阅读说明：本技术 一种氮磷掺杂生物质基碳量子点、应用和利用其进行细胞成像检测的方法 (Nitrogen-phosphorus-doped biomass-based carbon quantum dot, application and method for cell imaging detection by using nitrogen-phosphorus-doped biomass-based carbon quantum dot ) 是由 刘苇 张励国 侯庆喜 李晓玉 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于氮磷共掺杂生物质基碳量子点,制备步骤如下：将漂白针叶浆和去离子水混合,在疏解机中充分搅拌,使得浆料完全分散,调整浓度,于密封条件下储存于5℃环境下；加入磷酸氢二铵,加入去离子水混合,充分搅拌,然后转移至高温高压反应釜中,反应终止后停止加热,冷却至室温；将所得的液体和固体部分分别取出,过滤除去固体,收集滤液；将滤液进行透析处理,过滤后所得滤液即为碳量子点溶液；经冷冻干燥处理,即得碳量子点固体。本碳量子点光学性能良好,所得碳量子点的荧光强度高,量子产率高,已在多种细胞中成功染色成像,本发明的含氮磷荧光碳量子点可应用于化学、材料、生物医药科学、细胞成像等领域中。(The invention relates to a nitrogen-phosphorus co-doped biomass-based carbon quantum dot, which comprises the following preparation steps: mixing bleached needle pulp and deionized water, fully stirring in a fluffer to completely disperse the pulp, adjusting the concentration, and storing in a 5 ℃ environment under a sealed condition; adding diammonium hydrogen phosphate, adding deionized water, mixing, fully stirring, transferring to a high-temperature high-pressure reaction kettle, stopping heating after the reaction is ended, and cooling to room temperature; taking out the obtained liquid and solid parts respectively, filtering to remove the solid, and collecting the filtrate; dialyzing the filtrate, and filtering to obtain a filtrate which is the carbon quantum dot solution; and (4) carrying out freeze drying treatment to obtain the carbon quantum dot solid. The carbon quantum dot has good optical performance, high fluorescence intensity and high quantum yield, and can be successfully dyed and imaged in various cells.)

一种氮磷掺杂生物质基碳量子点、应用和利用其进行细胞成 像检测的方法

技术领域

本发明属于生物质资源利用与生物医学相结合的技术领域，尤其是一种氮磷掺杂生物质基碳量子点、应用和利用其进行细胞成像检测的方法。

背景技术

灵敏度高、选择性好的生物荧光探针不仅可以实现对细胞内目标物的原位检测，而且可以实时跟踪它们的代谢过程。这使得生物荧光探针在研究生命科学中扮演着一个非常重要的角色。为了在细胞和动物水平上研究癌症的生物成像，需要强大的荧光染剂或探针。碳量子点具有制备成本低、生物相容性好、化学稳定性高、易于功能化和低毒性等优点，在生物成像领域有着广泛的应用前景。目前，为了进一步提升碳量子点的荧光性能，绝大多数研究者采用引入杂原子来增加碳量子点缺陷，以改变碳量子点的光学和电化学性质，从而使得其可以应用于新方法和新途径中。由于氮元素与碳元素的原子尺寸接近，使氮掺杂成为目前研究的一大热点。与此同时，氮和磷元素属于同一主族元素，化学性能接近。因此，引入氮和磷元素，可以在一定程度上提升碳量子点的光学性能，使其得到更好的应用。

目前，采用柠檬酸盐作为碳源制备碳量子点的技术已经很成熟了，然而，这种工艺原材料价格高，对环境有一定的影响，限制了其快速发展。如果利用富含碳的生物质作为碳料通过掺杂氮磷元素来制备碳量子将进一步拓展碳量子点在各方面的应用。漂白针叶浆是从植物纤维生物质中制备而得，其主要成分为纤维素，这种富含碳的材料有望作为碳量子点原料。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种氮磷掺杂生物质基碳量子点、应用和利用其进行细胞成像检测的方法，该碳量子点光学性能良好，所得碳量子点的荧光强度高，量子产率高，已在多种细胞中成功染色成像，本发明的含氮磷荧光碳量子点可应用于化学、材料、生物医药科学、细胞成像等领域中。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于氮磷共掺杂生物质基碳量子点，制备步骤如下：

⑴将漂白针叶浆和去离子水混合，使得浆浓保持在2-14％，在疏解机中充分搅拌，使得浆料完全分散，调整浓度，使浆中含水量控制在20～50％，于密封条件下储存于5℃环境下，备用；

⑵以疏解后的绝干漂白针叶浆为原料，加入磷酸氢二铵，控制磷酸氢二铵与浆料纤维的质量比为1：0.5-10；再加入去离子水混合，控制浆料纤维重量与去离子水体积之间的比例g：mL为1：5-20；充分搅拌30-60min后使其分散均匀，然后转移至高温高压反应釜中，具体条件设置为：100℃～200℃，0.5～5MPa，保温2～10h，搅拌速度为100-500转/分钟，反应终止后停止加热，待反应釜自然冷却至室温；

⑶将上述步骤⑵中所得的液体和固体部分分别取出，过滤除去固体，收集滤液；将所得滤液采用截留分子量为3500道尔顿的透析装置进行透析处理，进行透析处理2～7天，过滤后所得滤液即为碳量子点溶液；

⑷将收集到的滤液经过冷冻干燥处理，收集并留存，即得碳量子点固体。

而且，所述步骤⑴中于密封条件下平衡水分为于密封装置中平衡水分。

利用如上所述的基于氮磷共掺杂生物质基碳量子点进行细胞成像检测的方法，步骤如下：

分别取细胞密度为70-80％之间的细胞，消化离心收集，在共聚焦专用八孔皿每孔加入200ul 1x10⁵/mL细胞悬浮液，培养10～24h后使用；

取5～50ul、浓度为0.1～2mg/mL的基于氮磷共掺杂生物质基碳量子点加入到八孔皿中，在37℃、5％CO₂的环境中与细胞共孵育10～24h，用磷酸盐缓冲溶液洗去未结合的碳量子点，置于共聚焦显微镜油镜下观察，分别以405和488nm激光激发，相应通道采集荧光信号。

而且，所述共聚焦显微镜为奥林巴斯共聚焦显微镜。

而且，所述共聚焦显微镜为奥林巴斯共聚焦显微镜FV1000。

而且，所述油镜为60倍油镜。

如上所述的基于氮磷共掺杂生物质基碳量子点在化学、材料、生物医药科学方面中的应用。

如上所述的基于氮磷共掺杂生物质基碳量子点在细胞成像方面中的应用。

而且，所述细胞为癌细胞。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明碳量子点在制备时采用的原料为生物质原料，制备出氮磷掺杂的碳量子点，原料来源丰富、可再生、可生物降解，碳量子点光学性能良好，所得碳量子点的荧光强度高，量子产率高，已在多种细胞中成功染色成像；本发明的含氮磷荧光碳量子点可应用于化学、材料和生物医药科学等领域，不仅为生物质资源的高效和高值化利用提供了一条新的途径，并且为荧光探针在细胞成像应用提供了一种新的思路；将本发明碳量子点应用于细胞成像中，在一定程度上拓宽了碳量子点的原料来源，探索了氮磷共掺杂生物质基碳量子点(N,P-CQDs)对不同类型癌细胞成像的特点，有利于拓展碳量子点在生物医学领域的的研究与发展。

2、本发明碳量子点的制备方法具有简便、绿色、环保和高效的特点。

3、本发明碳量子点在制备时采用水热合成法，将漂白针叶浆作为碳源，磷酸氢二铵作为氮源和磷源一步合成了N,P-CQDs。与其他制备方法相比，本发明以碳源为生物纤维，来源广而且方便易得，反应条件温和，实验操作简单。

4、本发明第一次探究N,P-CQDs在不同类型癌细胞成像性能中的应用，并且发现N,P-CQDs在贴壁细胞(肝癌细胞，肺癌细胞，子***细胞)的细胞膜上有很好的吸附效果，但是在悬浮细胞(骨髓瘤细胞，淋巴瘤细胞)中能完全进入细胞质，在整个细胞中表现出很好的荧光性能。

附图说明

图1为本发明中N,P-CQDs的紫外-可见光吸收光谱和最佳激发(Ex)和发射荧光(Em)光谱以及在365nm紫外灯照射下的荧光照片；

图2为本发明中N,P-CQDs的荧光谱图；

图3为本发明中N,P-CQDs的3D荧光谱图；

图4为本发明中实施例1中人体H1650细胞在无N,P-CQDs(a)，有N,P-CQDs(a1)在激发波长405nm和488nm下观察共聚焦荧光图像；

图5为本发明中实施例2中人体HEPG细胞在无N,P-CQDs(b)，有N,P-CQDs(b1)在激发波长405nm和488nm下观察共聚焦荧光图像；

图6为本发明中实施例3中人体HelaS3细胞在无N,P-CQDs(c)，有N,P-CQDs(c1)在激发波长405nm和488nm下观察共聚焦荧光图像；

图7为本发明中实施例4人体Raji细胞在无N,P-CQDs(d)，有N,P-CQDs(d1)在激发波长405nm和488nm下观察共聚焦荧光图像；

图8为本发明中实施例5人体RPMI8226细胞在无N,P-CQDs(e)，有N,P-CQDs(e1)在激发波长405nm和488nm下观察共聚焦荧光图像。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

一种基于氮磷共掺杂生物质基碳量子点，制备步骤如下：

(1)将一定量的漂白针叶浆和去离子水中混合，使得浆浓保持在2％，在疏解机中充分搅拌，使得浆完全分散，放置于200目浆袋中除去部分去离子水，使得浆中含水量控制在50％，于密封条件下储存于5℃环境下，备用；

(2)以疏解后的漂白针叶浆(绝干)为原料，加入磷酸氢二铵，其加入量为1：1(g：g)，再加入去离子水混合，控制浆料纤维的重量和去离子水体积比为1：10(g：mL)；充分搅拌30min使其分散均匀，然后转移至高温高压反应釜中。高温高压反应釜条件设置为：温度180℃，压强2MPa，保温6h，搅拌速度为300转/分钟，反应终止后停止加热，待反应釜自然冷却至室温；

(3)将上述步骤(2)中所得的液体和固体从高温高压反应釜中取出，过滤除去固体，收集滤液。将所得滤液采用截留分子量为3500道尔顿的透析装置进行透析处理，进行透析处理2天，过滤后所得滤液即为N,P-CQDs溶液；

(4)将收集到的滤液经过冷冻干燥处理，收集并留存，得碳量子点固体。

利用如上所述的N,P-CQDs进行细胞成像检测的方法，步骤如下：

取细胞密度为70-80％之间的肺癌细胞(H1650)，消化离心收集，在共聚焦专用八孔皿每孔加入200μL 1x10⁵/mL细胞悬浮液，培养24h后使用。

取30μL(1mg/mL)N,P-CQDs加入到八孔皿中，在37℃、5％CO₂的环境中与细胞共孵育24h，用磷酸盐缓冲溶液洗去未结合的氮磷掺杂碳量子点，置于奥林巴斯共聚焦显微镜(FV1000)60倍油镜下观察。分别以405和488nm激光激发，相应通道采集荧光信号。

检测结果：

在上述实验条件下：如图1、图2和图3所示，N,P-CQDs在荧光检测发现最佳激发波长为365nm，发射波长为439nm。N,P-CQDs的碳元素为52.30％，氧元素为33.53％，氮元素为8.33％，磷含量5.84％。在pH＝2.0-8.0的环境条件下保持稳定且较强的荧光。如图4所示，N,P-CQDs在贴壁细胞H1650中有很强的荧光，并且可以看出N,P-CQDs主要分布于H1650的细胞膜表面，因此可以清晰的观察细胞轮廓。

实施例2

一种基于氮磷共掺杂生物质基碳量子点，制备步骤如下：

(1)将一定量的漂白针叶浆和去离子水中混合，使得浆浓保持在6％，在疏解机中充分搅拌，使得浆完全分散，放置于200目浆袋中除去部分去离子水，使得浆中含水量控制在30％，于密封条件下储存于5℃环境下，备用；

(2)以疏解后的漂白针叶浆(绝干)为原料，加入磷酸氢二铵，其加入量为1：2(g：g)，再加入去离子水混合，控制浆料纤维的重量和去离子水体积比为1：5(g：mL)；充分搅拌30min使其分散均匀，然后转移至高温高压反应釜中。高温高压反应釜条件设置为：温度160℃，压强0.5MPa，保温6h，搅拌速度为300转/分钟，反应终止后停止加热，待反应釜自然冷却至室温；

(3)将上述步骤(2)中所得的液体和固体从高温高压反应釜中取出，过滤除去固体，收集滤液。将所得滤液采用截留分子量为3500道尔顿的透析装置进行透析处理，进行透析处理2～7天，过滤后所得滤液即为N,P-CQDs溶液；

(4)将收集到的滤液经过冷冻干燥处理，收集并留存，得碳量子点固体。

利用如上所述的N,P-CQDs进行细胞成像检测的方法，步骤如下：

取细胞密度为70-80％之间的肝癌细胞(HEPG)，消化离心收集，在共聚焦专用八孔皿每孔加入200μL 1x10⁵/mL细胞悬浮液，培养24h后使用。

取30μL(1mg/mL)N,P-CQDs加入到八孔皿中，在37℃、5％CO₂的环境中与细胞共孵育24h，用磷酸盐缓冲溶液洗去未结合的氮磷掺杂碳量子点，置于奥林巴斯共聚焦显微镜(FV1000)60倍油镜下观察。分别以405和488nm激光激发，相应通道采集荧光信号。

检测结果：

在上述实验条件下：N,P-CQDs在荧光检测发现最佳激发波长为360nm，发射波长为430nm。碳量子点的碳元素为50.30％，氧元素为35.53％，氮元素为9.33％，磷含量4.84％。在pH＝2.0-7.0的环境条件下保持稳定且较强的荧光。如图5所示，N,P-CQDs在贴壁细胞HEPG中有很强的荧光，并且可以看出N,P-CQDs主要吸附于HEPG的细胞膜表面，未进入细胞质中，这与在H1650中成像有所不同。

实施例3

一种基于氮磷共掺杂生物质基碳量子点，制备步骤如下：

(1)将一定量的漂白针叶浆和去离子水中混合，使得浆浓保持在6％，在疏解机中充分搅拌，使得浆完全分散，放置于200目浆袋中除去部分去离子水，使得浆中含水量控制在20％，于密封条件下储存于5℃环境下，备用；

(2)以疏解后的漂白针叶浆(绝干)为原料，加入磷酸氢二铵，其加入量为1：1(g：g)，再加入去离子水混合，控制浆料纤维的重量和去离子水体积比为1：5(g：mL)；充分搅拌30min使其分散均匀，然后转移至高温高压反应釜中。高温高压反应釜条件设置为：温度180℃，压强2MPa，保温6h，搅拌速度为300转/分钟，反应终止后停止加热，待反应釜自然冷却至室温；

(3)将上述步骤(2)中所得的液体和固体从高温高压反应釜中取出，过滤除去固体，收集滤液。将所得滤液采用截留分子量为3500道尔顿的透析装置进行透析处理，进行透析处理2～7天，过滤后所得滤液即为N,P-CQDs溶液；

(4)将收集到的滤液经过冷冻干燥处理，收集并留存，得碳量子点固体。

利用如上所述的N,P-CQDs进行细胞成像检测的方法，步骤如下：

取细胞密度为70-80％之间的子宫癌细胞(HelaS3)，消化离心收集，在共聚焦专用八孔皿每孔加入200μL 1x10⁵/mL细胞悬浮液，培养24h后使用。

取30μL(1mg/mL)N,P-CQDs加入到八孔皿中，在37℃、5％CO₂的环境中与细胞共孵育24h，用磷酸盐缓冲溶液洗去未结合的氮磷掺杂碳量子点，置于奥林巴斯共聚焦显微镜(FV1000)60倍油镜下观察。分别以405和488nm激光激发，相应通道采集荧光信号。

检测结果：

在上述实验条件下：N,P-CQDs在荧光检测发现最佳激发波长为370nm，发射波长为420nm。碳量子点的碳元素为52.30％，氧元素为37.53％，氮元素为7.33％，磷含量2.84％。在pH＝2.0-8.0的环境条件下保持稳定且较强的荧光。如图6所示，N,P-CQDs在贴壁细胞HelaS3中有很强的荧光，并且可以看出N,P-CQDs主要吸附于HelaS3的细胞膜表面，未进入细胞质中，这与在HEPG中成像基本相同。

实施例4

一种基于氮磷共掺杂生物质基碳量子点，制备步骤如下：

(1)将一定量的漂白针叶浆和去离子水中混合，使得浆浓保持在14％，在疏解机中充分搅拌，使得浆完全分散，放置于200目浆袋中除去部分去离子水，使得浆中含水量控制在40％，于密封条件下储存于5℃环境下，备用；

(2)以疏解后的漂白针叶浆(绝干)为原料，加入磷酸氢二铵，其加入量为1：1(g：g)，再加入去离子水混合，控制浆料纤维的重量和去离子水体积比为1：10(g：mL)；充分搅拌30min使其分散均匀，然后转移至高温高压反应釜中。高温高压反应釜条件设置为：温度160℃，压强1MPa，保温6h，搅拌速度为300转/分钟，反应终止后停止加热，待反应釜自然冷却至室温；

(3)将上述步骤(2)中所得的液体和固体从高温高压反应釜中取出，过滤除去固体，收集滤液。将所得滤液采用截留分子量为3500道尔顿的透析装置进行透析处理，进行透析处理2～7天，过滤后所得滤液即为N,P-CQDs溶液；

(4)将收集到的滤液经过冷冻干燥处理，收集并留存，得碳量子点固体。

利用如上所述的N,P-CQDs进行细胞成像检测的方法，步骤如下：

取细胞密度为70-80％之间的淋巴细胞(Raji)，消化离心收集，在共聚焦专用八孔皿每孔加入200μL 1x10⁵/mL细胞悬浮液，培养24h后使用。

取30μL(1mg/mL)N,P-CQDs加入到八孔皿中，在37℃、5％CO₂的环境中与细胞共孵育24h，用磷酸盐缓冲溶液洗去未结合的氮磷掺杂碳量子点，置于奥林巴斯共聚焦显微镜(FV1000)60倍油镜下观察。分别以405和488nm激光激发，相应通道采集荧光信号。

检测结果：

在上述实验条件下：N,P-CQDs在荧光检测发现最佳激发波长为350nm，发射波长为440nm。碳量子点的碳元素为50.30％，氧元素为35.53％，氮元素为9.33％，磷含量4.84％。在pH＝2.0-8.0的环境条件下保持稳定且较强的荧光。如图7所示，N,P-CQDs在悬浮细胞Raji中有很强的荧光，并且可以看出N,P-CQDs在Raji细胞中均匀分散，说明N,P-CQDs成功进入Raji细胞的细胞质中。

实施例5

一种基于氮磷共掺杂生物质基碳量子点，制备步骤如下：

(1)将一定量的漂白针叶浆和去离子水中混合，使得浆浓保持在14％，在疏解机中充分搅拌，使得浆完全分散，放置于200目浆袋中除去部分去离子水，使得浆中含水量控制在30％，于密封条件下储存于5℃环境下，备用；

(2)以疏解后的漂白针叶浆(绝干)为原料，加入磷酸氢二铵，其加入量为1：2(g：g)，再加入去离子水混合，控制浆料纤维的重量和去离子水体积比为1：10(g：mL)；充分搅拌30min使其分散均匀，然后转移至高温高压反应釜中。高温高压反应釜条件设置为：温度180℃，压强5MPa，保温6h，搅拌速度为300转/分钟，反应终止后停止加热，待反应釜自然冷却至室温；

(3)将上述步骤(2)中所得的液体和固体从高温高压反应釜中取出，过滤除去固体，收集滤液。将所得滤液采用截留分子量为3500道尔顿的透析装置进行透析处理，进行透析处理3天，过滤后所得滤液即为N,P-CQDs溶液；

(4)将收集到的滤液经过冷冻干燥处理，收集并留存，得碳量子点固体。

利用如上所述的N,P-CQDs进行细胞成像检测的方法，步骤如下：

取细胞密度为70-80％之间的骨髓瘤细胞(RPMI8226)，消化离心收集，在共聚焦专用八孔皿每孔加入200μL 1x10⁵/mL细胞悬浮液，培养24h后使用。

取30μL(1mg/mL)N,P-CQDs加入到八孔皿中，在37℃、5％CO₂的环境中与细胞共孵育24h，用磷酸盐缓冲溶液洗去未结合的氮磷掺杂碳量子点，置于奥林巴斯共聚焦显微镜(FV1000)60倍油镜下观察。分别以405和488nm激光激发，相应通道采集荧光信号。

检测结果：

在上述实验条件下：N,P-CQDs在荧光检测发现最佳激发波长为362nm，发射波长为435nm。碳量子点的碳元素为50.30％，氧元素为35.53％，氮元素为9.33％，磷含量4.84％。在pH＝2.0-8.0的环境条件下保持稳定且较强的荧光。如图8所示，N,P-CQDs在悬浮细胞RPMI8226中有很强的荧光，并且可以看出N,P-CQDs在RPMI8226细胞中均匀分散，说明N,P-CQDs成功进入RPMI8226细胞的细胞质中。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。