阅读说明：本技术 一种聚合物、其制备方法及作为检测细菌及抗菌材料的应用 (Polymer, preparation method thereof and application of polymer as bacteria detection and antibacterial material ) 是由 张晓梅 李德康 荆路 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本公开属于抗菌纳米材料技术领域,具体涉及一种聚合物、其制备方法及作为检测细菌及抗菌材料的应用。抗菌纳米材料由于稳定、不易产生耐药性等优点成为抗菌领域的研究热点。本公开提供了一种基于铁卟啉的多孔有机金属聚合物,以吡咯和化合物BFPB为原料,通过水热法合成,制备方法简单。该聚合物具有良好的化学和热稳定性,其3D互连多孔结构提供了丰富的催化活性位点,具有良好类过氧化物酶活性。在近红外光照条件下,该聚合物对金黄色葡萄球菌具有杀灭作用,其制备的Ab<Sub>2</Sub>@Au@FePPOP<Sub>BFPB</Sub>应用于金黄色葡萄球菌的检测具有良好的特异性和灵敏度。(The disclosure belongs to the technical field of antibacterial nano materials, and particularly relates to a polymer, a preparation method thereof and application of the polymer as a bacteria detection and antibacterial material. The antibacterial nano material becomes a research hotspot in the antibacterial field due to the advantages of stability, difficult generation of drug resistance and the like. The disclosure provides a porous organic metal polymer based on ferriporphyrin, pyrrole and a compound BFPB are used as raw materials, and the porous organic metal polymer is synthesized by a hydrothermal method, so that the preparation method is simple. The polymer has good chemical and thermal stability, and the 3D interconnected porous structure of the polymer provides rich catalytic active sites and has good peroxidase-like activity. Under the condition of near-infrared illumination, the polymer has a killing effect on staphylococcus aureus, and Ab prepared from the polymer 2 @Au@FePPOP BFPB The kit has good specificity and sensitivity when being applied to the detection of staphylococcus aureus.)

一种聚合物、其制备方法及作为检测细菌及抗菌材料的应用

技术领域

本公开属于多孔有机聚合物技术领域，具体涉及一种基于铁卟啉的多孔有机聚合物、该聚合物的制备方法、以及该聚合物作为检测细菌及抗菌材料的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

细菌感染是人类健康的主要威胁之一，并且是许多发展中国家和欠发达国家人口的主要死亡原因。纳米材料技术的发展为开发新型抗菌药物提供了机会，与传统抗生素相比，纳米材料由于具有多模式抗菌作用且不易引起细菌耐药性。其中，纳米酶(基于纳米材料的酶模拟物)是目前的一项研究热点，它们从自然自卫系统中汲取灵感，将H₂O₂转化为生物体内的活性氧(ROS)，以抑制细菌活力。例如，据曲晓刚的研究小组报告，石墨烯量子点能够将H₂O₂催化成更高抗菌活性的羟基自由基(·OH)，用于伤口消毒。高利增等发现Fe₃O₄纳米粒子具有优异的抗菌活性，可以通过原位产生的自由基消除生物膜。然而，纳米酶的进一步应用仍然受限，因为在生理环境(通常在中性pH值)下，相对于天然酶，纳米酶的催化活性较差，抗菌效率低下。通过建立复合抗菌系统以达到积极的协同效应可以克服纳米酶的效率低下问题。例如，赵宇亮课题组建立了一种协同抗菌系统，结合类过氧化物酶催化活性和PEG-MoS₂ NFs的有效光热转化，该体系产生的·OH首先破坏微生物膜的完整性，再通过808nm激光照射引起的后续热疗进一步加速谷胱甘肽(GSH)氧化引发更加高效的细菌死亡。另外，Au/g-C₃N₄、 MoS₂@PDA-Ag、nFeS等复合材料用于对抗细菌也具有类似的积极协同效应。

另一方面，目前常用菌落计数、聚合酶链反应(PCR)和流式细胞术(FCM)等方法进行菌的检测。然而，这些方法需要密集的操作、培养耗时长、对技术人员操作要求高。其他方法，如表面增强拉曼散射、荧光共振能量转移、电化学发光、免疫学测定，已被开发用于检测致病菌。其中，夹心酶联免疫吸附测定(ELISA) 由于其低成本、高选择性、简单性和快速性、具有广泛的应用。由于在ELISA 中使用不同种类的酶作为催化剂，如辣根过氧化物酶。然而，通常天然酶物理/ 化学稳定性低、成本高以及回收和再循环困难，纳米酶具有可调节的催化活性和高稳定性逐渐成为天然酶的替代产品。最近，在检测病原菌的比色生物传感器方面，一些纳米材料(Fe₃O₄纳米颗粒簇和Cu-MOF纳米颗粒)被报道作为天然酶有希望的替代品。

近年来，由卟啉或金属卟啉通过强共价键构建的基于卟啉的多孔有机聚合物(PPOP)受到相当大的关注，其高活性以及其与天然酶的密切生物学相关性决定了其可作为良好的光催化剂，电催化剂和仿生催化剂。多孔有机聚合物(POPs) 的固有优点，例如大的表面积、可调的孔结构、可功能化以及高的热稳定性和化学稳定性。由于适当暴露可修饰的催化活性位点和预富集效应，将卟啉整合到多孔骨架中进一步提高了催化活性作为仿生催化剂，与天然辣根过氧化物酶(HRP) 相比，PPOP具有优异的类过氧化物酶活性。由于在框架上延伸的π-π共轭，PPOP 在所需的治疗窗口(700-1000nm)内也显示出显着的窄带隙和强光学吸收。这些特征使它们成为构建新型测菌和抗菌材料的良好选择。

发明内容

然而，针对上述研究背景，本公开报道了一种双功能卟啉基多孔有机聚合物FePPOP_BFPB的合成，用于细菌检测和消除。通过吡咯与4-2,2-双[(4-甲酰基苯氧基)甲基]-3-(4-甲酰基苯氧基)丙氧基}苯甲醛(BFPB)之间的易芳香取代反应合成 FePPOP_BFPB。BFPB的以C为中心的四面体结构使材料具有3D互连多孔结构，高的化学和热稳定性，高密度催化活性位点和突出的近红外光(NIR)吸收性能。受益于这些特征，FePPOP_BFPB在定量、选择性和快速检测金黄色葡萄球菌(S. aureus)及其有效抑制方面表现出优异的双重应用。

本公开第一方面，提供一种聚合物FePPOP_BFPB，所述聚合物FePPOP_BFPB具有如下式Ⅰ所示重复结构单元，

该化合物具有以C为中心的四面体结构，具有良好的化学和热稳定性。并且该结构使纳米材料具有3D互连多孔结构，提供了高密度的催化活性位点和突出的NIR吸收位点。经热重分析，该聚合物在加热到300℃时，质量损失小于 10％，具有优异的热稳定性。证明该聚合物作为模拟酶能够提供丰富的反应位点，有望具有良好的反应效率，且能够适应恶劣条件的测菌与抗菌应用。

本公开第二方面，提供第一方面所述聚合物FePPOP_BFPB的制备方法，所述聚合物FePPOP_BFPB以吡咯及化合物BFPB为原料通过水热法合成，所述化合物 BFPB结构如下式Ⅱ所示，

优选的，所述制备方法的具体步骤如下：将重蒸吡咯、BFPB及FeCl₃·6H₂O 分散于有机溶剂中，惰性气体氛围下搅拌再转移至高压反应釜中加热反应得到沉淀即为聚合物FePPOP_BFPB。

进一步优选的，所述重蒸吡咯、BFPB及FeCl₃·6H₂O的摩尔比为10～14: 16～20:7.5～8.5。

进一步优选的，所述有机溶剂为丙酸。

进一步优选的，所述搅拌温度为22～27℃，或搅拌时间为3.5～4.5小时。

进一步优选的，所述加热反应温度为170～190℃，或加热时间为70～80小时。

进一步优选的，所述制备方法还包括对沉淀进行洗涤及干燥的过程。

本公开第三方面，提供一种复合体[email protected]_BFPB，所述复合体通过金纳米颗粒与第一方面所述FePPOP_BFPB复合而成。

优选的，所述FePPOP_BFPB表面负载金纳米颗粒。

本公开第四方面，提供第三方面所述复合体[email protected]_BFPB的制备方法，所述复合体以第一方面所述FePPOP_BFPB与HAuCl₄为原料，通过光沉积法制备。

优选的，所述制备方法的具体步骤如下：

将FePPOP_BFPB与碱液、乙醇混合得到溶液，向溶液中缓慢加入HAuCl₄得到混合物，采用氙灯照射混合物，搅拌至溶液变为红棕色，其沉淀物为 [email protected]_BFPB复合体。

进一步优选的，所述氙灯为580～620W。

本公开第五方面，提供一种Ab₂@[email protected]_BFPB结合物，所述其中Ab₂为兔抗金黄色葡萄球菌趋化性抗体。

由于金黄色葡萄球菌(S.aureus)表面具有丰富的蛋白A，可以与兔抗金黄色葡萄球菌趋化性抗体(bs-4582R)特异性结合。采用该集合物作为细菌生物检测的传感器，bs-4582R和靶细胞表面上的蛋白A之间具有强特异性结合形成复合物从而可以实现对靶细菌的筛选和检测。

本公开的第六方面，提供第五方面所述Ab₂@[email protected]_BFPB结合物的制备方法，所述制备方法为将第三方面所述复合体置于含有Ab₂的溶液中超声获得。

优选的，所述含有Ab₂的溶液为含有Ab₂的PBS溶液。

本公开第七方面，提供第一方面所述化合物FePPOP_BFPB作为过氧化物模拟酶的应用。

本公开第八方面，提供第一方面所述聚合物FePPOP_BFPB在制备细菌检测生物传感器中的应用。

本公开第九方面，提供一种灭菌方法，所述灭菌方法包括以下步骤：向待处理样品中加入含有第一方面所述FePPOP_BFPB的制剂，并采用近红外光对待处理样品进行照射。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

本公开提供了一种卟啉基多孔有机聚合物FePPOP_BFPB，该聚合物具有良好的热稳定性，较宽的孔径分布；其3D结构提供了丰富的催化位点，并且具有良好的光吸收能力，在808nm照射下具有优异的光热性能。上述结构特征应用于抗菌领域，经研究表明该聚合物由于具有良好的稳定性，可显著提高重复利用率。并且该聚合物具有优异的类过氧化物酶活性，还能够作为针对S.aureus的生物传感器和杀菌剂，用于定量检测及杀灭细菌。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为实施例1中FePPOP_BFPB的热重分析图；

图2为实施例1中BFPB、FePPOP_BFPB的结构表征结果图；

其中，图2(A)为(a)BFPB和(b)FePPOP_BFPB的FT-IR光谱图；

图2(B)为FePPOP_BFPB的¹³C CP/MAS NMR光谱图；

图2(C)为FePPOP_BFPB的SEM图像；

图2(D)为FePPOP_BFPB的氮气吸附-解吸等温线图；

图2(E)为FePPOP_BFPB的孔径分布图；

图2(F)为(a)FePPOP_BFPB粉末的UV-Vis-NIR漫反射光谱和(b)铁卟啉单体 [铁5,10,15,20-四-(4'-溴苯基)卟啉，FeTBrPP]在氯仿中的UV-Vis吸收光谱图。

图3为实施例1中FePPOP_BFPB的光热性质验证结果图；

其中，图3A为808nm激光照射下的FePPOP_BFPB浓度的温度变化曲线图；

图3B为不同FePPOP_BFPB浓度下暴露于808nm激光(1.2W/cm²)期间的温度增量图；

图3C为在用激光照射FePPOP_BFPB 850秒后关闭激光的情况下自然冷却的监测温度曲线，808nm激光功率密度为1.2W/cm²；

图3D为通过应用来自(C)的冷却时段的线性时间数据与驱动力温度的负自然对数，确定来自系统的热传递的时间常数(τ_s)为319.67s。

图4为实施例1中FePPOP_BFPB对TMB的类过氧化物酶催化活性结果图；

其中，图4A为TMB反应混合物的UV-Vis光谱，插图：TMB反应混合物的相应照片：(a)TMB+H₂O₂+FePPOP_BFPB，(b)FePPOP_BFPB+TMB，(c)H₂O₂+TMB 和(d)TMB；

图4(B)为TMB(0.1mM)，FePPOP_BFPB(10μg mL^-1)和H₂O₂(100mM)的pH 依赖性活性。

图4(C)为温度变化曲线图；实验C中的pH设定为3.8；

图4(D)为H₂O₂浓度依赖性类过氧化物酶活性与FePPOP_BFPB(10μg mL^-1)和 TMB(0.1mM)。实验D中的温度设定为25℃。

图5为实施例1中FePPOP_BFPB和正常铁卟啉单体循环催化氧化TMB性能图；

图6为实施例1中FePPOP_BFPB进行稳态动力学测定结果图；

其中，图6A为不同浓度TMB与40mM H₂O₂条件下采用Michaelis-Menten 模型对FePPOP_BFPB动力学测定结果图；

图6B为不同浓度TMB与40mM H₂O₂条件下采用Lineweaver-Burk双倒数模型对FePPOP_BFPB动力学测定结果图；

图6C为0.2mM TMB和不同浓度的H₂O₂条件下采用Michaelis-Menten模型对FePPOP_BFPB动力学测定结果图；

图6D为0.2mM TMB和不同浓度的H₂O₂条件下采用Lineweaver-Burk双倒数模型对FePPOP_BFPB动力学测定结果图。

图7为实施例1中[email protected]_BFPB的SEM图；

图8为实施例1中[email protected]_BFPB测定金黄色葡萄球菌的抗生素亲和力策略的示意图；

图9为实施例1中FePPOP_BFPB的生物传感器的金黄色葡萄球菌测定的剂量- 反应关系；

其中，图9A为基于FePPOP_BFPB的生物传感器的金黄色葡萄球菌测定的剂量 -反应关系；

图9B为基于FePPOP_BFPB的生物传感器的金黄色葡萄球菌测定的统计结果；

图9C为不同菌种的吸光度结果，大肠杆菌Escherichia coli BL21(E.coliBL21)，E.coli DH5α，E.coli XL1和金黄色葡萄球菌S.aureus的浓度为6.0×10⁷ CFU/mL。

图10为实施例1中FePPOP_BFPB对S.aureus的细胞毒性结果直方图；

图11为实施例1中不同浓度的FePPOP_BFPB在808nm激光照射下对金黄色葡萄球菌的作用结果图；

其中，图11(A)在808nm激光照射下用不同浓度的FePPOP_BFPB与或不与 H₂O₂(100μM)一起温育的金黄色葡萄球菌的相对细菌活力直方图；

图11(B)为FePPOP_BFPB对金黄色葡萄球菌的时间-浓度依赖性抗菌活性；

图11(C)为不同实验组金黄色葡萄球菌的照片图；

金黄色葡萄球菌暴露于(1)PBS后形成的细菌菌落的照片，(2)FePPOP_BFPB， (3)FePPOP_BFPB+NIR，(4)H₂O₂，(5)H₂O₂+FePPOP_BFPB，(6) H₂O₂+FePPOP_BFPB+NIR。浓度：FePPOP_BFPB500μg mL^-1，H₂O₂ 100μM，NIR功率密度1.2W cm^-2，持续20分钟。

图12为实施例1中金黄色葡萄球菌孵育后在37℃下培养12小时的照片图；

其中，图12(1)为37℃的PBS；图12(2)为52.5℃的PBS。

图13为实施例1中FePPOP_BFPB抑菌性能荧光检测结果图；

其中，图13A为NBT+NADH+H₂O₂+NIR和 NBT+NADH+FePPOP_BFPB+H₂O₂+NIR系统的UV-Vis光谱；

图13B为H₂O₂+NIR系统中存在和不存在FePPOP_BFPB时DPBF含量的图；

图13C为不同反应体系的荧光光谱图；

图13D为425nm荧光光谱直方图；

图13E为利用FePPOP_BFPB+H₂O₂处理S.aureus的示意图。

图14为实施例1中不同实验组中的细菌SEM图像；

其中，图14A为细菌的SEM图像；图14B为细菌+FePPOP_BFPB的图像；图14C为细菌+FePPOP_BFPB+NIR的图像；图14D为细菌+H₂O₂的SEM图像；图14E为细菌+H₂O₂+FePPOP_BFPB的图像；图14F为细菌+H₂O₂+FePPOP_BFPB+NIR的图像；浓度：FePPOP_BFPB 500μg mL^-1，H₂O₂ 100μM；NIR功率密度1.2W cm^-2，持续20分钟。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，由于纳米抗菌材料构建的协同抗菌系统可通过多模式抗菌、协同效应改善个体治疗的低效性。本公开提供了一种抗菌活性材料 FePPOP_BFPB，在定量、选择性和快速检测以及S.aureus的有效抑制方面表现出优异的性能。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

1.BFPB的制备

体系温度保持70℃，氮气保护下向装有搅拌棒和冷凝器的100mL圆底烧瓶中加4-羟基苯甲醛(1.259g，10.3mmol)溶于15mL无水DMF中的溶液，用碳酸钾(4.275g，30.9mmol)处理1小时。然后向体系缓慢加入溶有四溴化季戊四醇 (1g，2.58mmol)的5mL无水DMF溶液，并将反应混合物在剧烈搅拌下100℃加热72小时。在冷却至室温后，在减压过滤除去大部分溶剂。加入冰水，用CH₂Cl₂萃取，有机相用冰水反复洗涤，然后用无水MgSO₄干燥，除去溶剂，得到BFPB 1.4g，收率95％。

1.2 FePPOP_BFPB的制备

FePPOP_BFPB通过简单的水热法合成。将重蒸吡咯(10μL,0.12mmol)和BFPB (100mg,0.18mmol)，FeCl₃·6H₂O(21.9mg,0.081mmol)分散在100mL丙酸中，并将反应体系在氮气保护下25℃下搅拌4小时然后将溶液转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中于180℃下加热72小时。冷却至室温后，过滤得深棕色沉淀，用 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，超纯水和甲醇反复洗涤沉淀物，直至滤液变为无色。最后，将得到的沉淀物在80℃下真空干燥24小时。得到FePPOP_BFPB棕色粉末，产率为60％。燃烧得到的元素分析值为C：68.21，H：4.881，N：5.4。计算出的FePPOP_BFPB的理论公式为C：71.14，H：5.37，N：10.29。ICP-AES分析表明 Fe含量为0.386％。

1.3 [email protected]_BFPB的制备

将30.5mg FePPOP_BFPB和NaOH(0.2M,1mL)与20mL乙醇混合。超声处理 3分钟后，将2mL HAuCl₄(0.8wt.％)缓慢加入溶液中。然后，用500W氙灯照射混合物，搅拌12小时直至溶液变成红棕色。将沉淀物用水和乙醇洗涤至少三次以除去游离的金纳米颗粒用于进一步研究。在80℃下真空干燥24小时后，得到 37.7mg [email protected]_BFPB，为棕色粉末。ICP-AES分析表明，Fe和Au含量分别为0.34％和5.35％。

2.1类过氧化物酶活性测量

通过在25℃下监测3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)与FePPOP_BFPB的反应3分钟后颜色变化来进行催化活性实验。H₂O₂、TMB和FePPOP_BFPB的最终浓度分别为40mM、0.1mM和10μgmL^-1。缓冲溶液(pH＝3.8)含有NaOAc和HOAc。为了获得催化活性的最佳条件，在相同条件下进行pH值(1.70-11.10)，温度(5-65℃)， H₂O₂浓度(0.5-80mM)。对FePPOP_BFPB(10μg·mL^-1)动力学分析，其中(i)固定量的H₂O₂(40mM)和不同量的TMB(0-0.2mM)溶液，(ii)固定量的TMB(0.1mM)和不同量的H₂O₂(0-30mM)。通过基于由Michaelis-Menten方程导出的 Lineweaver-Burk双倒数方程的图线性拟合方法计算动力学参数：

1/V＝(K_m/V_max)(1/SD+1/V_max

其中[S]是基质的浓度，V是初始速度，V_max是最大速度，K_m是米氏常数。通过使用Hitachi U-400紫外-可见分光光度计测量652nm处的吸光度来监测所有反应。

2.2细菌样品制备和比色检测

通过在37℃下在Luria-Bertani(LB)培养基中生长并摇动12小时来培养S.aureus。LB培养基含有1.0g胰蛋白胨，0.5g酵母提取物和1.0g NaCl在100mL 水中的溶液。通过离心(5000rpm，5分钟)收获细菌细胞，然后洗涤两次并重悬于PBS(10mM，pH＝7.40)中，并在600nm下稀释至0.6的光密度(OD₆₀₀＝0.6)。使用常规平板计数法测定细菌的细胞数，并将结果转换为OD₆₀₀值。在使用前后，将所有玻璃器皿在120℃的高压釜中灭菌30分钟。

对于比色测定，万古霉素(Van)通过(EDC/NHS)介导的酰胺化反应在96孔微板上与BSA缀合。首先，将5％BSA(200μL/孔)注入高结合聚苯乙烯96孔板的每个孔中，并在4℃下孵育24小时。然后用PBS(10mM，pH＝7.4)洗涤缓冲液彻底洗涤平板以除去未结合的BSA。另外通过在EDC：NHS(摩尔比＝4:1)的3mL (pH＝6.0)MES缓冲溶液中，并在室温下保持20分钟孵育来活化20mg Van。然后将200μL/孔的活化的Van溶液引入到结合了BSA的96孔板中，并在4℃孵育过夜以获得BSA-Van结合物。用PBS洗涤后，将板与不同浓度的细菌在37℃下孵育1小时。随后，用PBS除去未附着细胞。最后向每个孔中加入含有TMB(0.1 mM)和(40mM)的NaOAc-HOAc缓冲溶液(10mM，pH＝3.8，200μL)处理30分钟，随后用酶标仪测定每孔在625nm处的吸光度值。

2.3 NIR照射下FePPOP_BFPB的体外抗菌实验

使用600nm处的光密度值来评价FePPOP_BFPB对S.aureus的抗菌能力。测试了六组实验条件：(A)细菌，(B)细菌+FePPOP_BFPB，(C)细菌+FePPOP_BFPB+NIR， (D)细菌+H₂O₂，(E)细菌+H₂O₂+FePPOP_BFPB，(F)细菌+H₂O₂+FePPOP_BFPB+NIR。在该测定中，用PBS将细菌(OD₆₀₀＝0.6)稀释100倍，并将细菌稀释液(20μL)加入96孔板中。FePPOP_BFPB，H₂O₂和细菌的最终浓度分别为500μg/mL，100μM 和6.0×10⁵CFU/mL，并且每个孔中所得混合物的总体积为0.2mL。然后，将混合物在37℃下培养30分钟。对于NIR激光照射组，在孵育10分钟后，使用功率密度为1.2Wcm^-2的808nm激光20分钟。当抗菌处理完成时，用移液管移除 10μL混合物并放入200μL LB培养基中，将其在37℃下振荡培养12小时。最后，测量OD₆₀₀以检测细菌的存活率并评估FePPOP_BFPB的抗菌效率。所有实验重复六次。为了确保实验的准确性，还通过标准平板计数法测量S.aureus浓度进一步评估FePPOP_BFPB的抗菌效果。

2.7活性氧(ROS)的检测

通过非荧光化合物对苯二甲酸(TA)向高荧光产物2-羟基二乙酸(TAOH)的转化来检测H₂O₂分解成·OH。11组实验：(a)PBS，(b)TA，(c)TA+FePPOP_BFPB， (d)TA+H₂O₂，(e)TA+NIR，(f)TA+FePPOP_BFPB+H₂O₂，(g) TA+FePPOP_BFPB+H₂O₂+52.5℃，(h)TA+FePPOP_BFPB+NIR，(i)TA+NIR+H₂O₂，(j) TA+H₂O₂+52.5℃，和(k)TA+FePPOP_BFPB+NIR+H₂O₂。最终的实验条件是 FePPOP_BFPB(500μg mL^-1)，H₂O₂(100μM)和TA(0.5mM)。摇动并在黑暗中于37℃保存10分钟后，用808nmNIR激光(1.2W cm^-2)照射(e)，(h)，(i)和(k)组混合物。持续20分钟。将(g)和(j)组混合物在52.5℃下在水浴釜中温育20分钟。其他组(非 NIR或水浴处理组)也用30分钟处理。记录425nm处最大荧光发射峰的变化。

通过1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)评估由FePPOP_BFPB产生的¹O₂的可能性。将20μLFePPOP_BFPB(50μg/mL)加入到含有DPBF的1.98mL DMF溶液中，并用 1.2W/cm²的808nm激光照射悬浮液。每5分钟通过UV-Vis光谱监测414nm处 DPBF吸光度的降低。根据这些数据，计算DPBF的降解率。

硝基蓝四唑(NBT)还原为单甲臢用于检测PBS中超氧阴离子自由基(O₂ ^·–)的形成。将含有0.2mM NBT，0.5mM还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和 50μg/mL FePPOP_BFPB的水体系(2.0mL)加入到石英池中，在1.2W/cm²的808nm NIR激光照射下20分钟。在存在NBT，NADH和NIR激光照射而没有FePPOP_BFPB的情况下进行对照实验。通过UV-Vis光谱检测λ＝600nm处的吸光度增加来监测反应进程。

2.8细菌的形态学观察

六种实验条件：(A)细菌，(B)细菌+FePPOP_BFPB，(C)细菌+FePPOP_BFPB+NIR， (D)细菌+H₂O₂，(E)细菌+H₂O₂+FePPOP_BFPB，(F)细菌+H₂O₂+FePPOP_BFPB+NIR，用含有4％多聚甲醛的PBS溶液在4℃下固定4小时。然后，通过一系列乙醇/ 水将细胞脱水10分钟。最后，在SEM分析之前对样品喷铂。

3.1 FePPOP_BFPB的合成和表征

FePPOP_BFPB通过独特的自下而上策略合成。这种基于简单水热法的合成方法是通过在丙酸介质中的BFPB、FeCl₃和吡咯180℃反应72小时来实现的。在酸性条件下，BFPB的醛首先通过质子化活化。然后吡咯环被活性碳原子亲电芳香取代，并进一步缩合，得到具有游离醛基的大环卟啉结构单元。

通过FT-IR和¹³C CP/MAS NMR证实FePPOP_BFPB的成功合成。从图2A中可以看出，与BFPB的FT-IR光谱相比，FePPOP_BFPB中-CHO伸缩键(1689cm^-1) 的消失表明所有BFPB已经转化为最终材料。此外，在FePPOP_BFPB的FT-IR光谱中观察到1009cm^-1的中等峰，其对应于卟啉铁的Fe-N振动带，暗示形成卟啉大环化合物。FePPOP_BFPB的结构也通过固态¹³C CP/MAS NMR在分子水平上表征(图2B)。66.22ppm的信号归因于BFPB的sp3杂交的C-C单键位点， 159.13,130.20和117.70ppm的信号归因于FePPOP_BFPB中的卟啉骨架和苯基部分。 SEM图像(图2E)显示FePPOP_BFPB由相对均匀的球状颗粒组成，平均直径为150 nm。通过热重分析(TGA)检测FePPOP_BFPB的热稳定性。可以看出，在加热至300℃时观察到质量损失小于10％(图1)。这种损失可归因于水或其他小客体分子的蒸发，这明显意味着FePPOP_BFPB具有优异的热稳定性，这使其成为模拟酶和在恶劣条件下抗菌实际应用的合适候选物。

FePPOP_BFPB的表面积和孔隙率通过氮吸附-解吸等温线在77K测定。从图2C可以看出，FePPOP_BFPB的N₂吸附等温线测量显示典型的IV型吸附等温曲线，具有明显的滞后效应，证实了FePPOP_BFPB中存在中孔。用于FePPOP_BFPB的 Brunauer-Emmett-Teller(BET)表面积和Langmuir表面分别测定为308m² g^-1和601 m² g^-1。由非局部密度泛函理论(NLDFT)确定，FePPOP_BFPB具有宽的孔径分布，如图2D，孔宽度集中于3.5，5和9.3nm，表示它们的结构层次。较高的比表面积和显着不同的孔径分布不仅为随后的催化和抗菌性能提供了更多的活性位点，而且还促进了所有活性位点易于获得以及反应物和产物的扩散。

为了研究FePPOP_BFPB对光吸收的能力，通过UV-vis漫反射光谱测量评估材料的电子性质。从图2F可以看出，正常的铁卟啉单体仅在417nm附近的窄可见区域中显示出强吸收带。然而，当形成铁卟啉基有机多孔聚合物时，观察到在 300-1100nm范围内具有显着延伸至1400nm的更强的吸收强度。有趣的是，与 808nm处几乎没有正常铁卟啉的吸收相比，FePPOP_BFPB仍然表现出808nm的相对强度比，而417nm(I_808nm/I_417nm)高达0.69。这些结果表明FePPOP_BFPB的3D结构由于其结构可调的烷基链而有利于其内卟啉的堆积，并进而增强其在长波长可见和近红外区域的吸收能力。基于紫外漫反射光谱中的起始波长，FePPOP_BFPB的带隙估计为1.04eV。窄带隙进一步表明在FePPOP_BFPB的3D骨架上延伸的π-π共轭，这将有利于其在NIR激光照射下的有效光转换效率。

通过暴露于808nm近红外(NIR)激光照射下，监测其分散于PBS的体系温度来研究FePPOP_BFPB的光热性质。图3A和图3B显示在暴露于NIR(1.2W/cm²)850 秒内FePPOP_BFPB在不同浓度(62.5-1000ppm)下的温度曲线。可以看出，随着FePPOP_BFPB浓度的增加，温度逐渐升高，并且达到1000ppm(1000μg/mL)， FePPOP_BFPB的达到最高温度(55℃)。相反，在相同条件下，不含FePPOP_BFPB的 PBS溶液的温度仅从26.0升温至30.1℃。接下来，通过NIR激光器以1.2W/cm²研究FePPOP_BFPB的光热转换效率。如图3C所示，照射850秒后，关闭激光直到温度冷却到稳定状态。根据报道的定量方法，FePPOP_BFPB的光热转换效率值(η) 确定为35.6％。这些结果证实FePPOP_BFPB在808nm照射下具有优异的光热性能，通过有效且快速地将光能转化为热。光热发生效率优异的可能原因是：(1) FePPOP_BFPB由于其π-π共轭结构的扩展而在NIR中具有高吸收强度，显着提高了其近红外光吸收能力。(2)由于FePPOP_BFPB的比表面积和开孔通道较高，产生的热量可迅速散发到周围环境中。这些特征将用于以下抗菌研究中。

3.2FePPOP_BFPB的过氧化物酶活性

在成功合成和表征FePPOP_BFPB材料后，FePPOP_BFPB的固有类过氧化物酶活性通过典型过氧化物酶底物(TMB)的氧化来研究，通过紫外-可见吸收光谱在652 nm监测。与单独存在FePPOP_BFPB或H₂O₂时没有明显的颜色变化相比，图4A，当FePPOP_BFPB和H₂O₂一起加入TMB溶液时，观察到明亮的蓝色，类似于天然酶辣根过氧化物酶(HRP)。与其他基于纳米材料的过氧化物酶模拟酶， FePPOP_BFPB的催化活性也取决于pH和H₂O₂浓度以及反应温度，图4B-D。然而，可以看出，FePPOP_BFPB在宽pH(pH＝1.70-7.02)和温度(5-65℃)范围内表现出高催化活性。与pH＝3.80时相比，FePPOP_BFPB即使在pH＝7.02时仍保持64％的活性。这显着增强的催化活性归因于FePPOP_BFPB具有丰富的π-π共轭卟啉单元和高度 3D多孔结构的事实，其通过π-π堆积相互作用增加TMB在FePPOP_BFPB上的负载能力并且使得所有活性位点易于获得。此外，FePPOP_BFPB由于其坚固的特性，还表现出良好的稳定性和可回收性。使用五次后，未观察到催化活性的明显降低， (图5)。相反，当使用正常的铁卟啉单体作为催化剂时，在5个循环后，oxi-TMB 的吸收强度降低至37％。

为了更好地理解FePPOP_BFPB的过氧化物酶活性，接下来使用稳态动力学方法确定动力学参数，Michaelis-Menten常数(K_m)和最大反应速度(V_max)(图6)。如表1所示，以H₂O₂为底物的FePPOP_BFPB的K_m值略高于天然酶HRP的K_m值，但以TMB为底物的FePPOP_BFPB的K_m值几乎是HRP的K_m值的43倍。此外，与先前出版物中的其他卟啉单体和金属基纳米酶系统相比，FePPOP_BFPB也表现出较低的K_m值，其中TMB和H₂O₂作为底物(表1)。这些结果清楚地表明FePPOP_BFPB具有优异的类过氧化物酶活性。

表1.FePPOP_BFPB与其他催化剂的动力学参数比较

K_m是米氏常数，V_max是最大反应速度。

3.3比色生物传感器对S.aureus 3.3.1基于FePPOP_BFPB的生物传感器的性能

基于FePPOP_BFPB的优异类过氧化物酶活性，制备了靶向比色生物传感器以定量检测金黄色葡萄球菌S.aureus(一种典型的***，其引起许多危险的传染病，例如菌血症，肺炎，皮肤和软组织感染，在这里作为模范目标)。已经报道了许多分子识别剂，包括抗体，适体，多肽和特定蛋白质。然而，它们中的大多数经常遭受稳定性差，成本高，批次间性能变化和商业不可用的缺点，这严重限制了它们的实际应用。万古霉素(Van)是一种用于治疗和预防细菌感染的广谱糖肽类抗生素，是解决这一问题的有前途的选择。在大多数***细胞壁中，它可以通过Van和D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)之间的五点氢键结合模式牢固地锚定到大多数***。作为市售的常规药物，Van具有高稳定性，低成本和良好质量可控性的优点。然而，它对S.aureus的特异性不足。幸运的是，调查显示，S.aureus的表面含有丰富的蛋白A，可以与兔抗金黄色葡萄球菌趋化性抗体(bs-4582R)特异性结合。因此，选择bs-4582R作为第二识别剂(Ab₂)以大大提高基于纳米探针的生物传感器的特异性。

图7说明了比色生物传感器对S.aureus的原理。在该方案中，通过物理吸收将Van固定在96孔微孔板上。Van作为一种广谱抗生素，它可以在孵育后通过其多个结合位点牢固地捕获S.aureus，并减少其他非靶标细菌的非特异性吸收。然而，由于其广谱抗菌性，Van通常表现出不足的特异性。

为了解决这个问题，将修饰了bs-4582R的[email protected]_BFPB加入板中并与靶细菌结合，通过bs-4582R和细胞表面上的蛋白A之间的强特异性结合形成夹心复合物。因此，实现了识别和结合靶细菌的互补效应。然后，加入3,30,5,50-四甲基联苯胺(TMB)和H₂O₂作为底物以催化显色反应，结果通过酶标仪在652nm 下记录。

S.aureus的浓度与以FePPOP_BFPB为催化剂的TMB的氧化反应呈线性关系。S.aureus检测线性范围为6.0×10²-6.0×10⁷CFU/mL，线性回归方程为 y＝0.22804+0.0135x，线性相关系数(R²)为0.9951(其中x和y分别为S.aureus的浓度和吸光度响应)。令人惊讶的是，检测限(LOD)为24CFU/mL(S/N＝3)，低于其他最近报道的用于S.aureus检测的优异生物传感器(总结于表2)。该生物传感器平台的良好性能归因于bs-4582R的高选择性，Van的强亲和力和FePPOP_BFPB的优异类过氧化物酶活性。因此，修饰了bs-4582R的[email protected]_BFPB被认为是一种灵敏，稳健，高效的信号探针，可快速准确地检测S.aureus。

表2.比较目前的方法和相关的致病菌分析方法

3.3.2比色生物传感器对S.aureus的特异性

由于其广谱的抗菌性，Van可以锚定多种革兰氏阳性菌。为了监测比色生物传感器的特异性，在相同条件下分析了其他三种干扰细菌-革兰氏阴性菌：大肠杆菌Escherichiacoli BL21(E.coli BL21)，E.coli DH5α和E.coli XL1。只有当 S.aureus处于检测样品中时，才能发生相对快速的TMB氧化反应并显示出明显的信号。这些结果表明，所提出的策略对S.aureus表现出良好的选择性。

3.3.3在实际样品分析中的应用

为了验证该方法的可靠性和应用潜力，本实施例用不同浓度的S.aureus感染三种无菌饮用水，三种无菌果汁和三种无菌牛奶样品，并使用所提出的方案进行测定。如表3所示，回收率为89.50％至100.33％，相对标准偏差(RSD)均低于7.31％，证明该策略在实际样品分析中具有可接受的准确度和优异的应用潜力。

表3.基于FePPOP_BFPB的生物传感器(n＝3)对样品中S.aureus的回收率

^a样品稀释5倍。^b样品稀释20倍。

3.4 FePPOP_BFPB对S.aureus的抗菌活性

作为传统的医用试剂，H₂O₂广泛用于伤口消毒。然而，由于其低效率和缓慢的过程，经常使用高浓度的H₂O₂，这对健康组织有害并且可以引起免疫和炎症甚至延迟伤口愈合。研究表明，纳米材料具有催化H₂O₂分解产生·OH的能力。与H₂O₂相比，·OH具有更高的抗菌活性。这种转化不仅改善了H₂O₂的抗菌性能，而且还可以在伤口消毒中使用低浓度的H₂O₂。由于金属卟啉衍生物具有优异的类过氧化物酶/芬顿/光芬顿催化活性，因此FePPOP_BFPB对S.aureus的抗菌能力接下来通过使用生物学相关水平的H₂O₂(100μM)进行评估。通过测量OD₆₀₀检测相对细菌活力。

在研究之前，评估了FePPOP_BFPB的细胞毒性。从图9中可以看出，单独的FePPOP_BFPB对S.aureus显示出可忽略的抗菌作用，表明其细胞毒性低。在 H₂O₂(100μM)存在下，各种浓度的FePPOP_BFPB仍无法有效杀灭细菌。可能的原因可能是生理(中性)pH环境中的弱类过氧化物酶活性。为了进一步改善对S. aureus的抗菌作用，将NIR引入该系统以构建光辅助协同抗菌系统。与 FePPOP_BFPB+H₂O₂或FePPOP_BFPB+NIR组相比，细菌与FePPOP_BFPB+H₂O₂(100μM) 孵育10分钟后暴露于808nm激光(0.9W cm^-2)20min，细菌死亡率增加。用功率密度为1.2W cm^-2的NIR激光照射20分钟，FePPOP_BFPB(500μg mL^-1)可将细菌存活率降低至10％，表明FePPOP_BFPB具有优异的抗菌能力。如上所述， FePPOP_BFPB具有高光热转换效率。当FePPOP_BFPB(500μg mL^-1)暴露NIR(1.2 W/cm²)10分钟时，系统的温度升至52.5℃。为了评价外部加热杀死细菌的效率，将S.aureus在LB中于52.5℃培养20分钟，与NIR照射同时进行。从图11可以看出，与在37℃培养的对照组相比，在52.5℃培养的S.aureus抑制率几乎保持不变。因此，S.aureus的死亡不是由外部热量引起的。然而，实验结果清楚地表明，NIR激光作为一种有效的调节剂，显着增强了FePPOP_BFPB+H₂O₂的抗菌作用。

为了探索NIR辐射能够有效提高FePPOP_BFPB抗菌性能的机理，进行了一系列实验。据报道，·OH，O₂·^-和¹O₂是负责H₂O₂参与抗菌反应的主要活性物质。通过使用NBT还原为单甲臢，UV-Vis光谱测量λ＝600nm处的单甲臢的吸收，来测定O₂·^-的存在。在NBT+NADH存在下，H₂O₂+NIR或FePPOP_BFPB+H₂O₂+NIR 系统中，未检测到λ＝600nm处的吸收峰，这意味着没有O₂·^-产生。为了检测是否用NIR照射产生¹O₂，通过时间依赖性电子吸收光谱监测作为捕获剂的1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)。与DPBF+H₂O₂+NIR系统的对照实验相比，在 DPBF+FePPOP_BFPB+H₂O₂+NIR系统中观察到可忽略不计的DPBF降低，表明在 NIR辐照过程中没有产生¹O₂。

接下来，使用对苯二甲酸(TA)作为荧光探针，其可以与·OH反应，在425nm 处形成高荧光产物2-羟基四乙酸，用于证实FePPOP_BFPB催化的·OH的形成。在 TA+FePPOP_BFPB+H₂O₂存在下观察到显着的荧光增强，这表明FePPOP_BFPB催化形成·OH。与TA+FePPOP_BFPB+H₂O₂相比，TA+FePPOP_BFPB+H₂O₂系统在52.5℃下进行评估时，没有观察到明显的荧光增强，这进一步暗示外部热量不是S. aureus死亡的主要原因。即使没有H₂O₂，TA+FePPOP_BFPB+NIR系统中的荧光增强与TA+FePPOP_BFPB+H₂O₂系统相似。与这两种体系相比， TA+FePPOP_BFPB+NIR+H₂O₂混合溶液中的荧光变化几乎高出5倍，表明近红外光激发下，FePPOP_BFPB的催化活性显着提高。

这些结果可能归因于它们不同的催化机制。FePPOP_BFPB+H₂O₂的可能机制是 Fenton反应(在H₂O₂存在下Fe³⁺/Fe²⁺循环)，导致·OH的产生。对于 FePPOP_BFPB+NIR，NIR照射可以诱导FePPOP_BFPB产生光激发电子和空穴 (FePPOP_BFPB+hv→FePPOP_BFPB ^*)，它们可以与溶解的O₂反应产生·OH。当近红外光被引入FePPOP_BFPB+H₂O₂系统时，由于FePPOP_BFPB的优异光学性质，产生了许多高能电子-空穴对。一旦将光激发的电子注入到FePPOP_BFPB的导带中，光激发的电子将转移到FePPOP_BFPB中的Fe³⁺，并提高H₂O₂引起的Fe³⁺/Fe²⁺的循环效率，作为光芬顿反应，从而导致更多的·OH生成。值得注意的是，类过氧化物纳米酶通常表现出pH依赖性催化活性。它们在酸性条件下表现出优异的过氧化物酶活性，但在中性pH条件下活性严重下降。FePPOP_BFPB可以在NIR的帮助下催化在中性条件下产生一定量的·OH，从而有效地增加它们在生理环境中的实际应用。此外，由于FePPOP_BFPB具有优异的多孔性质，所形成的·OH容易从材料中扩散并侵袭细菌。

为了进一步揭示FePPOP_BFPB的抗菌机制，采用扫描电子显微镜(SEM)对S. aureus的形态学损伤进行成像。如图13所示，未处理的S.aureus(图13A)和用 FePPOP_BFPB处理的S.aureus(图13B)是球形的，具有清晰和光滑的表面，表明 FePPOP_BFPB对S.aureus的毒性很小。在用NIR(图13C)，H₂O₂(图13D)或 FePPOP_BFPB+H₂O₂(图13E)处理后，S.aureus显示出皱纹和部分合并的膜。不幸的是，在这种治疗后，S.aureus不能完全灭活。然而，通过用FePPOP_BFPB+H₂O₂+NIR处理，细胞膜发生剧烈塌陷，胞质大量渗漏，表明多模体系抗菌能力显著提高。

上述结果验证了FePPOP_BFPB的高效类过氧化物酶活性和近红外光驱动的光芬顿活性，并探索了其在选择性、定量和快速比色检测以及针对S.aureus的抑制方法中的应用。具有扩展的π-π共轭体系和大表面积的FePPOP_BFPB的3D多孔结构提供了更多的表面催化位点和增加的近红外区域吸收效率，这反过来增强了卟啉的固有类过氧化物酶特征和光芬顿活性。通过利用其优异的过氧化物酶活性，首先建立了基于FePPOP_BFPB的S.aureus的快速和目视检测，其具有可接受的特异性，灵敏度和稳定性。S.aureus可以在6.0×10²到6.0×10⁷CFU/mL的线性范围内直接测定，检测限(LOD)为24CFU/mL(S/N＝3)。在抗菌应用的情况下， FePPOP_BFPB表现出优异的光Fenton活性，以加速低浓度H₂O₂的分解，在NIR 照射下产生大量的·OH。与FePPOP_BFPB+H₂O₂或FePPOP_BFPB+NIR系统相比， FePPOP_BFPB+H₂O₂+NIR系统对S.aureus具有显着增强的清除功效。得益于其在经济效率，稳定性，类过氧化物酶和光芬顿活性方面的优异性能，FePPOP_BFPB可作为临床使用的多功能诊断和治疗材料的绝佳候选者。

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