体在人抑制素B单克隆抗体基础上切除Fc段。本发明以去除Fc段的人抑制素B单克隆抗体为酶标抗体,基于双抗体夹心法检测人抑制素B,可达到较高的特异性、灵敏度和回收率,同时可排除临床异样样本;以磁微粒作为载体,结合化学发光法检测,可极大的提高反应速度,在30min内有效检测人INHB。(The invention relates to the technical field of in-vitro diagnosis, and discloses a monoclonal antibody of human inhibin B, application thereof and a kit. The monoclonal antibody provided by the invention cuts off an Fc segment on the basis of the human inhibin B monoclonal antibody. The invention takes the monoclonal antibody of the human inhibin B without Fc segment as an enzyme-labeled antibody, detects the human inhibin B based on a double-antibody sandwich method, can achieve higher specificity, sensitivity and recovery rate, and can eliminate clinical abnormal samples; magnetic particles are used as carriers, and a chemiluminescence method is combined for detection, so that the reaction speed can be greatly improved, and the human INHB can be effectively detected within 30 min.)
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域,具体涉及一种人抑制素B的单克隆抗体及其应用和试剂盒。
背景技术
抑制素(inhibin,INH)是一个异二聚体的糖蛋白,其中α-亚单位与一个βA-亚单位组成抑制素-A(INHA),而与βB-亚单位组成抑制素-B(INHB)。它们在血液中也可以无生物活性的游离亚单位形式存在。INHB是由生殖系统细胞分泌产生,与生殖能力有密切关系,对生殖功能具有内分泌、旁分泌和自分泌的调节作用。
INHB是睾丸来源的糖蛋白激素,成年男性体内血清抑制素B水平与FSH呈显著负相关,对FSH起负反馈作用。抑制素B水平反映了整个睾丸组织的功能,是输精管道的直接产物,成年男性血清中维持可检测的抑制素B水平需要生***的存在,因此抑制素B被认为是男性***发生的血清标志物。男性出生不久,INHB水平逐渐上升,在4-12个月时达到一个峰值(210±31)pg/ml,3-9岁下降至(81±12)pg/ml的低值;在***启动后,INHB水平又逐渐升高,在20-30岁时达到另一个峰值(167±20)pg/ml,此后INHB水平随年龄增加而逐渐降低。
血清抑制素B测定可用于评价男性不育病人的生精功能,儿童隐睾、性早熟的诊断,区分梗阻性与非梗阻性无***症患者,对非阻塞性无***症病人睾丸***抽吸的预测,监测放、化疗对男性生精功能的损伤等。抑制素B比促***(FSH)能更准确的反映睾丸的生精功能及其损伤程度;两者结合比任一单独使用有较高的诊断敏感性与特异性。
目前对抑制素B指标的测定常采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)和荧光免疫层析技术(Fluorescenceimmunochromatography Assay,FICA)。ELISA依靠比色法或偏振光法的检测技术所受的干扰因素太多,其灵敏度、线性和稳定性不高,不利于在临床医疗机构中使用;FICA的荧光标记易受环境干扰;同时在检测过程中容易产生假阳性结果,容易造成误诊,同时给医院患者造成精神压力。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种人抑制素B的单克隆抗体使其应用于化学发光法检测人抑制素B时具有较高的灵敏度、特异性、回收率,并可消除临床异常样本;同时提供该单克隆抗体的应用;
本发明的另外一个目的在于提供含有上述人抑制素B的单克隆抗体的基于化学发光法的试剂盒以及利用该试剂盒的检测方法,例如磁微粒化学发光试剂盒。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种人抑制素B的单克隆抗体,在人抑制素B单克隆抗体基础上切除Fc段。
作为优选,所述人抑制素B单克隆抗体切除Fc段过程如下:
将人抑制素B单克隆抗体透析,然后用活化后的木瓜蛋白酶孵育,然后用碘乙酰胺终止反应,再次透析,透析液用离子交换树脂纯化并用NaCl洗脱,收集首峰,获得切去Fc段的单克隆抗体。
更为优选地,人抑制素B单克隆抗体切除Fc段过程如下:
将人抑制素B单克隆抗体用磷酸盐缓冲液透析,然后用活化后的木瓜蛋白酶孵育,然后用碘乙酰胺避光冰浴终止反应,用Tris-HCl再次透析,透析液用DEAE离子交换树脂纯化并用NaCl洗脱,收集首峰,获得切去Fc段的单克隆抗体。
其中,所述活化后的木瓜蛋白酶为由磷酸缓冲液、EDTA、半胱氨酸活化后的木瓜蛋白酶,活化后可进行纯化。活化过程具体为,称取木瓜蛋白酶,以和透析相同的磷酸盐缓冲液配成溶液,加入EDTA(终浓度2mmol/L),半胱氨酸(终浓度10mmol/L),混匀后于37℃活化木瓜蛋白酶40min;纯化过程可将酶液过Sephadex G-25柱,用含2mmol/L EDTA的上述磷酸盐缓冲液洗脱,收集蛋白峰获得纯化后的活化木瓜蛋白酶。
所述孵育过程可分为两个阶段,将经透析处理的人抑制素B单克隆抗体与活化木瓜蛋白酶混合,于37℃孵育,然后再加入等量酶液,继续孵育;具体为:将经透析处理的抗体与活化木瓜蛋白酶按重量比3∶1混合,于37℃孵育9h后,再加入等量酶液,继续孵育9h;
在切除Fc段过程中,所述磷酸盐缓冲液优选为0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5),所述Tris-HCl优选为0.01mmol/L Tris-HCl,所述NaCl优选为0.1mol/L NaCl;
在本发明
具体实施方式
中,所述人抑制素B单克隆抗体切除Fc段过程如下:
将人抑制素B单克隆抗体用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)透析6h;
称取木瓜蛋白酶,以相同缓冲液配成25mg/mL溶液,加入EDTA(终浓度2mmol/L),半胱氨酸(终浓度10mmol/L),混匀后于37℃活化木瓜蛋白酶40min;
将酶液过Sephadex G-25柱,用含2mmol/L EDTA的上述缓冲液洗脱,收集蛋白峰获得纯化后的活化木瓜蛋白酶;
将经透析处理的人抑制素B单克隆抗体与活化木瓜蛋白酶按重量比3∶1混合,于37℃孵育9h后,再加入等量酶液,继续孵育9h;
加入终浓度20~30mmol/L的碘乙酰胺,避光冰浴1h终止反应;
将木瓜蛋白酶反应产物用0.01mmol/L Tris-HCl透析16h;用DEAE离子交换树脂柱纯化透析液,经0.1mol/L NaCl溶液梯度洗脱,收集首峰,获得纯化的切去Fc片段的单克隆抗体。
在本发明具体实施方式中,所述人抑制素B单克隆抗体选择为抗抑制素Bα亚单位的单克隆抗体。
利用本发明所述的切除Fc段的单克隆抗体对人抑制素B进行检测,具有较高的特异性、回收率,灵敏度可达到1.6pg/ml的高级别,同时可消除临床异常样本。基于此,本发明提出了所述单克隆抗体在检测人抑制素B含量或在制备检测人抑制素B的试剂盒中的应用。
依据上述应用,本发明提供了一种检测热抑制素B的试剂盒,包括酶标记的本发明所述单克隆抗体以及样本预处理液;所述样本预处理液包含有0.4%过氧化脲的PBS缓冲液。
本发明的样本预处理液作用在于将人抑制素B中甲硫氨酸转化为甲硫氨酸亚砜,样本中的抗原才能与去除Fc段的捕获抗体结合,而不添加样本预处理液,则无法检测。因此,本发明还提出了所述单克隆抗体联合所述样本预处理液在检测人抑制素B含量或在制备检测人抑制素B的试剂盒中的应用。
本发明所述提供的试剂盒采用双抗体夹心法,在包被人抑制素B单克隆抗体的载体中加入抑制素B的校准品或待测样本,同时加入适量的样品预处理液,孵育、洗涤;然后加入一定量的酶标单抗,孵育;校准品或待测样本中的抑制素B与载体上的抑制素B单克隆抗体以及酶标单抗结合,形成载体-包被抗体-抑制素B-酶标单抗-酶复合物,洗涤去除未结合物质。加入底物,振荡,通过免疫反应形成抗体-抗原-酶标单抗复合物,该复合物催化发光底物液发出光子,发光强度与INHB的含量成正比。故可以采用基于此原理的任何检测手段,例如化学发光检测手段。
基于上述原理,所述试剂盒还包括如下组分中的一种或两种以上:
包被人抑制素B单克隆抗体的载体、抑制素B校准品、洗涤液和酶显色底物;所述酶显色底物和酶标记的本发明所述单克隆抗体一一对应;所述洗涤液为浓缩洗涤液,为含有2%Tween20、1%Procline300的pH7.5、2mol/L的磷酸盐缓冲液。
在本发明具体实施方式中,所述包被人抑制素B单克隆抗体的载体为磁微粒,优选为羧基化磁珠,用于配合化学发光法使用。
根据本发明提供的试剂盒,本发明还提供了一种检测人抑制素B含量的方法,利用本发明所述试剂盒,采用化学发光法进行检测。
由以上技术方案可知,本发明以去除Fc段的人抑制素B单克隆抗体为酶标抗体,基于双抗体夹心法检测人抑制素B,可达到较高的特异性、灵敏度和回收率,同时可排除临床异样样本;以磁微粒作为载体,结合化学发光法检测,可极大的提高反应速度,在30min内有效检测人INHB。
附图说明
图1所示采用本发明方法检测与市售试剂盒检测的临床相关性结果;
图2所示为市售试剂盒与本发明(切除Fc段)的临床相关性结果;
图3所示为市售试剂盒与对照(未切除Fc段)的临床相关性结果;
图4所示为采用本发明方法检测与市售试剂盒检测的临床相关性结果。
具体实施方式
本发明公开了一种人抑制素B的单克隆抗体及其应用和试剂盒,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明所述单克隆抗体及其应用和试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述单克隆抗体及其应用和试剂盒进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明所用酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和吖啶酯的一种,之后加入对应底物是鲁米诺、异鲁米诺和强碱促使其发光。
以下就本发明所提供的一种人抑制素B的单克隆抗体及其应用和试剂盒做进一步说明。
实施例1:本发明所述试剂盒的制备
本发明试剂盒包括:包被有抗抑制素Bβ亚单位单克隆抗体的羧基化磁珠,酶标记的经去除Fc段的抗抑制素Bα亚单位单克隆抗体,样本预处理液,抑制素B校准品。
1、制备抗抑制素Bβ亚单位抗体的羧基化磁珠:
1.1抑制素B免疫原的制备:
提取猪***:从猪卵巢卵泡中吸取,-20℃保存;
除杂:活性炭除去类固醇激素;用0.2mol/L醋酸胺稀释离心,聚乙二醇浓缩;
Sephadex G-200凝胶柱;用0.2mol/L醋酸胺洗脱,收集洗脱蛋白;
Sephadex G-100凝胶柱;用0.2mol/L醋酸缓冲液洗脱,收集洗脱蛋白评价。
免疫:本发明通过Wong et al.在1993年文献中报道的方案对小鼠进行重复免疫和多位点进行免疫,在小鼠的***部位进行免疫,初始免疫用弗氏完全佐剂进行,随后用RIBI佐剂进行增强。最后在大肠杆菌中表达为包涵体,再转化为天然二聚体,并通过反相和离子交换色谱法纯化。
单克隆抗体的制备:用PEG将SP2/0骨髓瘤细胞与***B淋巴细胞融合,在ClonaCell甲基纤维素中进行分泌细胞株的初始抗体克隆和再克隆,最终得到单个的克隆,通过ProteinG亲和层析进行抗体的纯化。通过用固相抗体捕获ELISA方法筛选识别βB亚基的抗体。
1.2制备抗抑制素Bβ亚单位抗体的羧基化磁珠
将磁微粒用包被缓冲液(50mmol/L、pH7.6的磷酸盐缓冲液)洗涤5次,加入一定量的EDC和NHS进行活化,振荡反应30min;洗涤后与稀释至100-500μg/mL的包被抗体进行包被,震荡反应2h;洗涤固相载体,然后再用含有1%BSA的0.02mol/LBis-Tris的缓冲液封闭;封闭液移除后加入含有0.5%吐温-20、1%BSA、1%EDTA、0.1%Procline300、1%L7600的pH7.4、0.02mol/LBis-Tris缓冲液进行储存,2~8℃保存备用;
2、制备酶标记的经修饰的抗抑制素Bα亚单位单克隆抗体
2.1制备切除FC片段的标记抗体
2.1.1将抗抑制素Bβ亚单位抗体用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)透析6h;
2.1.2称取木瓜蛋白酶,以相同缓冲液配成25mg/mL溶液,加入EDTA(终浓度2mmol/L),半胱氨酸(终浓度10mmol/L),混匀后于37℃活化木瓜蛋白酶40min;
2.1.3将酶液过Sephadex G-25柱,用含2mmol/L EDTA的上述缓冲液洗脱,收集蛋白峰获得活化木瓜蛋白酶;
2.1.4将经透析处理的抗体与活化木瓜蛋白酶按重量比3∶1混合,于37℃孵育9h后,再加入等量酶液,继续孵育9h;
2.1.5加入终浓度20~30mmol/L的碘乙酰胺,避光冰浴1h终止反应;
2.1.6将木瓜蛋白酶反应产物用0.01mmol/L Tris-HCl透析16h;
2.1.7用DEAE离子交换树脂柱纯化透析液,经0.1mol/L NaCl溶液梯度洗脱,收集首峰,获得纯化的切去Fc片段的标记抗体。
2.2制备酶标记的经修饰的抗抑制素Bα亚单位单克隆抗体
2.2.1称取5mg HRP溶解于1mL蒸馏水中;
2.2.2于上液中加入0.06mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水+128mg NaIO4)0.5mL,混匀,置4℃30min;
2.2.3将上述溶液装入透析袋中,对1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜;
2.2.4加入含5mg 2.1.7中纯化抗体的水溶液1mL,混匀,并装入透析袋,加入0.05mol/L pH 9.5的碳酸盐缓冲液,缓缓搅拌透析6h,使之结合;
2.2.5加入NaBH4溶液(5mg/mL)0.2mL,混匀,置于4℃2h;
2.2.6在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液,混匀,4℃30min,离心,去上清,沉淀以少许0.02mol/L pH7.4的PBS溶液复溶,装入透析袋,以同样液体在4℃透析除盐过夜;
2.2.7次日取出离心,以除去不溶物,即得酶-抗体结合物,以0.02mol/L pH7.4PBS溶液稀释后,分装成1mL/瓶,低温保存。
3、制备抑制素B的校准品
3.1抑制素B原核表达载体的构建
3.1.1抗抑制素Bβ亚单位单克隆抗体是由半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段与载体蛋白偶联成免疫原,再将体内免疫反应和细胞培养、纯化获得。而半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段是由下述方法制备获的:
3.1.2根据从GeneBank检索的抑制素B编码基因INHBB,设计优势序列,进行原核表达;
3.1.3将所述正确表位的阳性克隆转入E.coliBL21(DE3),LB培养基进行培养,37℃震荡(150rpm)培养至OD600=0.4-0.6;
3.2重组人抑制素B的表达与纯化
3.2.1待上述培养结束后,加入诱导剂IPTG(使其终浓度为1mM)于30℃诱导表达6h;
3.2.2将离心后收集的菌体需要用0.05molpH7.4的PB进行重悬,超声破进行破碎处理,离心收集上清;
3.2.3将上述收集的上清进行SDS-PAGE胶分析,收集分子量目的蛋白条带进行纯化处理,由于载体中包含了His标签,故采用镍柱进行纯化,得到所述半抗原人工重组抑制素Bα亚单位肽段。在具体实施方式中,由半抗原人工重组抑制素Bβ亚单位肽段与载体蛋白偶联成免疫原中的载体蛋白选用所述载体蛋白为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白或者纤维蛋白原的至少一种。
3.3抑制素B校准品
将纯化得到的重组人抑制素B用含有1%BSA、50%小牛血清、50mmol/L、pH7.8的HEPES-NaOH缓冲液稀释成S0-S5 6个校准品;其浓度分别为0、25、50、150、500、1500pg/ml。
4、制备浓缩洗液
含有2%Tween20、1%Procline300的pH7.5、2mol/L的磷酸盐缓冲液。
5、制备底物
鲁米诺和双氧水。
6、样本预处理液:所述样本预处理液是包含有0.4%过氧化脲的PBS缓冲液(1LPBS配方:3.116g磷酸氢二钠,0.203g磷酸二氢钠,8.78g氯化钠)。
实施例2:本发明所述试剂盒的使用方法
1、试剂准备
1.1校准品和磁微粒:将试剂取出并平衡至室温(20~25℃);
1.2洗涤液:将10mL浓缩洗液和990mL纯化水在干净的容器中混合,作为工作洗涤液备用。纯化水请用户自备;
1.3底物:取出并平衡至室温。
2、试验操作
2.1依次50μL的抑制素B校准品、待测样本、50μL样品预处理液、20μL磁微粒抗体混悬液,孵育15min;
2.2孵育结束后;用洗涤工作液洗涤5次;然后再加入100μL酶标记抗体;
2.3混合溶液37℃振荡孵育15min;
2.4孵育结束后,用洗涤工作液洗涤5次;
2.5向每个反应位中加入底物100μL;
2.6固相载体于室温下振荡混匀18秒后检测,并进行分析结果。
实施例3:本发明与市售的临床相关性
3.1材料:康润抑制素B(INHB)定量检测试剂盒(酶联免疫法),批号:20180726;
3.2样本来源:郑州安图生物工程股份有限公司体检样本500份;
3.3实验步骤:随机选取500份体检样本,平行进行康润和本发明的样本检测,并对本发明和市售厂家的检测结果进行临床相关性分析。结果见图1。
图中Y(本发明)=0.9608(康润)+6.7785,R2=0.9887,N=500。
结果分析:通过对500份体检样本的本发明和康润的平行考核,评估本发明试剂与康润的临床相关性,实验结果表明,本发明与市售康润抑制素B(INHB)定量检测试剂盒(酶联免疫法)的R2值达到了0.98以上,与市售产品是高度相关的,检测结果准确性较高。
实施例4:本发明所述试剂盒的性能检测
1、最低检出量:参照CLSI EP-17A文件推荐的实验方案检测试剂盒的灵敏度,测得抑制素B的最低检出量不高于1.6pg/ml,功能灵敏度为5pg/mL。
2、线性:抑制素B在1.6~1500pg/ml间,实测值与理论值的线性相关系数r大于0.99。
3、回收率在85-115%。
4、稳定性:试剂盒自成品生产之日起于37℃放置10天(有效期为18个月);成品剩余效期内,则按37℃放置10天有效期为18个月推算37℃放置的时间进行检测,结果符合各项目规定的要求。
5、重复性:参照CLSI EP-05A文件推荐的实验方案检测试剂盒的重复性,分析内重复性不大于10%,批间差不大于15%。
6、特异性:参照CLSI EP-07A文件推荐的实验方案检测试剂盒的干扰性,要求干扰率在±10%以内。
①在所示浓度检测以下内源性物质,没有发现显著的干扰性。
表1
②在所示浓度检测以下交叉物质,没有发现显著的干扰性。
表2
实施例5:与未切除Fc段的单抗的对比
使用市售抑制素B(INHB)定量检测试剂盒(酶联免疫法),批号:20180726检测过的样本,对是否切除Fc进行检测,以未切除Fc做对照试剂盒(对照和本发明试剂盒仅差别在酶标单抗是否去除Fc段,两者单抗来源同一杂交瘤细胞,均参照实施例1方法制备),并使用康润和是否切除FC片段的抗体平行检测65份体检样本,并对其检测结果进行临床相关性分析。原始数据结果见表3,临床相关性线形图分别见图2和图3。
表3
图2中,本发明切除FC和康润比对情况:Y(切除Fc)=0.9829(康润)+13.855,R2=0.9923,N=65;
图3中,对照和康润比对情况:Y(对照未切除Fc)=0.992(康润)+15.807,R2=0.9772,N=65;
结果分析:通过对65份体检样本的是否切除Fc和康润的平行考核,评估是否切除Fc与康润的临床相关性,实验结果表明,切除Fc与市售康润抑制素B(INHB)定量检测试剂盒(酶联免疫法)的R2值达到了0.99以上,与市售产品是高度相关的;而对照与市售试剂盒在临床相关性上存在明显散点,分散性较大,有偏差较大的样本(编号311、313、323、348、357样本,偏差超过20%)。
实施例6:样本预处理液的作用
以市售康润试剂盒检测过的样本作为标准,对是否添加预处理液分别进行考核,相关方法参考前述实施例,差别仅在于是否添加样本预处理液处理,同时考核与康润试剂盒的临床相关性,结果见表4和图4。
表4
由上表和图4可知,不添加预处理液,无反应性;添加预处理液可以解决这个问题,因为添加预处理液处理样本可将人抑制素B中的甲硫氨酸转化为甲硫氨酸亚砜,样本中的抗原才能与去除Fc段的捕获抗体结合。并且能与康润有很好的临床相关性,R2可达到0.9946。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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