基于生物正交反应的可快速固化水凝胶、其制法与应用
阅读说明：本技术 基于生物正交反应的可快速固化水凝胶、其制法与应用 (Quick-curing hydrogel based on bioorthogonal reaction, preparation method and application thereof ) 是由 裴仁军 张雅洁 刘敏 于 2018-07-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于生物正交反应的可快速固化水凝胶、其制法与应用。所述制备方法包括：将反式环辛烯修饰到四臂聚乙二醇上,获得反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇；使透明质酸与四嗪进行缩合反应,获得四嗪修饰的透明质酸；将所述反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇与四嗪修饰的透明质酸混合均匀反应,获得基于生物正交反应的可快速固化水凝胶。本发明通过将反式环辛烯修饰到四臂聚乙二醇后,制备可水溶的且修饰有反式环辛烯的四臂聚乙二醇,从而实现了快速固化水凝胶的形成,本发明所获水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境,提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖,并且实现成骨分化。(The invention discloses a fast-curing hydrogel based on bioorthogonal reaction, a preparation method and application thereof. The preparation method comprises the following steps: modifying trans-cyclooctene on the four-arm polyethylene glycol to obtain the trans-cyclooctene modified four-arm polyethylene glycol; carrying out condensation reaction on hyaluronic acid and tetrazine to obtain tetrazine modified hyaluronic acid; and (3) uniformly mixing the trans-cyclooctene modified four-arm polyethylene glycol and tetrazine modified hyaluronic acid for reaction to obtain the quick-curing hydrogel based on the bioorthogonal reaction. The invention modifies the trans-cyclooctene into the four-arm polyethylene glycol to prepare the water-soluble four-arm polyethylene glycol modified with the trans-cyclooctene, thereby realizing the formation of the fast-curing hydrogel.)
技术领域
本发明涉及一种基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应的水凝胶，具体涉及一种三维培养干细胞和分化用的基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶基于生物正交反应的水凝胶及其制备方法与应用，属于组织工程材料制备技术领域。
背景技术
随着科学技术的发展，组织工程已成为修复损伤组织的一种重要手段。相较于其他组织修复技术，利用干细胞的再生功能使其增殖，诱导其朝特定的方向分化。尤其利用三维材料为载体为干细胞提供立体生存环境，在组织工程修复器官方面有诸多优势。
目前常用组织工程中细胞与材料的结合方法包括：细胞接种于材料上和细胞与材料共混成水凝胶，其中细胞与材料共混有利于细胞的生长，尤其是在细胞迁移、粘附、增殖与立体结构方面有诸多优势；此外通过控制共混水凝胶的形状可以提高组织修复的精确度和准确度。但为了确保细胞的活性通常需要寻找具有较高生物相容性的材料。
组织工程中与细胞共混水凝胶的常用的材料包括壳聚糖、聚乙酸、聚乳酸、聚己内酯、透明质酸、海藻酸盐等，利用高分子具有较多的活性官能团，可以将其进行化学修饰，从而用不同的方法成水凝胶；通过改变水凝胶的特性，例如加入细胞外基质于水凝胶，可能会增加细胞的黏附和趋化宿主细胞的迁移，同时也可能会增加种子细胞的分化能力；但多数人工合成高分子材料生物相容性低，降解不彻底，因此，寻找生物相容性好以及可降解的材料作为三维培养细胞的载体尤为重要。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶及其制备方法，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一个目的在于提供所述可快速固化水凝胶的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明实施例提供了一种基于生物正交反应的可快速固化水凝胶和水，其包括聚合物基质，所述聚合物基质由结构如式(1)所示的聚合物形成：
其中，n的取值为70～130，m的取值为115～370。
本发明实施例还提供了一种基于生物正交反应的可快速固化水凝胶的制备方法，其包括：
将反式环辛烯修饰到四臂聚乙二醇上，获得反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇；
使透明质酸与四嗪进行缩合反应，获得四嗪修饰的透明质酸；
将所述反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇与四嗪修饰的透明质酸混合均匀反应，获得基于生物正交反应的可快速固化水凝胶。
本发明实施例还提供了由前述方法制备的基于生物正交反应的可快速固化水凝胶。
本发明实施例还提供了前述的基于生物正交反应的可快速固化水凝胶于细胞培养领域中的用途。
本发明实施例还提供了前述的基于生物正交反应的可快速固化水凝胶于组织工程领域中的用途。
本发明实施例还提供了一种三维培养细胞载体，其包含前述的基于生物正交反应的可快速固化水凝胶。
本发明实施例还提供了一种细胞培养方法，其包括：
以前述的基于生物正交反应的可快速固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养，并促使所述干细胞进行增殖和分化。
较之现有技术，本发明的有益效果在于：
1)反式环辛烯与四嗪间的反应速率极快，但是反式环辛烯不溶于水，从而限制了其在生物医学中的应用，本发明本发明提供的基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶的制备方法，通过将反式环辛烯修饰到四臂聚乙二醇后，制备可水溶的且修饰有反式环辛烯的四臂聚乙二醇，从而实现了快速固化水凝胶的形成；
2)本发明提供了一种基于生物正交反应制备水凝胶三维支架的方法，并实现与细胞共混凝胶化，生物正交反应是一类在活体细胞或组织中不干扰生物体自身性质下可以进行的化学反应，具有优异的生物相容性，毒性低，可以提供三维环境以提高干细胞的增殖与分化；同时制备方法简单，可大量制备；
3)本发明所获基于生物正交反应的可快速固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖，并将其应用于干细胞的增殖与成骨分化研究。
附图说明
图1是本发明一典型实施例中所获基于生物正交反应的可快速固化水凝胶的制备机理示意图。
图2是本发明一典型实施例中所获基于生物正交反应的可快速固化水凝胶的外观图和微观结构图。
图3是本发明一典型实施例中所获基于生物正交反应的可快速固化水凝胶流变图。
图4是干细胞在本发明一典型实施例中所获基于生物正交反应的可快速固化水凝胶中死活染色共聚焦图。
图5是干细胞在本发明一典型实施例中所获基于生物正交反应的可快速固化水凝胶中的增殖图。
图6是干细胞在本发明一典型实施例中所获基于生物正交反应的可快速固化水凝胶中成骨分化碱性磷酸酶/DNA值示意图。
图7a、图7b、图7c和图7d是干细胞在本发明一典型实施例中所获基于生物正交反应的可快速固化水凝胶中成骨分化特异性基因OCN、RunX2、ColⅠ、ALP的表达示意图。
具体实施方式
针对现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互结合，从而构成新的或者优选的技术方方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的系一种基于生物正交反应的可快速固化水凝胶，其包括聚合物基质和水，所述聚合物基质由结构如式(1)所示的聚合物形成：
其中，n的取值为70～130，m的取值为115～370。
其中，至少一个反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇的反式环辛烯与四嗪修饰的透明质酸的四嗪交联。
作为优选方案之一，所述基于生物正交反应的可快速固化水凝胶具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为100～300μm，所述水凝胶的机械强度为1.8～2.2kPa。
进一步地，所述水凝胶中水的含量为70～90wt％。
作为本发明技术方案的另一个方面，其所涉及的系一种基于生物正交反应的可快速固化水凝胶的制备方法，其包括：
将反式环辛烯修饰到四臂聚乙二醇上，获得反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇；
使透明质酸与四嗪进行缩合反应，获得四嗪修饰的透明质酸；
将所述反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇与四嗪修饰的透明质酸混合均匀反应，获得基于生物正交反应的可快速固化水凝胶。
在一些实施例中，所述制备方法包括：将反式环辛烯与四臂聚乙二醇混合均匀，并于15～30℃反应10～20h，获得反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇。
在一些更为具体的实施例中，所述制备方法具体包括：使包含反式环辛烯、缩合剂和第一溶剂的第一混合体系于0～8℃反应10～30min活化羧基，之后加入四臂聚乙二醇，混合均匀形成第二混合体系，之后使所述第二混合体系于15～30℃反应10～20h，获得反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇。
作为优选方案之一，所述缩合剂与反式环辛烯的摩尔比为1～3：1。
进一步地，所述缩合剂包括二环己基碳二亚胺、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐、氯甲酸异丁酯、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
进一步地，所述四臂聚乙二醇与反式环辛烯的摩尔比为1：1～3。
进一步地，所述第一溶剂包括N，N-二甲基甲酰胺等，但不限于此。
进一步地，所述制备方法还包括：在所述第二混合体系的反应结束后，将所获反应混合物加入到大量不良溶剂中，并收集沉淀；随后通过葡聚糖凝胶柱G-15纯化并冷冻干燥，即得到反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇。所述不良溶剂包括正己烷、***等，但不限于此。且所述不良溶剂与第二混合体系的体积比为10～20：1。
作为优选方案之一，所述反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇的结构式如式(2)所示：
其中，n的取值为70～130。
作为优选方案之一，所述制备方法具体包括：使包含有透明质酸、第二溶剂、四嗪和缩合剂的第三混合体系于15～30℃反应10～20h，获得四嗪修饰的透明质酸。
进一步地，所述透明质酸与四嗪的摩尔比为6～10：1。所述缩合剂与透明质酸的摩尔比为0.1～0.5：1。所述缩合剂包括二环己基碳二亚胺、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐、氯甲酸异丁酯、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
进一步地，所述透明质酸与第二溶剂的质量体积比为1～2g：100ml。
更进一步地，所述第二溶剂包括二甲亚砜等，但不限于此。
在一些更为具体的实施例中，所述制备方法具体包括：向浓度为1～2w/v％的透明质酸无水二甲亚砜溶液中加入缩合剂及四嗪并混合均匀，形成第三混合体系，之后使所述第三混合体系在15～30℃反应10～20h，获得四嗪修饰的透明质酸。
作为优选方案之一，所述制备方法还包括：在所述第三混合体系的反应结束后，将所获反应混合物以截留分子量为3500～14000Da的透析袋透析1～3天，之后通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯，之后冷冻干燥，即得到四嗪修饰的透明质酸。
作为优选方案之一，所述四嗪修饰的透明质酸具有四嗪结构，所述四嗪修饰的透明质酸的结构式如式(3)所示：
其中，m的取值为115～370。
在一些实施例中，所述制备方法具体包括：将所述反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇与四嗪修饰的透明质酸于磷酸盐缓冲溶液中混合均匀反应，获得基于生物正交反应的可快速固化水凝胶。
其中，所述反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇与四嗪修饰的透明质酸的质量比为1～3：1。
在一较优实施方式中，所述制备方法进一步包括：
将四臂聚乙二醇与反式环辛烯按照1：1～3的摩尔比混匀，随后加入缩合剂，反应10～20h，获得反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇；
将透明质酸与四嗪按照6～10：1的摩尔比混匀，随后加入缩合剂，反应10～20h，获得四嗪修饰的透明质酸；
将反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇与四嗪修饰的透明质酸按照质量比1～3：1于磷酸盐缓冲溶液中混合均匀，获得基于生物正交反应的可快速固化水凝胶。
优选的，所述基于生物正交反应的可快速固化水凝胶的结构式如式(1)所示，还包括水。
其中，n的取值为70～130，m的取值为115～370。
其中，至少一个反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇的反式环辛烯与四嗪修饰的透明质酸的四嗪交联。
作为优选方案之一，所述基于生物正交反应的可快速固化水凝胶具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为100～300μm，所述水凝胶的机械强度为1.8～2.2kPa。
进一步地，所述水凝胶中水的含量为70～90％。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的基于生物正交反应的可快速固化水凝胶于细胞培养领域中的用途。
优选的，所述的用途包括：以所述基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行细胞的培养。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的基于生物正交反应的可快速固化水凝胶于组织工程领域中的用途。
优选的，所述的用途包括：以所述基于生物正交反应的可快速固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养，并促使所述干细胞进行增殖和分化。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种三维培养细胞载体，其包含前述的基于生物正交反应的可快速固化水凝胶。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种细胞培养方法，其包括：以前述的基于生物正交反应的可快速固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养，并促使所述干细胞进行增殖和分化。
优选的，干细胞于所述基于生物正交反应的可快速固化水凝胶上的负载量为100～1000万个/mL。
藉由上述技术方案，本发明的基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶将常用材料四臂聚乙二醇与生物来源的透明质酸分别进行反式环辛烯与四嗪化修饰，之后复合并与细胞共混，将四臂聚乙二醇和透明质酸相结合，提高细胞的粘附作用、细胞的存活率，所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖，并且实现成骨分化；同时制备方法简单，可大量制备。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
步骤一：将反式环辛烯溶解于1％无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，并加入N-甲基吗啉、氯甲酸异丁酯于4℃反应20min。
其中，所述N-甲基吗啉与反式环辛烯的摩尔比为1：1，氯甲酸异丁酯与反式环辛烯的摩尔比为1.5：1。
步骤二：步骤一的反应结束后，加入四臂聚乙二醇，于15℃反应20h。
其中，所述四臂聚乙二醇与反式环辛烯的摩尔比为1：1.5。
步骤二的反应结束后，在***中沉淀，得到白色絮状沉淀，12000rpm离心5min收集沉淀，水溶解后通过葡聚糖凝胶柱G-15提纯，冻干，得到反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇，其结构式如式(2)所示：
其中，n的取值为115。
这种反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇，主要是将反式环辛烯分子修饰到四臂聚乙二醇上，改善了其水溶性，使本只不溶于水的反式环辛烯分子溶解在水相中。
步骤三：将透明质酸溶于无水二甲亚砜溶液，加入苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐、二异丙基乙胺及四嗪，15℃反应20h。
其中，苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐与透明质酸的摩尔比为0.125：1，二异丙基乙胺与透明质酸的摩尔比为0.125：1，四嗪与透明质酸的摩尔比为0.125：1。
步骤三反应结束后，以截留分子量为3500Da的透析袋透析3天，之后通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯，冷冻干燥后获得四嗪修饰的透明质酸，四嗪修饰的透明质酸的结构式如式(3)所示：
其中，m的取值是185。这种四嗪修饰的透明质酸接枝率为10％。
步骤四：将上述反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇配成浓度为3％m/v的PBS溶液，加入上述四嗪修饰的透明质酸，透明质酸的浓度为2％m/v，并混合均匀；其中，反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇与四嗪修饰的透明质酸的质量比为1.5：1。
步骤四反应结束后，获得所述基于生物正交反应的可快速固化水凝胶如式(1)所示：
上述步骤一至步骤四可通过图1表示。
对本实施例所获基于生物正交反应的可快速固化水凝胶进行表征，其中，四嗪修饰的透明质酸的表征数据为：δ：8.5,7.5(单峰,四嗪苯环上的氢),4.5,(单峰,CH20),4.0-3.0(多重峰,透明质酸糖环上的质子),2(单峰,CH3)。反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇的表征数据为：δ：6.0-5.0,(多重峰,反式环辛烯乙烯基上的氢),3.65,(单峰,四臂聚乙二醇上的氢),2.5-2.0(多重峰,反式环辛烯CH2上的氢)。
本实施例所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶可作为三维培养细胞载体在组织工程中应用。
实施例2
步骤一：将反式环辛烯溶解于1％无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，并加入N-甲基吗啉、氯甲酸异丁酯于8℃进行冰上反应30min。其中，所述N-甲基吗啉与反式环辛烯的摩尔比为1：1，氯甲酸异丁酯与反式环辛烯的摩尔比为3：1。
步骤二：步骤一的反应结束后，加入四臂聚乙二醇，于25℃反应10h。其中，所述四臂聚乙二醇与反式环辛烯的摩尔比为1：3。
步骤二的反应结束后，在***中沉淀，得到白色絮状沉淀，12000rpm离心5min收沉淀，用水溶解上述沉淀，通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯，得到反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇溶液，反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇结构式如上述式(2)所示。其中，n的取值为115。
步骤三：将透明质酸溶于无水二甲亚砜溶液，加入苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐、二异丙基乙胺及四嗪，25℃反应10h。
其中，苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐与透明质酸的摩尔比为0.1：1，二异丙基乙胺与透明质酸的摩尔比为0.125：1，四嗪与透明质酸的摩尔比为0.1：1。
步骤三反应结束后，以截留分子量为14000Da的透析袋透析1天，之后通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯，冷冻干燥获得四嗪修饰的透明质酸，四嗪修饰的透明质酸的结构式如前述式(3)所示。这种四嗪修饰的透明质酸接枝率为10％。
步骤四：将上述反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇配成浓度为3％m/v的PBS溶液，加入上述四嗪修饰的透明质酸，透明质酸的浓度为2％m/v，并混合均匀；其中，反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇与四嗪修饰的透明质酸的质量比为1：1。
实施例3
步骤一：将反式环辛烯溶解于1％无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，并加入N-甲基吗啉、氯甲酸异丁酯于0℃进行冰上反应10min。其中，所述N-甲基吗啉与反式环辛烯的摩尔比为1：1，氯甲酸异丁酯与反式环辛烯的摩尔比为1：1。
步骤二：步骤一的反应结束后，加入四臂聚乙二醇，于20℃反应15h。其中，所述四臂聚乙二醇与反式环辛烯的摩尔比为1：1。
步骤二的反应结束后，在***中沉淀，得到白色絮状沉淀，12000rpm离心5min收沉淀，用水溶解上述沉淀，通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯，得到反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇溶液，反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇结构式如上述式(2)所示。其中，n的取值为115。
步骤三：将透明质酸溶于无水二甲亚砜溶液，加入苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐、二异丙基乙胺及四嗪，20℃反应15h。
其中，苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐与透明质酸的摩尔比为0.6：1，二异丙基乙胺与透明质酸的摩尔比为0.125：1，透明质酸与四嗪的摩尔比为6：1。
步骤三反应结束后，以截留分子量为8000Da的透析袋透析2天，之后通过葡聚糖凝胶柱G-15进行提纯，冷冻干燥获得四嗪修饰的透明质酸，四嗪修饰的透明质酸的结构式如前述式(3)所示。这种四嗪修饰的透明质酸接枝率为10％。
步骤四：将上述反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇配成浓度为3％m/v的PBS溶液，加入上述四嗪修饰的透明质酸，透明质酸的浓度为2％m/v，并混合均匀；其中，反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇与四嗪修饰的透明质酸的质量比为3：1。
下面，以实施例1为代表，通过几种项目性能测试展示实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶作为细胞三维培养载体的应用优势。
性能测试一
在场环扫描电镜测试仪上测试实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶内部结构及孔径大小，其操作方法包括：
将上述基于制备的水凝胶置于液氮中，随后冷冻干燥，0.2mA喷金2min，扫描电镜观察水凝胶微观形貌图(如图2所示)。通过扫描电镜可以看出，该光固化水凝胶微观结构多孔，孔径约100～300μm。
性能测试二
将反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇浓度为3％w/v与四嗪修饰的透明质酸溶液2％w/v，均匀混合形成水凝胶，将该水凝胶在流变仪测试仪上测试实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应形成的水凝胶的机械性能，通过流变结果图3可以看出，G’>G”且呈线性，说明已成凝胶状态。
实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶对干细胞增殖检测。
用钙黄绿素染色法和四唑盐比色法(WST法)来测定实施例1中基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶在鼠源骨髓干细胞(BMSC细胞)中的细胞存活和细胞增殖，其操作方法包括：
将反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇溶于全培养基中浓度为3％w/v，四嗪修饰的透明质酸溶于全培养基中浓度为2％w/v；将全培养基培养的第4代BMSC细胞消化、计数、1000rpm离心4min；将上述反式环辛烯修饰的四臂聚乙二醇溶液与四嗪修饰的透明质酸溶液分别与细胞混合确保细胞浓度为300万/mL；取上述两种细胞共混液各50μL于12孔板中，均匀混合，即得到干细胞与实施例1基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的共混水凝胶，加入完全培养基，放入5％CO2、37℃培养箱中培养。
培养1天和5天后将培养基取出，PBS清洗3次，利用Live/dead试剂盒测定，在激光共聚焦488/561激发下观察细胞活性；活细胞被钙黄绿素染色发出绿色荧光，死细胞被染色发出红色荧光。
如图4所示鼠源的骨髓干细胞在实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶中存活较好并显示三维结构和明显增殖，表明本发明对细胞增殖无影响且能为细胞提供三维生长环境。
培养1天、3天和7天后将培养基取出，每孔加入1mL新鲜培养基，加入100μLWST-1充分混匀，放入5％CO2、37℃培养箱中孵育4h，取100μL于96孔板中酶标仪450nm处测试OD值。
如图5所示BMSC细胞与实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶共混后，培养1天细胞存活较好，培养7天细胞呈现明显增殖，表明实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶毒性低、生物相容性好。
性能测试四
鼠源骨髓干细胞在实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶中分化检测
用碱性磷酸酶检测试剂盒测定细胞中碱性磷酸酶(ALP)含量，picogreeen荧光染色小牛胸腺DNA标准曲线法测定细胞中DNA含量，用ALP/DNA的值来表征干细胞在实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶中的分化程度。
第4代鼠源骨髓干细胞分为两组：
第一组与实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶共混成骨分化培养基培养作为实验组；
第二组与实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶共混完全培养基培养作为对照组。
将两组细胞共混的水凝胶放入5％CO2、37℃培养箱中培养，隔天换新鲜培养基，培养14天。将实施例1所获的两组基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应形成的细胞共混水凝胶分别取出加入200μL细胞裂解液4℃裂解5-6h，再次加入200μL细胞裂解液4℃裂解过夜，取50μL裂解液用作细胞内ALP含量测定，取100μL裂解液用作细胞内DNA含量测定。
如图6所示与实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型与细胞共混的水凝胶中的干细胞在成骨分化培养条件下较完全培养基培养条件下的干细胞有明显的分化，表明干细胞在实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶三维结构上能正常分化。
性能测试五
鼠源骨髓干细胞在实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶中分化检测。
用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定成骨分化特性性基因骨钙素(OCN)、核心结合因子(RunX2)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、碱性磷酸酶(ALP)的表达来表征干细胞在实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶中的分化程度。
第一组与实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶共混成骨分化培养基培养作为实验组；
第二组与实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶共混完全培养基培养作为对照组。
步骤一，总RNA的提取：将两组细胞共混的水凝胶放入5％CO2、37℃培养箱中培养，隔天换新鲜培养基，培养14d。将实施例1所获的两组基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的细胞共混水凝胶分别取出加入1mL预冷总RNA抽提试剂，冰上研磨约10～15min，将上述所得匀浆转移到灭酶EP管内，室温静置5min，再加入200μl氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置3min，之后12000g，4℃，离心5min，收集上层液体至另一EP管中，加入500μL预冷异丙醇，摇匀，室温静置10min，之后4℃，12000g，离心10min，弃上清，用无菌滤纸吸干管口余液，加入预冷的75％乙醇1mL，4℃，7500g，离心5min，弃上清，空气干燥5～10min，加入20～50ul无RNA酶水，取少量，测OD值。
步骤二，反转录反应：于PCR管中分别加入下列试剂：
将上述PCR管置于PCR仪中进行以下程序：37℃15min，85℃5s，即得到DNA模板。
步骤三，荧光定量PCR：于八联管中分别加入下列试剂：
将上述八联管置于PCR仪中进行以下程序：52℃2min，95℃10min，40个循环(95℃30s，55～60℃30s，72℃30s)，即得到成骨分化特性性基因骨钙素(OCN)，核心结合因子(RunX2)，Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)，碱性磷酸酶(ALP)的表达情况。
如图7a、7b、7c和7d所示与实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的与细胞共混的水凝胶中的干细胞在成骨分化培养条件下较完全培养基培养条件下的干细胞成骨分化特异性基因骨钙素(OCN)，核心结合因子(RunX2)，Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)，碱性磷酸酶(ALP)的表达有明显的增高，表明干细胞在实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应形成的水凝胶三维结构上能正常分化，表示实施例1所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应形成的水凝胶有非常好的生物相容性和安全性。
同样，本案发明人对实施例2和3所获基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应形成的水凝胶也同样进行了性能测试一至五，并且得到了与实施例1相近的测试结果。
对照例1：
一般情况下，常规方法制备水凝胶的固化时间在几十秒以上，难以实现快速成型，无法实验细胞在其内的精确定位，限制了其在生物医学中的应用。
与对照案例1相比，本发明实施例1所获水凝胶基于反式环辛烯与四嗪间的生物正交反应成型，该反应速率极快，水凝胶可在2s内成型，较上述常规成型的水凝胶有更广泛的生物应用，例如，本发明实现与细胞共混凝胶化，细胞在其内可精确定位。
对照例2：
一般情况下，常规方法制备水凝胶的条件(如：紫外光照、催化剂、引发剂等)对细胞具有一定的毒性，不利于细胞的生长与增殖。
与对照例2相比，本发明实施例1所获水凝胶基于生物正交反应成型，生物正交反应是一类在活体细胞或组织中不干扰生物体自身性质下可以进行的化学反应，具有优异的生物相容性，毒性低，可以提供三维环境以提高干细胞的生长，增殖与分化。
综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明的基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖，并且实现成骨分化；同时制备方法简单，可大量制备。
此外，本案发明人还参照实施例1-3的方式，以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验，并同样制得了固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境的基于反式环辛烯与四嗪间生物正交反应成型的可快速固化水凝胶。
需要说明的是，在本文中，在一般情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的步骤、过程、方法或者实验设备中还存在另外的相同要素。
应当理解，以上所述实例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。