阅读说明：本技术 一种检测赭曲霉毒素a的荧光生物传感器的制备方法 (Preparation method of fluorescence biosensor for detecting ochratoxin A ) 是由 由天艳 毕晓雅 李丽波 刘晓红 陈柏年 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物传感检测技术领域,公开了一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器的制备方法。本发明属于一种基于能量共振转移作用的生物传感器,通过利用适配体与CoOOH纳米片的相互作用以及与apt耦合的g-CNQDs(g-CNQDs-apt)和CoOOH纳米片之间的能量共振转移作用,同时引入适配体作为生物识别元件,运用其可与目标物OTA特异性结合的特性,实现实际样品中OTA的快速、低成本、特异性检测。本发明构建的荧光适配体传感器对OTA的响应范围为1.00×10<Sup>-9</Sup>-1.40×10<Sup>-7</Sup>mol·L-1,检出限为3.3×10<Sup>-</Sup><Sup>10</Sup>mol·L<Sup>-1</Sup>,同时具有选择性好、快速、成本低的优点,为测定实际样品中的OTA提供了一种新型适配体传感平台。(The invention belongs to the technical field of biosensor detection, and discloses a preparation method of a fluorescence biosensor for detecting ochratoxin A. The invention belongs to a biosensor based on energy resonance transfer effect, which realizes rapid, low-cost and specific detection of OTA in an actual sample by utilizing the interaction of an aptamer and a CoOOH nano sheet and the energy resonance transfer effect between g-CNQDs (g-CNQDs-apt) coupled with apt and the CoOOH nano sheet, and simultaneously introducing the aptamer as a biological recognition element by utilizing the characteristic that the aptamer can be specifically combined with a target object OTA. The response range of the fluorescent aptamer sensor constructed by the invention to OTA is 1.00 multiplied by 10 ‑9 ‑1.40×10 ‑7 mol.L-1, detection limit of 3.3X 10 ‑ 10 mol·L ‑1 Meanwhile, the method has the advantages of good selectivity, rapidness and low cost, and provides a novel aptamer sensing platform for measuring OTA in an actual sample.)

一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器的制备方法

技术领域

本发明属于生物传感检测技术领域，具体涉及一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器的制备方法，并将其用于对赭曲霉毒素A(OTA)的选择性检测。

背景技术

谷物生长、收获、储存环节中容易受到真菌侵染引起腐烂变质，在适宜温湿度下会产生具有强毒性的化合物-真菌毒素。真菌毒素是世界各地农产品的主要污染物之一，目前已被发现的真菌毒素共有400余种。赭曲霉毒素A(OTA)是由赭曲霉或青霉菌产生的化合物，广泛分布于玉米、大麦、小麦等谷物中。由于其具有肾毒性、致畸性和免疫毒性作用，OTA被国际癌症研究机构归类为潜在致癌物(2B组)，中国国家标准要求谷物及其制品中OTA含量最高不可超过5μg Kg^-1。因此，有必要发展一种准确、可靠的分析方法来实现谷物中OTA的分析，以此保障人类身体健康。目前，现有的OTA检测方法各有其优缺点。如高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)和薄层色谱法(TLC)具有较高的准确性和可靠性，但成本相对较高且耗时，操作时必须由专业工作人员在专业实验室中进行。酶联免疫吸附测定法(ELISA)可实现OTA的快速检测，但其不足之处是必须使用昂贵的酶标记试剂，且诸如温度、pH等环境条件对抗体或抗原具有显着影响。相对而言，荧光分析法因为具有操作方便、快速、易于自动化等优点，在生物传感器应用中获得了极大的兴趣。

能量共振转移是构建荧光传感方法时常用的策略，通过10nm距离内荧光供体与受体之间存在光谱重叠来实现。目前报道的受体物质中，羟基氧化钴(CoOOH)纳米片具有合成速度快、稳定性好的优点，且其具有宽的紫外吸收峰(340nm-800nm)，可以与多种荧光探针(如金纳米簇、荧光染料)发生能量共振转移，但目前基于CoOOH纳米片构建的传感技术中所用的荧光探针在稳定性、简化合成路线等方面仍需要改善。

氮化碳量子点(g-CNQDs)作为一种新型荧光探针，具有独特的物理化学性质，如良好的水溶性、稳定性、无毒性，同时富含羟基、羧基、氨基等官能团有利于进一步修饰。目前，多种使用g-CNQDs作为供体的荧光传感器被发展和应用，但将其作为CoOOH纳米片供体的传感体系还未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明在结合g-CNQDs和CoOOH纳米片优点的工作基础上，引入OTA适配体(OTA-apt)，构建新型荧光适配体传感器，用于实际样品中OTA的快速、特异性检测分析。其中，OTA适配体的序列为：5'-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAGCAT CGG ACA-C₆H₁₂-NH₂-3'。

本发明旨在耦合荧光法和适配体传感技术，构筑一种基于g-CNQDs-CoOOH体系的OTA适配体传感器。具体通过如下技术方案实现：利用适配体与CoOOH纳米片的相互作用以及与apt耦合的g-CNQDs(g-CNQDs-apt)和CoOOH纳米片之间的能量共振转移作用，同时结合适配体特异性识别OTA的特性，实现实际样品中OTA的快速、低成本、特异性检测。

一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成g-CNQDs；

(2)g-CNQDs的羧基与OTA适配体修饰的氨基之间发生酰胺反应合成g-CNQDs-apt：

按比例将步骤(1)制备的g-CNQDs和PBS溶液混合搅拌，在搅拌下缓慢加入OTA适配体溶液，并将混合物溶液连续搅拌一定时间后，制得g-CNQDs-apt，在一定温度下储存备用；

(3)合成CoOOH纳米片；

(4)混合g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片：

按比例将步骤(2)制备的g-CNQDs-apt和步骤(3)制备的CoOOH纳米片溶液混合，用PBS溶液调节pH后作用一段时间，得到检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器。

其中，步骤(1)中，合成g-CNQDs的具体方法为：将1.68mmol柠檬酸三钠和10.08mmol尿素混合并在玛瑙研钵中研磨成细粉；将粉末混合物倒入20mL聚四氟乙烯衬里的高压釜中并在180℃下加热1h后冷却至室温；将固体产物分散在30mL水中并以10000rpm离心10min以除去不溶性杂质；随后，得到的上层溶液用100Da的透析袋在二次水中透析24h移除未反应的前体；烘干称重后溶于二次水中，并在4℃下储存。

步骤(2)中，g-CNQDs和PBS的体积比为2:1，混合搅拌的时间为15-30min，其中，g-CNQDs浓度为4mg·mL^-1，PBS浓度为100mM(pH＝7.4，含有10mM EDC和5mM NHS)；g-CNQDs与OTA适配体溶液的体积比为1:1；其中，OTA适配体溶液的浓度为1μM；混合物溶液连续搅拌的时间为2-4h；制得的g-CNQDs-apt储存温度为4℃。

步骤(3)中，CoOOH纳米片的制备具体方法为：将125μL 1.0M的NaOH溶液与500μL10.0mM的CoCl₂·6H₂O溶液在微量离心管中混合，超声处理1min后加入25μL 0.9M的NaClO溶液并继续超声10min；随后，以12000rpm离心15min收集CoOOH纳米片，用二次水洗涤离心三次，并在干燥后重新分散于水中。

步骤(4)中，g-CNQDs-apt溶液和CoOOH纳米片溶液的体积比为3:2；用PBS溶液调节pH到7.4，作用时间为1-25min。

所制得的检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器中，g-CNQDs-apt的最终浓度为0.05-0.25mg·mL^-1，CoOOH纳米片的最终浓度为0-30μg·mL^-1。

将本发明制备的检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器用于检测赭曲霉毒素A的用途。

检测方法为：

S1：在900μL检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器中加入100μL 1-140nM的OTA标准溶液，反应3-25min后用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在469nm处的荧光强度，得出荧光强度与OTA浓度的标准曲线；所述荧光分光光度计的激发波长设置为390nm，激发狭缝宽度为3nm，发射狭缝宽度为3nm。

S2：在900μL检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器中加入100μL的待测溶液，反应3-25min后用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在469nm处的荧光强度，代入步骤S1中的标准曲线，得出待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度。

本发明的有益效果：

(1)结合g-CNQDs和CoOOH纳米片的优点，基于g-CNQDs和CoOOH纳米片之间的能量共振转移作用定量检测OTA；

(2)引入特异性识别元件OTA的适配体，实现对目标物OTA的特异性分析；

(3)本发明构建的荧光适配体传感器用于OTA的检测，选择性好、快速(可在10min之内完成)、成本低，线性范围为1-140nM。

附图说明

图1是该荧光适配体传感器检测OTA的原理示意图。

图2是该荧光适配体传感器可行性分析中不同溶液的荧光光谱图。

图3是g-CNQDs的TEM图。

图4是apt和g-CNQDs-apt的凝胶电泳图像。

图5是CoOOH纳米片的SEM图。

图6A是g-CNQDs-apt浓度与荧光恢复强度△F的关系图；B是CoOOH浓度与荧光恢复强度△F关系图；C是g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片不同反应时间与荧光强度关系图；D是OTA与适配体不同结合时间与荧光恢复强度△F关系图。

图7A是不同浓度OTA标准溶液存在时溶液的荧光光谱图；B是OTA浓度与荧光强度间的线性关系图。

图8是各种干扰物存在时溶液的荧光变化图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器的制备方法，具体通过如下技术方案实现：利用适配体与CoOOH纳米片的相互作用以及与适配体耦合的g-CNQDs(g-CNQDs-apt)和CoOOH纳米片之间的能量共振转移作用，同时结合适配体特异性识别OTA的特性，实现实际样品中OTA的快速、低成本、特异性检测。

该检测方法的可行性分析如下：

CoOOH纳米片与ssDNA结合力比G-四链体更强，并且CoOOH纳米片可作为受体猝灭apt末端耦合的g-CNQDs的荧光信号。适配体是单链DNA或RNA分子，可高特异性和高亲和力与目标物结合。基于此，可避免OTA结构类似物及其他真菌毒素的干扰，有效屏蔽干扰信号。本发明基于CoOOH纳米片的猝灭特性，结合适配体对OTA的特异识别结合作用来设计一种可用于OTA特异性检测的荧光传感策略。

该传感器的检测过程如图1所示，基本原理是：

适配体就是一段寡链ssDNA序列，当适配体耦合的g-CNQDs中加入CoOOH纳米片后，由于适配体与CoOOH纳米片之间的范德华力作用很强，使g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片吸附在一起，拉近了g-CNQDs和CoOOH纳米片的距离，有效促进两者间发生能量共振转移，使g-CNQDs的荧光信号发生了猝灭。当有目标物OTA存在时，OTA与apt特异性结合形成G-四联体，因为G-四联体与CoOOH纳米片作用力要弱于适配体单链对CoOOH纳米片的作用力，使g-CNQDs远离CoOOH纳米片，降低了CoOOH纳米片对g-CNQDs的猝灭效率，从而使g-CNQDs的荧光恢复。因此，通过监控g-CNQDs的荧光信号变化可以实现OTA的特异性检测。

为了进一步验证方案的可行性，对加入一定量CoOOH纳米片和OTA前后的荧光变化情况进行考察。如图2所示，适配体耦合的g-CNQDs在469nm处有强荧光信号(曲线a)。当溶液中加入CoOOH纳米片后，适配体的碱基通过范德华力与CoOOH纳米片作用，导致g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片吸附在一起，进而引发g-CNQDs与CoOOH纳米片之间能量共振转移的发生，使g-CNQDs的荧光信号被猝灭(曲线b)。当加入目标物OTA溶液后，由于OTA与适配体特异性结合形成G-四链体，g-CNQDs-apt被拽离CoOOH纳米片，阻碍能量共振转移的发生，因此g-CNQDs的荧光信号得到恢复(曲线c)。因此，当溶液中有OTA存在时，适配体会和OTA特异性结合形成适配体复合物，其与CoOOH纳米片的结合能力会明显弱于游离的适配体与CoOOH纳米片的结合能力，从而导致体系荧光信号的增强。该实验可以有效证明构建的适配体传感器能够用于测定目标物OTA的含量。图2中，a为g-CNQDs-apt溶液的荧光光谱图；b为g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片混合后溶液的荧光光谱图；c为g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片混合后再和OTA混合后溶液的荧光光谱图。

下面结合具体实施例，对本发明的内容作更细致地阐述：

实施例1：

按照图1所述的的制备工艺流程，一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器的制备方法包括如下步骤：

(1)合成g-CNQDs

将1.68mmol柠檬酸三钠和10.08mmol尿素混合并在玛瑙研钵中研磨成细粉；将粉末混合物倒入20mL聚四氟乙烯衬里的高压釜中并在180℃下加热1h后冷却至室温；将固体产物分散在30mL水中并以10000rpm离心10min以除去不溶性杂质；随后，得到的上层溶液用100Da的透析袋在二次水中透析24h移除未反应的前体；烘干称重后溶于二次水中，并在4℃下储存。g-CNQDs的TEM表征结果如图3所示，其具有良好的单分散性，平均粒径为2.2nm。

(2)g-CNQDs的羧基与OTA适配体修饰的氨基之间发生酰胺反应合成g-CNQDs-apt

将体积比为2:1的g-CNQDs和PBS混合搅拌15-30min，其中g-CNQDs浓度为4mg·mL^-1，PBS中含有10mM EDC和5mM NHS。然后，在搅拌下加入与g-CNQDs等体积的OTA适配体溶液(浓度为1μM)，并将混合物溶液连续搅拌2h。最后，将溶液储存在4℃下。g-CNQDs-apt的凝胶电泳图像如图4所示，当适配体与g-CNQDs耦合后，由于质量增加使g-CNQDs-apt(条带b)的条带比单纯适配体(条带a)的移动速度慢，这也证明g-CNQDs-apt合成成功。

(3)合成CoOOH纳米片

将125μL 1.0M的NaOH溶液与500μL 10.0mM的CoCl₂·6H₂O溶液在微量离心管中混合，超声处理1min后加入25μL 0.9M的NaClO溶液并继续超声10min；随后，以12,000rpm离心15min收集CoOOH纳米片，用二次水洗涤离心三次，并在干燥后重新分散于水中。CoOOH纳米片的SEM表征如图5所示，所制备的CoOOH纳米片为典型的六边形纳米片形貌。

(4)混合g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片

将体积比为3:2的g-CNQDs-apt溶液和CoOOH纳米片溶液混合后，用PBS调节pH至7.4，作用1-25min。其中，g-CNQDs-apt的最终浓度为0.05-0.25mg·mL^-1，CoOOH纳米片的最终浓度为0-30μg·mL^-1。

在900μL检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器中加入100μL 1-140nM的OTA标准溶液，反应3-25min后用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在469nm处的荧光强度，得出荧光强度与OTA浓度的标准曲线；所述荧光分光光度计的激发波长设置为390nm，激发狭缝宽度为3nm，发射狭缝宽度为3nm。

实施例2：

g-CNQDs-apt最佳浓度的确定：

在实施例一的步骤(4)中固定CoOOH纳米片的最终浓度为25μg·mL^-1，使g-CNQDs-apt的最终浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mg·mL^-1，探究g-CNQDs-apt的浓度变化与荧光恢复强度△F(加入50nM OTA标准溶液时的荧光强度与加入0nM OTA标准溶液时荧光强度的差值)的关系，以获得最优的g-CNQDs-apt浓度。由图6A可以看出，当g-CNQDs-apt浓度为0.15mg·mL^-1时，荧光恢复强度△F取得最大值，所以选择0.15mg·mL^-1的g-CNQDs-apt进行后续实验。

实施例3：

CoOOH纳米片最佳浓度的确定：

在实施例二所获得的g-CNQDs-apt的最佳浓度基础上，使CoOOH纳米片的最终浓度分别为0、5、10、15、20、25、30μg·mL^-1，探究的CoOOH纳米片浓度变化与荧光恢复强度△F的关系，以获得最优的CoOOH纳米片浓度。由图6B可以看出，当CoOOH纳米片浓度为10μg·mL^-1时，荧光恢复强度△F取得最大值，所以选择10μg·mL^-1的CoOOH纳米片浓度进行后续实验。

实施例4：

g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片最佳反应时间的确定：

在实施例三所获得的CoOOH纳米片的最佳浓度基础上，将g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片混合液分别混合0min、1min、5min、10min、15min、20min、25min，测溶液在469nm处的荧光强度。从图6C可知，CoOOH纳米片加入到g-CNQDs-apt溶液后，g-CNQDs-apt的荧光信号会迅速被淬灭，在5min后，其荧光信号基本保持不变，该实验结果证明CoOOH纳米片与g-CNQDs-apt结合是一个非常快速的过程。因此，接下来的实验选用5min作为g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片的最佳结合时间。

实施例5：

OTA与g-CNQDs-apt适配体最佳结合时间的确定：

在实施例二、三、四所得的最优条件下制备检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器，并在900μL该荧光生物传感器中加入100μL 50nM OTA标准溶液，分别震荡0min、3min、5min、10min、15min、20min、25min，测溶液在469nm处的恢复荧光强度△F。从图6D可知，随着目标物OTA与适配体作用时间的延长，g-CNQDs-apt的荧光强度得到恢复，在5min时可以保持恢复的荧光信号基本保持不变，该实验结果证明OTA与适配体的结合也是一个快速的过程。因此，接下来的实验选用5min作为OTA与适配体最佳结合时间。

实施例6：

绘制OTA响应标准曲线及线性回归方程式：

按照实施例一的步骤混合g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片相互作用5min后，分别加入0、1、5、20、35、50、65、80、100、120和140nM的OTA标准溶液，震荡5min。用荧光分光光度计在室温下分别检测上述不同浓度OTA标准溶液在469nm处的荧光强度，所得的谱图如图7A所示，其中，图中曲线从下到上分别对应OTA标准液的浓度为0、1、5、20、35、50、65、80、100、120和140nM。同时获得荧光强度与OTA浓度的标准曲线如图7B所示；线性方程为：F＝0.35182+0.18449C_OTA，相关系数R²＝0.9960，检测限为0.33nM(S/N＝3)。

实施例7：

OTA检测选择性的考察：

为了研究本发明检测OTA的特异性，对OTA和其真菌毒素及类似物进行检测。具体步骤如下：在1.5mL离心管中加入150μL 1mg·mL^-1g-CNQDs-apt溶液和100μL 100μg·mL^-1CoOOH纳米片溶液，加入650μL PBS调节混合液pH为7.4，作用5min后再加入100μL 100nM不同干扰物的标准溶液，震荡5min后，室温下检测溶液的恢复荧光强度△F。如图8所示，将100nM黄曲霉毒素B1(AFB1)、100nM伏马菌素B1(FB1)、100nM玉米赤霉烯酮(ZEN)、100nM赭曲霉毒素B(OTB)、100nM杀鼠灵(warfarin)和100nM N-乙酰-L-苯丙氨酸(NAP)引入该传感体系对g-CNQDs-apt的荧光强度基本无影响，而当100nM OTA引入体系后时会使荧光信号明显恢复。以上结果说明该荧光适配体传感体系可以实现OTA的特异性检测。