阅读说明：本技术 一种文蛤寡肽的制备方法 (Preparation method of clam oligopeptide ) 是由 杨最素 唐云平 余方苗 黄芳芳 陈艳 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及从文蛤中提取多肽技术领域,为进一步提升文蛤寡肽的提取率,本发明方法提供了一种文蛤寡肽的提取方法,将离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1复配得到的二元体系应用在文蛤寡肽的制备上,并在低温下施加脉冲电场分解文蛤内脏组织,然后在优化酶解条件下酶解、分离、纯化,得到文蛤寡肽。本发明的文蛤寡肽制备方法中加入离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按1:1混合制成复配溶剂,低温协同脉冲电场处理,然后再碱性蛋白酶酶解,所得文蛤寡肽的提取率得到提高,而且生物活性也有一定程度的提高,并且省略了0.1mol/L氢氧化钠溶液的脱脂过程。(The invention relates to the technical field of polypeptide extraction from clams, and aims to further improve the extraction rate of clam oligopeptides. According to the preparation method of the clam oligopeptide, the ionic liquid EMIMBF4 and gamma-butyrolactone are added and mixed according to the ratio of 1:1 to prepare a compound solvent, the compound solvent is subjected to low-temperature synergistic pulsed electric field treatment and then subjected to alkaline protease enzymolysis, the extraction rate of the clam oligopeptide is improved, the biological activity is improved to a certain extent, and the degreasing process of 0.1mol/L sodium hydroxide solution is omitted.)

一种文蛤寡肽的制备方法

技术领域

本发明涉及从文蛤中提取多肽技术领域，具体涉及一种文蛤寡肽的制备方法。

背景技术

文蛤主要产于沿海一带，其经济价值高、营养丰富、肉质鲜美，具有很高的食疗药用价值。李时珍的《本草纲目》上说文蛤可治"疮、疖肿毒，消积块，解酒毒"等病，近代研究又表明：文蛤有清热利湿、化痰、散结的功效，对肝癌有明显的抑制作用，对哮喘、慢性气管炎、甲状腺肿大、***核等病也有明显疗效。本申请的发明人团队在前期的中国专利申请CN201410624999.7中提供了一种文蛤寡肽的制备方法，将文蛤内脏匀浆后氢氧化钠溶液脱脂、碱性蛋白酶酶解，然后层析分离、HPLC纯化得到氨基酸序列为Gln-Leu-Asn-Trp-Asp，分子量为674.6Da的短分子肽，即文蛤寡肽。该文蛤寡肽对非酒精性肝损伤具有明显的修复作用，表现出很大的应用前景。因此，如何深化课题研究，进一步对这种文蛤寡肽的制取方法进行优化，提高文蛤寡肽的提取率，并相应的提升文蛤寡肽的活性，具有重要的意义。

目前动物多肽的提取方法有匀浆、超声波、酶解等。由于离子液体表现的良好溶剂特性，目前也有用离子液体进行多肽提取的研究，但是离子液体低温下粘度增加，非常不利于操作。清华大学的骞伟中课题组在超级电容器的研究中发现，将离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1复配得到的二元体系可以保持较低的玻璃态温度，将超级电容器的工作温度下探至-70℃，表现了较好的低温特性。但是目前还未出现将这种二元体系应用在多肽提取上的研究。发明人团队在前期研究基础上，根据文蛤寡肽为短肽、低分子量特点，开展这种二元体系在文蛤寡肽提取方面的研究，以期提升文蛤寡肽的提取率。

发明内容

为进一步提升文蛤寡肽的提取率，本发明方法提供了一种文蛤寡肽的提取方法，将离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1复配得到的二元体系应用在文蛤寡肽的制备上，达到提高文蛤寡肽的提取率的目的。

本发明提供如下的技术方案：

一种文蛤寡肽的制备方法，所述文蛤寡肽氨基酸序列为Gln-Leu-Asn-Trp-Asp，包括以下步骤：

(1)将新鲜的文蛤洗净后去壳，取内脏、置于水中搅拌浸泡去除杂质，然后将文蛤内脏调整至中性后匀浆处理制备成文蛤匀浆液；

(2)将文蛤匀浆液与复配溶剂按料液比1:2～4混合均匀获得浸泡液，所用复配溶剂为离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1混合制成；

(3)降低浸泡液温度至-50～-60℃的低温，向浸泡液中通入脉冲电场处理，然后升至室温；

(4)离心分离步骤(3)处理后的浸泡液并回收上清液，去离子水洗涤固体并离心分离得到内脏破碎物；

(5)向内脏破碎物中加入碱性蛋白酶溶液处理，然后灭酶活性，得到酶解液；

(6)将步骤(5)的酶解液离心分离，取上清液经滤膜过滤，然后经超滤膜处理，截留分子量小于5kDa的分子段产物得到粗肽液；

(7)将粗肽液层析分离，收集层析最高峰对应的组份，然后经HPLC分离纯化，收集色谱最高峰对应的组份，冷冻干燥，得到文蛤寡肽。

作为本发明方法的优选，步骤(3)中的脉冲电场处理方法为：脉冲数为200～300次，电场强度15～20kV/cm，脉冲宽度为50～70μs，脉冲频率1000～1200Hz，浸泡液在低温保持时间为7～8小时。

作为本发明方法的优选，步骤(4)中将浸泡液离心分离3～5次，然后去离子水洗涤3～5次并离心分离。

作为本发明方法的优选，步骤(5)中碱性蛋白酶液的酶解时间6～12小时、酶解温度40～55℃、料液比1:1～4、pH值为9～10.5、酶加入量为800～1400U/g。

作为本发明方法的优选，步骤(5)中碱性蛋白酶液的酶解时间8小时、酶解温度40℃、料液比1:2、pH值为9.5、酶加入量为1000U/g。

作为本发明方法的优选，步骤(7)中层析所用层析柱为聚葡糖层析柱SephadexG25柱，洗脱波长280nm。

作为本发明方法的优选，步骤(7)中HPLC所用色谱柱为Zorbax SB-C18色谱柱，色谱分离波长280nm。

作为本发明方法的优选，离心分离的温度为0～4℃，离心转速为10000～12000r/min。

本发明的文蛤寡肽的制备方法，在前期专利申请CN201410624999.7的基础上，将离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按1:1混合制成复配溶剂，然后加入到文蛤匀浆液中提取文蛤寡肽，利用离子液体EMIMBF4的良好溶剂特性来溶解脂质，破坏文蛤的细胞组织。在此基础上，一方面降低温度至-50～-60℃，利用低温效果来强化细胞组织破坏；另一方面，在低温环境下引入脉冲电场，利用脉冲电场的高强度冲击强化对细胞组织的破坏，同时低温降低脉冲电场产生的臭氧环境对蛋白质的影响；更重要的是，离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按1:1的二元体系在低温下仍可以保持良好的通电特性和流动性，而文蛤内脏组织浸泡在这种二元体系中，当施加脉冲电场时，二元体系的通电特性可以反过来增强脉冲电场效果。在低温保持结束后10～20min的时间内迅速升温至室温，这样利用复合溶剂的急剧热胀效应进一步强化对细胞组织的破坏。这样的处理过程适合分子量小的短肽的制备，处理后的文蛤的内脏破碎物可以直接使用碱性蛋白酶酶解，并省略了原有的氢氧化钠溶液的脱脂过程，使蛋白质得到充分分解，最终所得文蛤寡肽的提取率比原提取方法可以提升8～10％，而且文蛤寡肽的活性也有一定程度的提高。

本发明的有益效果如下：

本发明的文蛤寡肽制备方法中加入离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按1:1混合制成复配溶剂，低温协同脉冲电场处理，然后在前期研究基础上采用优化的碱性蛋白酶酶解，所得文蛤寡肽的提取率得到提高，而且生物活性也有一定程度的提高，并且省略了0.1mol/L氢氧化钠溶液的脱脂过程。

具体实施方式

下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。

如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。

对比例1

一种文蛤寡肽的制备方法，本申请所用对比例1为前期专利申请CN201410624999.7中公开的最优酶解实施方案，或者文献“文蛤寡肽对小鼠急性肝损伤的保护作用”(王佳佳、赵莎莎、杨最素等，食品科学，2017，38(13):190～195页)中1.3.1节“文蛤寡肽的提取”公开的提取方法：新鲜文蛤经洗净、去壳、取内脏，并用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡去脂，于蒸馏水中轻轻搅拌去杂质，调制中性，匀浆，选用碱性蛋白酶，以料液比1:2于40℃、pH值为9.5的条件下酶解8h。灭酶活性后将得到的文蛤酶解液超滤，取含分子质量小于5kDa的分子段产物的酶解液过Sephadex G25柱进行层析分离，收集洗脱液于280nm波长处测定吸光度，收集峰I对应的组份，然后经HPLC分离纯化，收集色谱最高峰对应的组份，冷冻干燥，得到文蛤寡肽，经氨基酸N端测序，最终获得的文蛤寡肽的氨基酸序列为Gln-Leu-Asn-Trp-Asp，分子量为674.6Da。

实施例1

一种文蛤寡肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜的文蛤洗净后去壳，取内脏、置于水中搅拌浸泡去除杂质，然后将文蛤内脏调整至中性后匀浆处理制备成文蛤匀浆液；

(2)将文蛤匀浆液与复配溶剂按料液比1:2混合均匀获得浸泡液，所用复配溶剂为离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1混合制成；

(3)降低浸泡液温度至-50℃，向浸泡液中通入脉冲电场处理，脉冲电场处理方法为：脉冲数为300次，电场强度15kV/cm，脉冲宽度为50μs，脉冲频率1200Hz，浸泡液在-50℃低温保持7小时，然后10min升至室温23±2℃；

(4)0℃离心分离步骤(3)处理后的浸泡液3次，转速10000r/min，回收每次分离的上清液，然后去离子水洗涤残留固体物3次，并0℃离心分离得到内脏破碎物，转速10000r/min；

(5)向内脏破碎物中加入碱性蛋白酶溶液处酶解6小时，酶解温度50℃、料液比1:4、pH值为10.5、酶加入量为800U/g，然后灭酶活性，得到酶解液；

(6)将步骤(5)的酶解液离心分离，取上清液经滤膜过滤，然后经0.22μm超滤膜处理，截留分子量小于5kDa的分子段产物得到粗肽液；

(7)将粗肽液经聚葡糖层析柱Sephadex G25柱层析分离，洗脱波长280nm，收集层析最高峰对应的组份，然后经HPLC分离纯化，HPLC所用色谱柱为Zorbax SB-C18色谱柱，色谱分离波长280nm，收集色谱最高峰对应的组份，冷冻干燥，得到文蛤寡肽，经氨基酸N端测序，最终获得的文蛤寡肽的氨基酸序列为Gln-Leu-Asn-Trp-Asp，分子量为674.6Da，这种方法制备的文蛤寡肽与对比例1相比提取率提高8.23％。

实施例2

一种文蛤寡肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜的文蛤洗净后去壳，取内脏、置于水中搅拌浸泡去除杂质，然后将文蛤内脏调整至中性后匀浆处理制备成文蛤匀浆液；

(2)将文蛤匀浆液与复配溶剂按料液比1:4混合均匀获得浸泡液，所用复配溶剂为离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1混合制成；

(3)降低浸泡液温度至-55℃，向浸泡液中通入脉冲电场处理，脉冲电场处理方法为：脉冲数为200次，电场强度18kV/cm，脉冲宽度为60μs，脉冲频率1000Hz，浸泡液在-55℃低温保持8小时，然后20min升至室温；

(4)4℃离心分离步骤(3)处理后的浸泡液5次，转速12000r/min，回收每次分离的上清液，然后去离子水洗涤残留固体物5次，并4℃离心分离得到内脏破碎物，转速12000r/min；

(5)向内脏破碎物中加入碱性蛋白酶溶液酶解12小时、酶解温度55℃、料液比1:3、pH值为9、酶加入量为1400U/g，然后灭酶活性，得到酶解液；

(6)将步骤(5)的酶解液离心分离，取上清液经滤膜过滤，然后经超滤膜处理，截留分子量小于5kDa的分子段产物得到粗肽液；

(7)将粗肽液经聚葡糖层析柱Sephadex G25柱层析分离，洗脱波长280nm，收集层析最高峰对应的组份，然后经HPLC分离纯化，HPLC所用色谱柱为Zorbax SB-C18色谱柱，色谱分离波长280nm，收集色谱最高峰对应的组份，冷冻干燥，得到文蛤寡肽，经氨基酸N端测序，最终获得的文蛤寡肽的氨基酸序列为Gln-Leu-Asn-Trp-Asp，分子量为674.6Da，这种方法制备的文蛤寡肽与对比例1相比提取率提高8.86％。

实施例3

一种文蛤寡肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜的文蛤洗净后去壳，取内脏、置于水中搅拌浸泡去除杂质，然后将文蛤内脏调整至中性后匀浆处理制备成文蛤匀浆液；

(2)将文蛤匀浆液与复配溶剂按料液比1:3混合均匀获得浸泡液，所用复配溶剂为离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1混合制成；

(3)降低浸泡液温度至-60℃，向浸泡液中通入脉冲电场处理，脉冲电场处理方法为：脉冲数为260次，电场强度20kV/cm，脉冲宽度为70μs，脉冲频率1100Hz，浸泡液在-60℃低温保持7小时，然后16min升至室温；

(4)2℃离心分离步骤(3)处理后的浸泡液4次，转速12000r/min，回收每次分离的上清液，然后去离子水洗涤残留固体物4次，并2℃离心分离得到内脏破碎物，转速12000r/min；

(5)向内脏破碎物中加入碱性蛋白酶溶液酶解8小时，酶解温度40℃、料液比1:2、pH值为9.5、酶加入量为1000U/g；

(6)将步骤(5)的酶解液离心分离，取上清液经滤膜过滤，然后经超滤膜处理，截留分子量小于5kDa的分子段产物得到粗肽液；

(7)将粗肽液经聚葡糖层析柱Sephadex G25柱层析分离，洗脱波长280nm，收集层析最高峰对应的组份，然后经HPLC分离纯化，HPLC所用色谱柱为Zorbax SB-C18色谱柱，色谱分离波长280nm，收集色谱最高峰对应的组份，冷冻干燥，得到文蛤寡肽，经氨基酸N端测序，最终获得的文蛤寡肽的氨基酸序列为Gln-Leu-Asn-Trp-Asp，分子量为674.6Da，这种方法制备的文蛤寡肽与对比例1相比提取率提高10.04％。

对比例2

一种文蛤寡肽的制备方法，与实施例1不同之处在于，步骤(3)中，室温23±2℃下向浸泡液中引入脉冲电场，经测序，最终获得的文蛤寡肽的氨基酸序列为Gln-Leu-Asn-Trp-Asp，分子量为674.6Da，该方法制备的文蛤寡肽与对比例1相比提取率提高6.22％。

对比例3

一种文蛤寡肽的制备方法，与实施例1的不同之处在于，该制备方法在施加脉冲电场结束后，自然升至室温23±2℃，经测序，最终获得的文蛤寡肽的氨基酸序列为Gln-Leu-Asn-Trp-Asp，分子量为674.6Da，该方法制备的文蛤寡肽与对比例1相比提取率提高8.08％。

文蛤寡肽的生物活性测试

按照前文专利申请CN201410624999.7的说明书[0052]段、[0053]段所述的表6肝功能指标测定结果及对应的实验过程来进行不同的文蛤寡肽的生物活性测试，结果见下表所示，其中前文专利表6中的药物组1即对应本申请说明书记载的对比例1。

表1文蛤寡肽的生物活性测试