阅读说明：本技术 一种基于等离激元金纳米囊泡的超灵敏细菌鉴定方法 (Ultra-sensitive bacterium identification method based on plasmon gold nano vesicles ) 是由 乔亮 易佳 王新军 刘宝红 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于等离激元金纳米囊泡的超灵敏细菌鉴定方法。该方法利用等离激元金纳米囊泡包封细菌样品,将细菌样品限制在直径为100微米的等离激元金纳米囊泡中,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术进行细菌鉴定。本发明构建的细菌鉴定方法,能够实现低至40个细菌的细菌鉴定,具有较强的可操作性和实用性。(The invention discloses an ultrasensitive bacteria identification method based on plasmon gold nano vesicles. The method comprises the steps of encapsulating a bacterial sample by utilizing plasmonic gold nanovesicles, limiting the bacterial sample in the plasmonic gold nanovesicles with the diameter of 100 microns, and carrying out bacterial identification by a matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technology. The bacteria identification method constructed by the invention can realize the bacteria identification of as few as 40 bacteria, and has stronger operability and practicability.)

一种基于等离激元金纳米囊泡的超灵敏细菌鉴定方法

技术领域

本发明属于医疗检测领域，具体涉及一种基于等离激元金纳米囊泡的超灵敏细菌鉴定方法。

背景技术

细菌耐药会引起高发病率、高死亡率，并带来高经济负担。细菌的快速鉴定在细菌感染的诊断中发挥着重要作用。细菌鉴定的方法有很多，例如生化试验、免疫学的方法、DNA测序和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。其中基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry, MALDI-TOF MS）的发展彻底改变了细菌鉴定的现状，细菌的基因型和表型之间建立了桥梁。[BIZZINI, A., GRUB, G. Matrix Assisted Laser DesorptionIonization Time of Flight Mass Spectrometry a Revolution in ClinicalMicrobial Identification. [J]. Clinical Microbiology and Infection, 2010, 16,1614-1619.]，但使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行细菌鉴定时，单个样本点需要超过10⁴个细菌细胞以产生质量合格的谱图，用于与标准谱图库中的参考谱图进行比对。质量差的质谱图会导致错误的鉴定结果，甚至在临床诊断中产生假阴性的诊断结果。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的检测灵敏度很大程度上受到制样方法的限制，传统的制样方法是使用移液枪直接在普通的靶板上进行点样，得到的样品点直径约2毫米，远大于激光光束直径（~0.1毫米），这使得样品不能得到有效的利用。等离激元金纳米囊泡为解决这一问题提供了一种新的思路。

等离激元纳米囊泡是一种微胶囊，即在微米级的液滴表面包裹着一层自组装的纳米粒子。[DINSMORE, A. D., HSU. M. F., NIKOLAIDES, M. G., et al. Colloidosomes:Selectively Permeable Capsules Composed of Colloidal Particles. [J]. Science,2002, 298: 1006-1009.]只需通过简单的乳化操作，便可以快速制备大量一定尺寸的微米级的等离激元纳米囊泡。[BOLLHORST, T., REZWAN, K., MAAS, M., et al. ColloidalCapsules: Nano- and Microcapsules with Colloidal Particle Shells. [J].Chemical Society Reviews, 2017, 46, 2091-2126.]等离激元纳米囊泡的直径可以与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的激光束的直径相匹配。因此，利用这一特点，将等离激元纳米囊泡应用于MALDI-TOF MS的样品制备过程，高通量产生小尺寸样品点，这些样品点使得细菌样品具有非常高的表面密度，大大改善了离子化/解吸过程中的样品利用率，提高了MALDI-TOF MS检测细菌的灵敏度。

发明内容

为了进一步提高MALDI-TOF MS鉴定细菌的灵敏度，克服传统样品制备方法的不足，本发明的目的在于提供一种基于等离激元金纳米囊泡的超灵敏细菌鉴定方法。本发明方法能实现低拷贝数细菌的快速鉴定，其制备过程简单，高效，且检测灵敏度相较于传统MALDI-TOF MS方法大大提高。通过等离激元金纳米囊泡封装细菌，只有纳升级的样品用于分析，其余的可以通过离心作用回收用于其他实验，有效节省样品。

本发明的技术方案具体如下：

一种基于等离激元金纳米囊泡的超灵敏细菌鉴定方法，具体步骤如下：

（1）将细菌样品和基质溶液混合均匀；

（2）合成由全氟癸基硫醇修饰的金纳米粒子溶胶；

（3）将步骤（1）得到的和基质溶液混合均匀的细菌样品加到步骤（2）合成的溶胶中，振荡乳化，得到包封了细菌样品的等离激元金纳米囊泡，将单颗囊泡移出点至靶板，得到与激光光斑大小接近的样品点；

（4）采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）对步骤（3）得到的样品点进行分析，得到细菌质谱图；

（5）将步骤（4）得到的细菌质谱图与标准细菌质谱数据库进行比对，得出鉴定结果。

本发明中，步骤（2）中所述全氟癸基硫醇修饰的金纳米粒子（全氟癸基硫醇-金纳米粒子），其直径为25-35纳米，浓度为35皮摩尔每升。

本发明中，步骤（3）中所述等离激元金纳米囊泡的尺寸为20~500微米。

本发明中，步骤（1）中所述基质溶液由α-氰基-4-羟基肉桂酸、乙腈、三氟乙酸和去离子水组成的混合溶剂配制而成，其中：乙腈、三氟乙酸和去离子水的体积比为50:2.5:47.5；α-氰基-4-羟基肉桂酸为饱和溶液。

本发明中，步骤（1）中细菌样品与基质溶液采用涡旋混匀仪混合均匀。

本发明中，步骤（5）中所述标准细菌质谱数据库为Biotyper微生物数据库或VITEKMS数据库中任一种。

本发明中，采用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱技术检测时，其基质溶液由α-氰基-4-羟基肉桂酸和乙腈、三氟乙酸和去离子水组成的混合溶剂配制而成，乙腈、三氟乙酸和去离子水的体积比为50:2.5:47.5；α-氰基-4-羟基肉桂酸为饱和溶液。在将细菌样品封装于等离激元金纳米囊泡之前需要使用涡旋混匀仪将细菌悬液与基质溶液混匀。

和现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明方法具有较强的可操作性和实用性，本发明利用等离激元金纳米囊泡来封装低拷贝数细菌样品，并采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱技术对封装其中的细菌进行鉴定。经检验该方法的灵敏度可以低至40个细菌。

附图说明

图1：实验基本流程示意图。

图2：包封于等离激元金纳米囊泡中的4种不同致病菌的质谱图。

图3：4种致病菌的标准谱图（~10⁶个细菌/样品孔）。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实例对本发明作进一步的说明，但并不因此对本发明限制在所述的实例范围之内。

实施例１，提供一种基于等离激元金纳米囊泡和质谱技术的超灵敏细菌鉴定方法，包括以下步骤：

选择合适的构建单元用于等离激元金纳米囊泡的构建。以直径为30纳米的全氟癸基硫醇-金纳米材料为例，其合成方法在于：将200毫升0.25毫摩尔每升的氯金酸溶液在剧烈搅拌下加热至沸腾，随后加入2.6毫升1%柠檬酸三钠，再沸腾5分钟。获得的金纳米粒子溶液经过用大量乙醇进一步洗涤以除去残留的柠檬酸盐，然后再分散在乙醇中，得到终浓度为60微克/毫升的红色胶体金溶液。[FRENS G. Controlled Nucleation for the Regulationof the Particle Size in Monodispers Gold Suspensions. [J]. Nature PhysicalScience, 1973, 241: 20-22.]将100毫升上述胶体金溶液离心并重新分散在含有5毫摩尔每升全氟癸基硫醇的4毫升乙醇中。在25摄氏度下，持续搅拌20小时。然后，分别用乙醇和正己烷洗涤获得全氟癸基硫醇-金纳米粒子，并重新分散在4毫升电子氟化液（3M Novec^TM7500Engineered Fluid）中。

基质溶液的配制：称取10毫克的α-氰基-4-羟基肉桂酸加入到1 毫升50%的乙腈，2.5%三氟乙酸和47.5%去离子水（v/v）的混合溶液中。

MALDI-TOF MS质谱检测：仪器条件：线性正离子模式，离子加速电压20 kV，离子延迟提取时间150 ns，激光强度47%。

选取4株不同种的致病菌的菌悬液，由紫外分光光度计确定其浓度。操作如下：

洗涤：取1毫升细菌悬液，12,000 g，离心2分钟，弃上清。加1毫升去离子水洗涤2遍：12,000 g，离心2分钟，弃上清。将洗涤好的细菌沉淀重新悬浮在1毫升去离子水中。

稀释：用去离子水将细菌稀释到一定浓度用于封装。

细菌样品与基质的混合：取2微升细菌悬液和2微升基质溶液于涡旋混匀仪上涡旋10秒。

细菌样品的封装：取0.5微升细菌样品与基质的混合液加入300微升35皮摩尔每升的全氟癸基硫醇-金纳米粒子溶液中，振荡以产生等离激元金纳米囊泡。

点样：取单颗等离激元金纳米囊泡点于MALDI靶板，待干燥后进行质谱检测。

MALDI-TOF MS分析:质谱检测结果见图2。

对于质谱结果的解读：图中星标的峰是通过与纯细菌的标准质谱图（图3）进行比对，标记出的细菌特征峰。