阅读说明：本技术 长链脂肪酸辅酶a连接酶1在诊断或预测子痫前期中的应用 (Application of long-chain fatty acid coenzyme A ligase 1 in diagnosis or prediction of preeclampsia ) 是由 蔡伟 徐忠伟 牛秀珑 陈少伯 李玉明 于 2019-11-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了长链脂肪酸辅酶A连接酶1的标记试剂在制备用于诊断孕妇是否患有子痫前期或者用于预测孕妇是否具有患子痫前期的风险的试剂盒中的应用,属于生物医学领域。本发明还公开了用于诊断孕妇是否患有子痫前期或者用于预测孕妇是否具有患子痫前期的风险的试剂盒,包括长链脂肪酸辅酶A连接酶1的标记试剂。本发明为妊娠期高血压疾病子痫前期的诊断和预警提供了一个新的生物标记物,具有重要的临床价值。(The invention discloses an application of a labeled reagent of long-chain fatty acid coenzyme A ligase 1 in preparation of a kit for diagnosing whether a pregnant woman has preeclampsia or predicting whether the pregnant woman has the risk of preeclampsia, and belongs to the field of biomedicine. The invention also discloses a kit for diagnosing whether the pregnant woman has preeclampsia or predicting whether the pregnant woman has the risk of preeclampsia, which comprises a labeling reagent of the long-chain fatty acid coenzyme A ligase 1. The invention provides a new biomarker for diagnosis and early warning of preeclampsia of hypertensive disorders in pregnancy and has important clinical value.)

长链脂肪酸辅酶A连接酶1在诊断或预测子痫前期中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体地，涉及长链脂肪酸辅酶A连接酶1在诊断或预测子痫前期中的应用。

背景技术

子痫前期（preeclampsia, PE）作为是妊娠期高血压疾病的重要亚型，占妊娠期高血压疾病的一半以上，是全球导致孕产妇死亡的主要原因之一。PE的病因和发病机制至今仍未完全阐明，目前的研究表明PE是一种多种因素、多种机制共同作用的胎盘源性疾病，并与心血管疾病（cardiovascular disease, CVD）具有相似的病理生理机制，如都存在氧化应激、血管内皮损伤、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱等。PE不但导致妊娠的不良事件，威胁母儿的生命，也是母子两代远期患CVD疾病的风险因素，多个研究及荟萃分析均表明，PE女性远期患心肌梗死、脑卒中等CVD疾病风险高达数倍，且CVD发病率与PE严重程度呈正相关，其子代的高血压、CVD和代谢疾病的风险也明显增加。

PE诊断标准为妊娠20周后出现收缩压≥140 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg，且伴有下列任一项：尿蛋白≥0.3g/24h，或尿蛋白/肌酐比值≥0.3，或随机尿蛋白≥（+）（无法进行尿蛋白定量时的检查方法）；无蛋白尿但伴有任何一种器官或系统受累：心、肺、肝、肾等重要器官，或血液系统、消化系统、神经系统的异常改变，胎盘-胎儿受到累及等。从上述诊断标准可以看出PE明确诊断需要妊娠20周以后，并且诊断后进行治疗的措施有效。《妊娠期高血压疾病：国际妊娠期高血压研究学会分类、诊断和管理指南（2018）》及《中国妊娠期高血压疾病诊治指南（2015）》指出PE的主要治疗是预防抽搐，有指征地降压、利尿、镇静，密切监测母胎情况，预防和治疗严重并发症，适时终止妊娠。

目前PE患者带来全球孕产妇的死亡率和围产期不良事件居高不下的情况下，PE唯一有效的治疗途径就是终止妊娠，娩出胎盘，而过早的终止妊娠又可带来早产儿及产妇的不良结局，加重家庭和社会的负担。因此若能***PE，早期给予干预，就可能减少PE的发生，减少妊娠不良结局，并减少孕期CVD风险暴露。为了这一目标，目前已有大量的PE预测研究和验证工作，主要以查找新的血清生物标志物和建立预测模型进行早期预测，然而迄今为止，妊娠早中期尚缺乏能够可靠预测全部子痫前期的方法。即使出现的少数具有潜力的标志物（如sFlt-1/PlGF比值），也只是在孕晚期延长期待治疗方面有价值，不能用于预测PE发生；有些标志物预测效能不明显或是不稳定，无法应用于临床。有研究应用母体危险因素、血压、PlGF和子宫动脉多普勒组合可能预测早产型子痫前期（＜37周），但其有效性存在较高的假阳性或假阴性结果。所以，寻找敏感的子痫前期生物标记物，对于早期预警和诊断妊娠期高血压疾病子痫前期非常重要。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种子痫前期生物标记物。为此，发明人进行了大量的探索，出乎意料地发现长链脂肪酸辅酶A连接酶1（Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 1，ACSL1）与子痫前期显著相关，并进一步得到了验证，从而完成本发明。

本发明一方面提供长链脂肪酸辅酶A连接酶1的标记试剂在制备用于诊断孕妇是否患有子痫前期或者用于预测孕妇是否具有患子痫前期的风险的试剂盒中的应用。

ACSL1是长链脂肪酸辅酶A连接酶家族的同工酶。虽然底物特异性、亚细胞定位和组织分布不同，但该家族的所有同工酶都将游离长链脂肪酸转化为脂肪酸酰基辅酶a酯，从而在脂质生物合成和脂肪酸降解中发挥关键作用。

进一步地，所述标记试剂为抗体。在本发明的一个具体实施方案中，所述抗体为兔抗ACSL1抗体。

本发明的第二方面提供一种用于诊断孕妇是否患有子痫前期或者用于预测孕妇是否具有患子痫前期的风险的试剂盒，包括长链脂肪酸辅酶A连接酶1的标记试剂。

进一步地，所述标记试剂为抗体。在本发明的一个具体实施方案中，所述抗体为兔抗ACSL1抗体。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒通过检测来自所述孕妇样本中长链脂肪酸辅酶A连接酶1的表达量是否超过阈值来完成诊断或预测，如果所述样本中长链脂肪酸辅酶A连接酶1的表达量超过阈值，则所述孕妇患有子痫前期或者具有患子痫前期的风险。

在本发明的一些具体实施方案中，所述阈值为具有医学统计意义数量的正常孕妇样本中长链脂肪酸辅酶A连接酶1表达量的95%置信区间的上限值。

在本发明的另一些具体实施方案中，所述阈值为具有医学统计意义数量的患有子痫前期的孕妇样本中长链脂肪酸辅酶A连接酶1表达量的95%置信区间的下限值。

进一步地，所述试剂盒进一步包括阳性对照品和阴性对照品。

在本发明的一些实施方案中，所述阳性对照品为诊断为子痫前期的孕妇样本。

在本发明中，所述孕妇样本为血清样本和/或胎盘样本。

妊娠期高血压疾病子痫前期早期预警与诊断标志物必须具备特异性好、敏感性高、重现性好和患者依从性好等特点。实验证明，ACSL1可作为妊娠期高血压疾病子痫前期早期预警及诊断标志物。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明为妊娠期高血压疾病子痫前期的诊断和预警提供了一个新的生物标记物，具有重要的临床价值。

利用质谱结果，证实妊娠期高血压疾病子痫前期患者血清样本中ACSL1表达水平显著高于正常妊娠组患者。

妊娠期高血压疾病子痫前期患者胎盘组织中ACLS1的相对水平极显著的高于正常妊娠胎盘组织中ACSL1的性对水平（p<0.0001），灵敏度为91.13%、特异性为93.67%。

妊娠期高血压疾病子痫前期患者血清中ACLS1的相对水平极显著的高于正常妊娠患者血清中ACSL1的性对水平（p<0.0001）。

ACSL1可用于预警性筛查妊娠期高血压疾病子痫前期患者，且结果准确，操作简便，具有较大的推广应用价值。

附图说明

图1示出了实施例1中质谱检测结果。

图2示出了实施例1中的蛋白组学信号通路检测结果。

图3示出了实施例2中免疫组织化学的结果。

图4示出了实施例2中的光密度值分析结果。

图5示出了实施例3中的ACSL1作为受试者工作特征曲线 (receiver operatingcharacteristic curve，ROC曲线)，1代表正常人、2子痫前期产妇患者。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例 1 长链脂肪酸辅酶A连接酶1作为早期预警和诊断妊娠期高血压疾病筛查标记物

配对样本：30例子痫前期产妇胎盘组织；30例正常产妇胎盘组织；在病例收集过程中，胎盘组织样本收集自年龄以及孕周大致相同，并且排除糖尿病，肥胖以及高脂血症等代谢性疾病的孕妇。临床试验经医学伦理委员会批准的人体研究方法。所有操作都符合相关的伦理准则。

称取胎盘组织各0.3g，用生理盐水清除残留血液后，置于液氮组织中速冻，放置于盛有液氮的研钵中研磨成粉状。加入400μL蛋白质裂解液，冰浴条件下进行超声裂解，功率300W，工作1s，间歇5s，50个循环。充分破碎后，4℃，1200 rpm离心10min，收集上清，分装后-80℃贮存备用、BCA法检测蛋白浓度。常规Typsin蛋白酶消化，经脱盐、真空干燥等步骤富集各组肽段样本。

实验采用iTRAQ标记，实现高精度的蛋白组学UPLC-LTQ Orbitrap-Fusion 超高压液相与质谱分析子痫前期胎盘组织与正常胎盘组织蛋白表达变化，使用 MaxQuant(version 1.5.1.2)搜索引擎对质谱检测产出的数据文件进行搜库分析， 数据库使用Uniport提供的人类蛋白序列数据库(Version：201707)。经典卡值： 蛋白质丰度增加1.0倍或者蛋白质丰度减少1.0倍。通过人工检测质谱图，选择 ASCL1蛋白的一个定量肽段(GAVTGSVERTK)，发现ACSL1基因在子痫前期 产妇胎盘组织中表达显著上调，结果如图1所示。与正常胎盘组织相比，子痫 前期胎盘组织筛选出差异蛋白619个，其中增加表达蛋白292个，降低表达327 个。通过网络重塑显示这些差异蛋白与细胞外基质、血小板激活、过氧化物酶 体增殖剂激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)介导炎 症反应和组织损伤修复关系密切(图2)。

实施例2 ACSL1在子痫前期产妇患者胎盘组织和正常产妇胎盘组织中的水平差异

配对样本：30例子痫前期产妇胎盘组织；30例正常产妇胎盘组织；

各个患者均为知情同意的志愿者。

分别取各个样本，进行免疫组织化学检测。采用一抗为Abcam公司兔抗ACSL1抗体，货号Ab76702。免疫组织化学试剂盒采用康为世纪生物科技有限公司SP Rabbit & MouseHRP Kit 兔/鼠通用型Streptavidin-HRP试剂盒，货号CW0120A。采用DAB显色反应。某个子痫前期产妇患者胎盘组织和某个正常产妇胎盘组织的结果见图2（放大100倍）。采用Image-Pro Plus 6.0软件对各个样本的子痫前期产妇患者胎盘组织和正常产妇胎盘组织的照片分别进行扫描和光密度值分析，得到ACSL1的相对水平，结果见图3（每个点代表1个样本）。对于子痫前期产妇患者来说，胎盘癌组织中ACSL1的相对水平极为显著的高于正常产妇胎盘组织中ACSL1的相对水平。

基于如下标准评判：对于某个待测患者而言，A值=子痫前期的积分光密度值（IOD）/正常产妇胎盘组织组织的积分光密度值（IOD）。

实施例3 ACSL1在不同人群血清中的水平差异

两个人群：30例子痫前期产妇；30例正常产妇；均为知情同意的志愿者。

取正常妊娠孕妇以及子痫前期孕妇血清各30例，每例取200μL。4℃，3500rpm离心10min后，取上清待测。采用Abbexa公司ACSL1 ELISA试剂盒，货号abx110794。

按照试剂盒的说明书进行后续操作：向96孔板中加入100μL血清上清，向空白孔中加入100μL试剂一，向标准孔中加入100μL浓度为20μM的ACSL1标准液。向所有孔中加入100μL试剂二以及25μL试剂三。混匀后静置5min。

用酶标仪检测各孔在405nm波长处的吸光度值，并根据下列公式计算各孔的ACSL1浓度：

血清中ACSL1含量=[（测定OD值-空白OD值）/（标准OD值-空白OD值）]×标准管浓度（20μmol/L）。

ACSL1在子痫前期产妇患者血清中的ACSL1水平极为显著的高于正常人血清中的ACSL1水平。

实验还对ACSL1对PE的预测作用进行了ROC分析，ACSL1的AUC为0.727（图5）。

实施例2和实施例3的结果说明，ACSL1蛋白的水平可用于检测或辅助检测待测患者是否为子痫前期患者。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。