阅读说明：本技术 用于识别低密度脂蛋白的酸性状态及糖化状态的检测试剂及试剂盒 (Detection reagent and kit for identifying acidic state and glycated state of low-density lipoprotein ) 是由 山田健一 井手友美 石田悠马 一圆刚 山本启一 于 2018-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种用于全面地检测低密度脂蛋白的氧化状态及糖化状态的检测试剂。更详细的,根据本发明,在使用发色团标记抗体来检测氧化低密度脂蛋白及糖化脂蛋白的同时,使用荧光氮氧自由基2,2,6-三甲基-4-(硝基苯并[1,2,5]噁二唑-7-基氨基)-6-戊基哌啶-1-氧基(NBD-Pen)来检测脂质自由基。(The present invention provides a detection reagent for comprehensively detecting the oxidation state and the glycation state of low-density lipoprotein. More specifically, according to the present invention, while oxidized low density lipoproteins and glycated lipoproteins are detected using a chromophore-labeled antibody, lipid radicals are detected using fluorescent nitroxide radical 2,2, 6-trimethyl-4- (nitrobenzo [1,2,5] oxadiazol-7-ylamino) -6-pentylpiperidin-1-yloxy (NBD-Pen).)

用于识别低密度脂蛋白的酸性状态及糖化状态的检测试剂及 试剂盒

技术领域

本发明涉及可视化地检测氧化及糖化脂蛋白的技术。更具体地，本发明提供用于通过荧光观察来检测低密度脂蛋白中的脂质的氧化状态及蛋白质的糖化状态的检测试剂及试剂盒。

背景技术

近年来，已经发现脂质的氧化、糖化会促进衰老。已知受到氧化、糖化等变质的脂质与各种疾病相关，通过查明这种脂质的变质(氧化及糖化)的产生原因，使其不仅在防止老化、美容领域，在疾病的预防及治疗方面也发挥用处的研究越来越多。

超氧阴离子基团、羟基自由基、过氧化氢及单态氧等活性氧簇(ROS)影响生物体内的各种现象，其中，已知羟基自由基的反应性极强，会带来各种疾病，正在积极地对其进行研究。已将发现这种羟基自由基作用于脂质而生成脂质自由基(lipid radical)。

由于脂质自由基反应性高且不稳定，因此生成脂质自由基时会连锁地发生脂质过氧化反应，产生脂质过氧化物，进而生成作为代谢产物的亲电性化合物。脂质含有许多不饱和脂肪酸，由于其活性亚甲基部分的氢原子被夺走，因此容易受到自由基的攻击，诱发由反应式(a)～(c)示出的过程所构成的脂质过氧化连锁反应(图1)。

(式1)

LH+R·→L·+RH (a)

LOO·+LH→LOOH+L· (c)

自由基(R·)从不饱和脂肪酸(LH)夺走氢元素，开始连锁反应(a)；利用所生成的脂质自由基(L·)与氧分子的反应，来生成脂质过氧自由基(Lipid peroxyl radical)(LOO·)(b)；而后，脂质过氧自由基从周围的不饱和脂肪酸夺走氢原子，生成过氧化脂质(LOOH)和脂质自由基(L·)(c)。在再生的脂质自由基(L·)的作用下，开始下一次的连锁反应循环。

关于过氧化脂质(LOOH)，可转化为以丙二醛、4-羟基-2-壬烯醛、丙烯醛、丙醛、乙二醛为首的数百种以上的亲电性化合物作为其代谢产物。

已经发现这些代谢产物单独地、或者形成与蛋白质的复合体后，各自具有细胞毒性、炎症、致突变性。

在生物体内，不溶于水的脂质与载脂蛋白结合而形成脂蛋白。此外，形成细胞膜所必须的胆固醇也不溶于水，同样地与载脂蛋白结合。根据比重，脂蛋白被分类为高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等。

特别是LDL中的脂质(图2a)在ROS等的作用下生成脂质自由基，并经由过氧化脂质而生成代谢产物。如此，将只有脂质受到氧化变质状态的LDL(oxidized-state LDL)称为轻度修饰LDL(minimally modified oxidized LDL；MM-LDL)(图2b)。进而，生成的代谢产物通过LDL中的蛋白质的赖氨酸残基、精氨酸残基来进行结合，成为所谓的氧化修饰LDL(oxidized LDL；OxLDL)(图2c)。

如图3所示，通过大量的研究已将发现这种氧化修饰LDL会引起以年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration；AMD)、动脉硬化为首的各种疾病(例如，非专利文献1、2等)。

此外，已经发现当血糖值升高时，糖类与蛋白质接合，成为3-脱氧葡糖醛酮(3-deoxyglucosone:3DG)、乙二醛(glyoxal:GO)、甲基乙二醛(methylglyoxal:MGO)、甘油醛(glyceraldehyde)、乙醇醛(glycolaldehyde)等羰基化合物，最终与蛋白质的赖氨酸残基(Lys)、精氨酸残基(Arg)结合而成为戊糖素(pentosidine)、交联素(crossline)，羧甲基赖氨酸(Nε-(carboxymethyl)lysine；CML)、羧乙基赖氨酸(Nε-(carboxyethyl)lysine；CEL)、吡咯素(pyrraline)所代表的糖基化终产物(advanced glycation endproducts:AGE)。已经发现若这种AGE在体内积蓄，则会引起各种疾病。例如，根据报告，AGE若积蓄于血管则会引起动脉硬化(非专利文献3)，若积蓄于骨骼则会引起骨质疏松症(非专利文献4)，若积蓄于脑部则会引起阿尔茨海默病(非专利文献5)。

LDL上的蛋白质被糖化而成为糖化LDL。

如上所述，已经发现若构成LDL的脂质、蛋白质被氧化或者糖化，则会给生物体全身带来各种疾病，并研究了各种针对措施，此外，开发了检测氧化状态LDL(MM-LDL,OxLDL)、糖化LDL的技术。

(现有技术文献)

(非专利文献)

非专利文献1：Javadzadeh,A.et al.Retina.2012,32(4),658

非专利文献2：Holvoet,P.et al.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2003,23(8),1444

非专利文献3：Brownlee M.,et al.:Science.1986；232:1629-1632

非专利文献4：Saito M.,et al.:Osteoporos Int.2006；17:986-995

非专利文献5：Reddy VP,et al.:Neurotox Res.2002；4:191-209

非专利文献6：Itabe H.et al.J.Atheroscler,Thromb.2007,14(1),1-11

非专利文献7：Cerami A.,et al.,Sci.Am.256；90-96:1987

非专利文献8：Kotani K et al.,Biochim Biophys Acta.1215:121-5,1994

非专利文献9：Miyata T,et al.,FEBS Lett 445:202-206,1999

发明内容

(发明所要解决的问题)

板部等人综合考虑了通过各种氧化修饰LDL的免疫学检测方法来得到的结果，确认了各种检测方法之间的差异(非专利文献6)。更具体地，板部等人的方法和协和medex株式会社提供的MX试剂盒都通过使用DLH3抗体的捕获ELISA法来测定氧化修饰LDL浓度，但相关性弱(图4)。

虽然DLH3抗体是用于识别在氧化修饰LDL上形成的氧化磷脂酰胆碱(Oxidizedphosphatidylcholine)的，但在氧化修饰LDL上，如上所述，存在作为过氧化脂质(LOOH)的代谢产物的丙二醛(malondialdehyde；MDM)、4-羟基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal；HEN)、丙烯醛(acrolein；ACR)、丙醛(propanal)、乙二醛(glyoxal)等各种与蛋白质的复合体。即，在现有的方法中，只能观测氧化修饰LDL的氧化标记的一部分。

糖化LDL上的AGE大多具有荧光性，并以370nm的激发波长来发射具有440nm的发光波长的荧光(例如，非专利文献7等)。由此，正在研究从人的皮肤直接进行荧光测定的方法。虽然已确认存在于皮肤的荧光AGE为戊糖素，但检测尚未成功。

另一方面，识别戊糖素、CML、CEL、吡咯素等的抗体、检测ACE的ELISA试剂盒已有市售。

如此，虽然分别荧光测定了氧化、糖化了的各个部位，但并没有开发出全面地观察LDL的变质状态(氧化状态及糖化状态)的方法。因此，本发明的发明人以提供一种全面地观察LDL的变质状态的方法作为课题。

(解决问题所采用的措施)

本发明的发明人开发了如下的荧光检测的方法：从在另一研究中受到氧化应激的生物体内提取脂质，通过将如结构式(1)：

(化学式1)

所示的荧光氮氧自由基2,2,6-三甲基-4-(硝基苯并[1,2,5]噁二唑-7-基氨基)-6-戊基哌啶-1-氧基(NBD-Pen)作用于这种脂质提取物，来捕捉脂质自由基或者其自由基片段。

因此，本发明的发明人同时或者逐步进行藉由使用上述荧光氮氧自由基的荧光检测来进行的轻度修饰LDL的检测、藉由ELISA法来进行氧化修饰LDL的检测、以及藉由ELISA法来进行的糖化LDL的检测，将LDL的氧化状态及糖化状态全部以荧光来可视化，从而实现了个别地或者全面地检测LDL的变质状态。

若检测轻度修饰LDL的荧光发光波长、检测氧化修饰LDL的荧光发光波长及检测糖化LDL的发光波长各不相同，则可识别三种变质状态。此外，若所有的荧光发光波长都相同，则可全面地确认LDL所受到的变质状态。

(发明的效果)

通过荧光法将LDL所受到的变质(氧化及糖化)的状态可视化，由此可得到对早期发现因变质LDL而引起的疾病、改善诊断、治疗有帮助的信息。

附图说明

图1为说明脂质过氧化反应的示意图。

图2为示出低密度脂蛋白(LDL)的氧化状态的示意图。

图3为与氧化修饰LDL相关的疾病。

图4为示出现有的两个氧化修饰LDL的检测方法的相关性的图(出处：非专利文献6)。

图5为示出针对藉由NBD-Pen来检测LDL中的脂质自由基的检测灵敏度，因自由基发生剂所造成的不同的图。

图6为就使用本发明的使用了NBD-Pen的检测方法和现有的检测方法来检测氧化修饰LDL的灵敏度进行比较的图。

图7为施用了NBD-Pen的动脉硬化模型小鼠的大动脉样本的荧光显微镜图像(a)，油红(oil red)染色后的斑块的电子图像(b)。

具体实施方式

参考例一：荧光氮氧自由基的开发

本发明的发明人开发了如结构式(2)：

(化学式2)

所示的TEMPO系氮氧自由基2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧基的2,6-位取代产物(substitution product)的新的合成方法，并发现若将烷基链导入自由基周围，则可提高亲脂性和脂质过氧化抑制能力，高效地捕捉脂质自由基。

此外，由于氮氧自由基(NO·)为具有顺磁性的稳定的自由基，并具有在伴随着电荷分离状态的光诱导电子转移、电子自旋交换而引起系统间交叉的作用下荧光减弱的性质，因此在分子内电子转移的作用下，在氮氧自由基上共价结合了荧光发色团的荧光性氮氧自由基的荧光处于猝灭状态。然而，经确认，若氮氧自由基与自由基反应而失去顺磁性，则由于不会发生电子转移，因此会成为荧光发射状态。即，通过荧光观测，荧光性氮氧自由基可用作为检测自由基的捕捉的探针。

本发明的发明人将氮氧自由基TEMPO的4-位羰基变换为氨基，使如结构式(3)：

(化学式3)

所示的荧光发色团7-硝基苯并呋咱(7-nitrobenzofurazan；NBD)共价结合，以使其具有与氮氧自由基TEMPO的自由基部位的接近性。

成为检测对象的脂质分子的大部分存在于生物膜内，形成疏水环境。因此，虽然荧光在亲水环境中衰减，但在疏水环境中选择性地发射高荧光的环境响应性的荧光发色团是优选的。因此，本发明的发明人选择将在生物膜的相变、膜融合、或者细胞内脂质代谢等脂质领域中广泛应用的NBD作为荧光发色团。

NBD诱导体的激发波长约为470nm，其适合于氩激光激发(488nm)，因此可适用于使用了荧光显微镜的成像，因此非常有利。进而，最大发光波长为530nm，从可减弱由生物体内的物质而引起的自体荧光的观点来看，使用NBD诱导体也是有利的。

本发明的发明人发现，通过在TEMPO系氮氧自由基的自由基部位的附近导入链状烷基，化合物的亲脂性、立体阻碍发生变化，结果，可高效地捕捉脂质自由基。

本发明的发明人合成了将2-位置换为两个甲基，6-位置换为甲基和戊基的化合物A(NBD-Pen)，并将其作为脂质反应性高的NBD-氮氧自由基。

(化学式4)

(A)

实施例一：利用NBD-Pen的LDL中的脂质自由基的检测

首先，调查了化合物A(NBD-Pen)能否检测在LDL中生成的脂质自由基。在氧化刺激中，使用了铜离子、铁离子及与LDL的亲和性高且被指出与动脉硬化症相关的铁卟啉Hemin：

(化学式5)

在含有0.5％的MeCN的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中溶解了20μg蛋白质/ml的LDL和10μM的NBD-Pen的溶液中，加入0～3μM的CuSO₄、FeSO₄或者Hemin，使其产生脂质自由基。

若将这些溶液的荧光强度(λex：470nm；λem：530nm)在37℃下孵育60分钟，然后在37℃下测定，则Cu²⁺、Fe²⁺或是Hemin都以浓度依存的方式增强荧光强度，特别地，通过添加Hemin，荧光检测的灵敏度升高。(图5)。由此，表明NBD-Pen与LDL中产生的脂质自由基发生反应。

实施例二：对于氧化修饰LDL的本发明的使用了NBD-Pen的检测方法和现有的检测方法之间的比较

现在使用的氧化修饰LDL的检测方法主要有两种。

第一种为琼脂糖凝胶电泳法。受到氧化变性的LDL的负电荷由于蛋白质修饰而增加。因此，若将样本注入琼脂糖凝胶后施加电位梯度，则阴性化的LDL向阳极侧的电子迁移率升高。即，通过该电子迁移率可测定LDL的氧化度。然而，存在于人血液中的氧化修饰LDL浓度低至LDL浓度的0.1％以下，以本方法的灵敏度很难检测血液中的氧化修饰LDL。

第二种为使用了抗氧化修饰LDL单克隆抗体的ELISA法。由于使用抗体，因此ELISA法可实现高灵敏度的检测，实际上也成功实现了血液中的氧化修饰LDL的检测。由此，对于氧化修饰LDL的研究迅速发展。然而，由于LDL为由脂质和蛋白质而成的巨大的粒子，因此抗氧化修饰LDL单克隆抗体必然只识别其中的一部分而不是粒子整体。因此，大部分ELISA法将识别氧化变质位点的抗体和识别存在于LDL中的载脂蛋白B的抗体进行组合，通过捕获ELISA法来检测氧化修饰LDL。进而，由于在LDL氧化过程中产生的脂质过氧化代谢产物具有多种多样的化学结构，由此产生的蛋白质修饰位点也多种多样，因此，必须制备与它们各自对应的抗体。因此，开发了各种抗氧化修饰LDL抗体。例如，已知用于识别作为脂质过氧化代谢产物的MDA、HNE通过修饰赖氨酸残基(Lys)而产生的MDA-Lys、HNE-Lys、Acrolein-Lys的ML25(非专利文献8)、NA59(非专利文献9)、抗丙烯醛单克隆抗体(例如，NIKKEN SEIL CO.,LTD.日本老化控制研究所，MAR)等。

如上所述，在现有的琼脂糖凝胶电泳法、ELISA法中，仅将蛋白质变质后的氧化修饰LDL作为目标。另一方面，作为氧化脂质的检测方法，有利用脂质氧化时的共轭二烯烃的形成来测定230nm吸收带、LC/MS、TBARs(2-硫代巴比妥酸反应物)法等方法。利用吸光光度法的检测可随时间推移而追踪脂质氧化反应，是掌握LDL氧化机理的细节的有用的方法，但在灵敏度、选择性方面存在不足。与此相对，LC/MS、检测MDA的TBARs法的灵敏度高。然而，前者存在装置价格高且每一个样本的测定时间长而缺乏通用性的缺点，后者在加合物形成过程中进行加热处理时，未氧化脂质变为类似于MDA的结构而显示为假阳性，都存在改善的余地。

通过吸光光度法追踪由脂质氧化而生成的共轭二烯烃的234nm附近的吸收带。此外，使用作为过氧化脂质(LOOH)检测荧光探针的二苯基-1-吡啶膦(Diphenyl-1-pyrenylphosphate；DPPP)来进行测定。其结果，在这次使用的浓度范围内，任何方法都无法检测脂质过氧化物(不显示数据)。

而后，与实施例一同样地，对于通过添加Hemin而进行了60分钟氧化刺激的LDL，使用电泳法、TBARs法来进行评价。

具体地，在含有0.5％的MeCN的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS；pH 7.4)中溶解了20μg蛋白质/ml的LDL和10μM的NBD-Pen的溶液中，加入0～3μM的Hemin，使其产生脂质自由基，在37℃下孵育60分钟后，通过各方法测定反应后的溶液。

(利用电泳法的LDL电子迁移率的测定)

使20μg蛋白质/ml的LDL、0～3μM的Hemin在PBS(pH 7.4)中混合后，使其反应一小时，而后将10μl得到的溶液添加于琼脂糖凝胶，以50V的电压进行两小时的电泳处理。琼脂糖凝胶由将1％Agarose H14 TAKARA加入TAE缓冲液，加热、溶解后，倒入模具而后静置而成。泳动缓冲区中使用了TAE缓冲液。考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue；CBB)染色后，使用凝胶成像装置来拍摄，并计算电子迁移率。以不添加Hemin的结果为基准，使用比来表示数值。

(利用TBARs法的LDL中TBARs的检测)

使20μg蛋白质/ml的LDL、0～3μM的Hemin在PBS(pH 7.4)中混合后，使其反应一小时，而后在160μl得到的溶液中加入40μl的20％乙酸、60μl的1.3％硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid；TBA)、15μl的10％SDS，在60℃、遮光条件下使其反应40分钟后，生成了MDA-TBA₂加合物。其后，以2000rpm来离心分离4分钟，测定荧光强度(λex：532nm；λem：585nm)。以不添加Hemin的结果为基准，使用比来表示数值。

(使用了NBD-Pen的LDL中脂质自由基的荧光检测)

在本发明的使用了NBD-Pen的荧光检测法中，以不添加Hemin时的荧光强度为基准，用比分别表示实施例一中得到的荧光强度。

(结果)

在电泳法中，添加3μM时，仅微量向阴极移动。在TBARs中，虽然TBARs水平依赖Hemin浓度而上升，但相比NBD-Pen其水平较低(图6)。

通过实施例一及二可证实，若通过添加Hemin来进行氧化刺激，并使用NBD-Pen，则可高效地对氧化修饰LDL的状态进行荧光观察。

实施例三：本发明的使用了NBD-Pen的氧化脂质的荧光映像(fluorescencemapping)

给6周龄的雄性Apo-E基因敲除小鼠(Apo-/-)喂食高脂食物，三周后，通过腹膜内注射以500μM/kg的剂量施用NBD-Pen。

施用NBD-Pen的15分钟后，对小鼠进行三种混合麻醉，使其死亡，并迅速取下胸主动脉。使用荧光显微镜以激发波长(470nm)及发光波长(530nm)对取出的大动脉样本的进行来自NBD-Pen的荧光观测(图7a)。用数码相机拍摄相同大动脉样本的斑块的油红染色后的图像(图7b)。

来自NBD-Pen的显示为发绿色荧光的位置(白色部分)和显示为油红染色后的斑块的橙色位置(白色部分)完全一致。这表示氧化脂质存在于因动脉硬化而造成的斑块。即，证实了本发明的使用了NBD-Pen的荧光法可检测动脉硬化的位置。

实施例四：利用本发明的NBD-Pen及混合抗体的变质LDL的检测

(1)MM-LDL的检测用试剂盒的准备

MM-LDL的检测通过使用NDB-Pen的荧光法来进行。添加NDB-Pen以使从对象动物采取的全血的NDB-Pen最终浓度为50μM，并在37℃下使其反应一小时。其后，添加100μM的Trolox，停止反应，进行离心分离。从由上清液得到的血浆通过超速离心法来进行离析，测定荧光强度(λex：470nm；λem；530nm)。

(2)OxLDL的检测用试剂盒的准备

氧化修饰LDL的检测通过使用抗丙二醛(MDA)、4-羟基-2-壬烯醛(HNE)及丙烯醛(ACR)的一级抗体(primary antibody)的混合物(混合抗体)的酶联免疫吸附剂测定法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)来进行，所述丙二醛(MDA)、4-羟基-2-壬烯醛(HNE)及丙烯醛(ACR)为从脂质自由基诱导而成的脂质过氧化代谢产物的代表。这些多个一级抗体来自于除检测对象的氧化修饰LDL的来源动物以外的同一动物。

在本发明中，需要使用抗各个代谢产物的单克隆抗体的混合物，而不使用抗氧化修饰LDL多克隆抗体。

例如，检测来自人的氧化修饰LDL的MDA-Lys、HNE-Lys时，可使用来自小鼠的抗体(例如，ML25、NA59)。使用与该一级抗体进行特异性结合的二级抗体。作为这种二级抗体，可使用人及小鼠以外的动物来源的抗小鼠抗体，例如，兔抗小鼠IgG等。

此外，在本发明中，在用于将氧化修饰LDL固定于微孔板的捕获抗体这一点、以及通过检测氧化修饰LDL上的脂质过氧化代谢产物的一级抗体来捕获氧化修饰LDL这一点上，适用捕获ELISA法，但进而，相对一级抗体，使标记了标记分子的二级抗体反应的点适用间接法。

二级抗体被用于通过光学方法进行检测的标记分子标记。

辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase；HRP)或者碱性磷酸酶(alkaliphosphatase；ALP)等酶可使用被标记的二级抗体。在使用HRP标记抗体时，添加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine；TMB)、邻苯二胺(o-phenylenediamine；OPD)、2,2'-联氮-双[-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2-azinobis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid；ABTS)等发色底物。关于HRP，将过氧化氢作为氧化剂来氧化这些发色底物，使其发射强光，以分光的方式进行观察。在使用ALP标记抗体的情况下，添加对硝基苯磷酸二钠(p-nitrophenylphosphate；pNPP)等发色底物。关于ALP，在碱性条件下，使pNNP生成浓黄色的对硝基酚，以分光的方式进行观察。

可在二级抗体标记任意的荧光色素。虽然可以对不同的检测对象付与不同的荧光色素，但由于实现了LDL的氧化状态的全面的可视化，因此优选为对检测对象付与相同的荧光色素。

例如，使用赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司提供的抗体标记试剂盒来荧光标记对象的二级抗体。由于所述标记试剂盒含有激发波长/发光波长不同的多种胺反应性荧光色素，因此可根据可视化的目的适当地进行选择。

这种荧光色素基于该公司的荧光标记协议而标记于二级抗体。即，通过以下步骤进行荧光标记。在荧光标记后进行纯化。

1.1通过向加入了碳酸氢钠(成分B)的小瓶添加1ml的去离子水(dH₂O中)，来调制碳酸氢钠的1M溶液。进行搅拌，或者使用移液器来上下移液，使其完全溶解。碳酸氢钠溶液的pH为8～9，可在2～8℃下最长保持2周时间。

1.2被标记的抗体在适当的缓冲液中具有1mg/mL以上的浓度情况下，稀释为1mg/mL，而后添加十分之一体积的碳酸氢钠的1M溶液(在步骤1.1中调制的)。

在蛋白质为来自适当的缓冲液的冷冻干燥粉末的情况下，通过向蛋白质添加适当的0.1M碳酸氢钠缓冲液来调制1mg/mL的抗体溶液。使用dH₂O十倍稀释1M溶液，调制0.1M碳酸氢钠缓冲液。

注释：由于琥珀酰亚胺酯(succinimidyl ester)和TFP酯在碱性pH中高效地反应，因此添加碳酸氢盐使反应混合物的pH(pH8～9)增加。

1.3将100μl的(来自步骤1.2的)蛋白质溶液移入反应性染料的小瓶。盖上小瓶，轻轻来回颠倒数次以使染料完全溶解。用力搅拌蛋白质溶液可能会引起蛋白质的变质。

注释：为了在视觉上确认色素完全溶解，可将反应性染料的小瓶的标签摘下。

1.4将溶液在室温中孵育一小时。每过10～15分钟轻轻颠倒小瓶以混合两种反应物，来提高标记效率。

也可通过使生物素结合于二级抗体并添加荧光标记抗生物素蛋白来敏化。

对于检测对象的氧化修饰LDL，若市面上没有合适的ELISA试剂盒，则也可自制。

(5)糖化LDL的检测用试剂盒的准备

糖化LDL的检测通过使用针对作为AGE的代表的戊糖素、交联素、CML、CEL、及吡咯素的一级抗体的混合物(混合抗体)的酶联免疫吸附剂测定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay；ELISA)来进行。这些多个一级抗体来自于除检测对象的糖化LDL的来源动物以外的同一动物。

在本发明中，需要使用抗各个代谢产物的单克隆抗体的混合物，而不使用抗糖化LDL多克隆抗体。

例如，检测来自人的糖化LDL的CML时，可使用来自小鼠的抗CML抗体(例如，CosmoBio Co.,Ltd AGE-M01)。使用与该一级抗体进行特异性结合的二级抗体。作为这种二级抗体，可使用人及小鼠以外的动物来源的抗小鼠抗体，例如，兔抗小鼠IgG等。

二级抗体被用于以光学方法进行检测的标记分子标记。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase；HRP)或者碱性磷酸酶(alkali phosphatase；ALP)等酶可使用被标记的二级抗体。

在使用HRP标记抗体的情况下，添加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine；TMB)、邻苯二胺(o-phenylenediamine；OPD)、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2-azinobis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid；ABTS)等发色底物。关于HRP，将过氧化氢作为氧化剂来氧化这些发色底物，使其发射强光，而以分光的方式进行观察。

在使用ALP标记抗体的情况下，添加对硝基苯磷酸二钠(p-nitrophenylphosphate；pNPP)等发色底物。关于ALP，在碱性条件下，使pNNP生成浓黄色的对硝基酚，以分光的方式进行观察。

与上述的氧化修饰LDL中的说明同样地，可在二级抗体标记任意的荧光色素。虽然可以对不同的检测对象付与不同的荧光色素，但由于实现了LDL的氧化状态的全面的可视化，因此优选为对检测对象赋予相同的荧光色素。

也可通过使生物素结合于二级抗体并添加荧光标记抗生物素蛋白来敏化。

与上述的氧化修饰LDL中的说明同样地，对于检测对象的糖化LDL，若市面上没有合适的ELISA试剂盒，则也可自制。

(4)变质LDL的荧光观察

准备用于捕捉对象的变质LDL的捕获抗体被固相了的96孔微孔板。在没有合适的用来捕捉对象的变质LDL捕捉的微孔板的情况下，将使用碳酸-碳酸水缓冲液或者PBS稀释的溶液(0.2～100μg/mL)向各孔分别滴下0.2mL，而后将适当的捕获抗体在37℃下孵育一小时。其后，去除溶液，使用洗涤缓冲液来将板清洗三次，由此得到固相了捕获抗体的微孔板。

稀释校准物(caliberator)以制作1/2稀释系列(2000、1000、500、250、120、62.5、及31.2pg/mL)。

调制样本。

为稀释的校准物分配7孔，为空白组分配1孔。

向各孔添加100μl的稀释校准物、空白组及样本，用密封盖覆盖各孔后，在37℃下孵育两小时。

去除各孔的溶液，但这时不进行清洗。

向各孔添加100μl的抗氧化修饰LDL的来自小鼠的一级检测抗体(用于识别MDA-Lys、HNE-Lys、Aclolein-Lys的混合抗体)、抗糖化LDL的来自小鼠的一级检测抗体(用于识别戊糖素、交联素、CML、CEL、及吡咯素的混合抗体)和含有NDB-Pen的检测试剂A，用密封盖覆盖各孔后，在37℃下孵育一小时。

作为抗氧化修饰LDL的来自小鼠的一级检测抗体，可使用混合了ML25或者4C7(ab17354)(Abcam公司)、NA59或者HNEJ-2(ab48506)(Abcam公司)、MAR的混合(cocktail)抗体。

作为抗糖化LDL的来自小鼠的一级检测抗体，可使用混合了ES12(Exocell公司)、CML26(ab125145)(Abcam公司)、ab23722(Abcam公司)的混合抗体。

对于各孔，抽吸去除溶液，用350μl的洗净液来清洗，放置1～2分钟，其后，重复三次从所有孔完全去除残留液体的操作。

向各孔添加100μl含有二级检测抗体的检测试剂B，用密封盖覆盖各孔后，在37℃下孵育一小时。该二级检测抗体为可同时识别抗氧化修饰LDL的来自小鼠的一级检测抗体及抗糖化LDL的来自小鼠的一级检测抗体的兔抗小鼠抗体，并结合了荧光发色团。

作为这种荧光发色团，优选以NDB-Pen的激发波长485nm来激发，在519nm具有极大发光波长的Alexa Fluor^R 488(赛默飞世尔科技公司)等。更优选地，使用将N-羟基琥珀酰亚胺活性酯导入7-硝基苯并呋咱(7-nitrobenzofurazan；NBD)的如结构式(5)：

(化学式6)

所示的NBD-NHS，使用NBD对二级检测抗体进行荧光标记。

或者，可使用在如以下的结构式(6)：

(化学式7)

所示的在炔烃化或者叠氮基化的TEMPO系氮氧自由基(式中，R表示炔烃或者叠氮基)结合了用于二级抗体的荧光发色团的荧光氮氧基。

对于各孔，抽吸去除溶液，用350μl的洗净液来清洗，放置1～2分钟，其后，重复三次从所有孔完全去除残留液体的操作。

向各孔添加50μl的反应终止液。

使用酶标仪，以485nm的激发光来激发荧光发色团，在528nm下观测荧光强度。

(产业上的可利用性)

利用本发明的荧光检测方法可全面地观察低密度脂蛋白(LDL)的变质状态(氧化状态及糖化状态)。通过全面的观察结果，可促进对变质LDL和疾病之间的相关性的研究，也可在疾病的预防、治疗方面起到作用。