阅读说明：本技术 一种磷脂快速检测方法 (Rapid detection method for phospholipid ) 是由 沈清 于 2019-11-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种磷脂快速检测方法,包括以下步骤,a、对水产品中的磷脂进行粗提取,得磷脂粗提液,即A品,b、合成TiO<Sub>2</Sub>微孔阵列芯片,得B品,c、将A品置于B品,静置,使磷脂与TiO2反应完全,得C品,d、在C品上滴加super-DHB和9-AA基质溶液的混合液,得D品,e、干燥D品,使D品上的磷脂结晶,得E品,f、E品采用基质辅助激光解吸检测,得检测图。本发明具有检测效率高、检测结果精准和不容易对人体造成危害的优点。(The invention discloses a method for rapidly detecting phospholipid, which comprises the following steps of a, carrying out coarse extraction on phospholipid in aquatic products to obtain a phospholipid coarse extract, namely a product A, and b, synthesizing TiO 2 And (2) placing the product A on the product B to obtain a product B, standing to ensure that the phospholipid completely reacts with TiO2 to obtain a product C, dropwise adding a mixed solution of super-DHB and 9-AA matrix solution on the product C to obtain a product D, drying the product D to crystallize the phospholipid on the product D to obtain a product E, and carrying out matrix-assisted laser desorption detection on the product f and the product E to obtain a detection image. The invention has the advantages of high detection efficiency, accurate detection result and difficult harm to human body.)

一种磷脂快速检测方法

技术领域

本发明属于水产品的磷脂检测方法领域，尤其涉及一种水产品的磷脂快速检测方法。

背景技术

通过对水产品脂质组学的研究，可深化对水产品及加工副产物的脂质营养学认识；并可建立脂质组学指纹图谱，为水产品鉴伪、溯源提供技术手段；还可以为预防、诊断、治疗水生动物疾病提供参考，为水环境调控与污染监测提供科学依据。

磷脂是水产品脂质组学的主要分析对象之一，磷脂的种类众多，根据磷脂极性基团不同，可将磷脂分为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等多个类别，而对水产品中各类别磷脂含量的检测是整个分析过程中必须可少的步骤。磷脂的整个检测过程包括对水产品中磷脂的提取和对提取物的检测。对提取物的检测可采用基质辅助激光解吸，从而得到检测图，检测图中每个波峰对应一种磷脂，根据每个波峰的面积计算出对应种类的磷脂浓度，可根据检测图进行后续的分析工作。对水产品中磷脂的提取可采用Bligh&Dyer法，Bligh&Dyer法虽然能提取到水产品中的大部分磷脂，但是提取速度慢、耗时长，导致整个检测过程的耗时长，检测效率低；而且在提取的同时容易混入杂质，会在基质辅助激光解吸时形成干扰，得到的检测图不准确，即检测结果不精准；并且由于在Bligh&Dyer法中大量使用了氯仿，氯仿遇光照会与空气中的氧作用，逐渐分解而生成剧毒的光气(碳酰氯)和氯化氢，容易对人体造成危害。

因此，现有的磷脂检测方法存在检测效率低、检测结果不精准和容易对人体造成危害的缺点。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种磷脂快速检测方法。本发明具有检测效率高、检测结果精准和不容易对人体造成危害的优点。

本发明的技术方案：一种磷脂快速检测方法，包括以下步骤，

a、对水产品中的磷脂进行粗提取，得磷脂粗提液，即A品，

b、合成TiO₂微孔阵列芯片，得B品，

c、将A品置于B品，静置，使磷脂与TiO2反应完全，得C品，

d、在C品上滴加super-DHB和9-AA基质溶液的混合液，得D品，

e、干燥D品，使D品上的磷脂结晶，得E品，

f、E品采用基质辅助激光解吸检测，得检测图。

前述的磷脂快速检测方法中，所述的步骤a，是采用Bligh&Dyer法对水产品中的磷脂进行粗提取，得磷脂粗提液，即A品。

前述的磷脂快速检测方法中，所述的步骤a，是采用改进后的Bligh&Dyer法对水产品中的磷脂进行粗提取，得磷脂粗提液，即A品；所述改进后的Bligh&Dyer法，包括以下步骤，

a1、取水产品的肌肉组织，得A1品，

a2、将A1品至于氯仿和甲醇的混合液中振荡混匀，得A2品，

a3、A2品超声冰浴提取5-15min，得A3品，

a4，A3品中加入纯水，振荡混匀，得A4品，

a5、用冷冻离心机对A4品进行离心，使A4品内溶液上下分层，得A5，

a6、取出A5品中的下层溶液，得A6品，

a7、在A6品中加入氯仿，得A7品，

a8、A7品冷冻离心机进行离心，使A7品内溶液上下分层，得A8品，

a9、取出A8品中的下层溶液，得A9品，

a10、在A6品中加入氯仿溶液，得A10品，

a11、A10品冷冻离心机进行离心，使A10品内溶液上下分层，得A11品，

a12、取出A11品中的下层溶液，

a13、将步骤a6中取出的下层溶液、步骤a9中取出的下层溶液和步骤a12中取出的下层溶液混合，得A13品，

a14、用氮气吹干A13品，得A14品，

a15、用甲醇水溶液溶解A14品，甲醇浓度90％，得磷脂粗提液，即A品。

前述的磷脂快速检测方法中，所述步骤a1中，所述水产品的肌肉组织经过均质处理；

所述的步骤a2中，按重量份计，是将1份的A1和1.75份混合液振荡混匀，混合液中氯仿和甲醇的比例1:2；

所述的步骤a3中，A2品采用探头式超声冰浴提取10min，超声功率25kHz、60％变幅；

所述的步骤a4中，所述纯水的加入量1.25份；

所述的步骤a5中，所述冷冻离心机的转速8000rpm，离心时间15min；

所述的步骤a6中，所述A5品中的下层溶液用移液枪取出；

所述的步骤a7中，所述氯仿的加入量为2份；

所述的步骤a8中，所述冷冻离心机的转速8000rpm，离心时间15min；

所述的步骤a9中，所述A8品中的下层溶液用移液枪取出；

所述的步骤a10中，所述氯仿的加入量2份；

所述的步骤a11中，所述冷冻离心机的转速8000rpm，离心时间15min；

所述的步骤a12中，所述A11品中的下层溶液用移液枪取出。

前述的磷脂快速检测方法中，所述TiO₂微孔阵列芯片的合成方法，包括以下步骤，

b1、将镀金盖玻片浸没于5-15mM的MPA溶液中静置超过5h，得B1品，

b2、用乙醇清洗B1品，得B2品，

b3、用去离子水清洗B2品，得B3品，

b4、用氮气吹干B3品，得B4品，

b5、向B4品表面喷PAH溶液，PAH溶液干燥后，喷TALH溶液，TALH溶液干燥后，B4表面形成一个复层单元，得B5品，

b6、在B5品表面形成再次形成复层单元，得B6品，

b7、B6品用去离子水润洗，得B7品，

b8、干燥B7品，得B8品，

b9、B8品450-550℃下老化4-6h，得TiO₂盖玻板，即B9品，

b10、B9品浸没于5-15mM的OTS甲苯溶液，使其表面合成一层输水层，得B10品，

b11、干燥B10品，得B11品，

b12、B11品置于热蒸汽中熏蒸0.5-1.5min，得B12品，

b13、在B12品表面盖上具有阵列微孔的模具，紫外光下照射0.8-1.2h，得B13品，

b14、先后用乙醇和0.4-0.6mM的氢氧化钠溶液润洗B13品的阵列点，得B14品，

b15、去离子水清洗B14品，得TiO₂微孔阵列芯片的成品，即B品。

前述的磷脂快速检测方法中，所述步骤b1中，所述MPA溶液为10mM；

所述步骤b5中，所述PAH溶液1mg/mL、pH 7.5，所述TALH溶液5wt％、pH 7.5；

所述步骤b6中，在B5品表面形成再次形成的复层单元数量为1-19个；

所述步骤b9中，所述B8品是在马弗炉中老化，炉温500℃，老化时间4小时；

所述步骤b10中，所述OTS甲苯溶液的浓度10mM；

所述步骤b12中，所述B11品的熏蒸时间1min；

所述步骤b13中，所述紫外光的照射时间1h，所述紫外光波长254nm；

所述步骤b14中，所述氢氧化钠溶液的浓度0.5mM。

前述的磷脂快速检测方法中，所述步骤c，是用移液枪分多次将A品转移到B品上，每次转移10μL，静置，使磷脂与TiO₂反应完全，得C品。

前述的磷脂快速检测方法中，所述步骤d，包括以下步骤，

d1、用2％的TFA溶液对C品进行润洗，得D1品，

d2、用含2％TFA和40％甲醇的溶液对D1品进行润洗，得D2品，

d3、D2品上滴加super-DHB和9-AA基质溶液的混合液，super-DHB和9-AA基质溶液的比例为1:2、1:1或2:1，得D品。

前述的磷脂快速检测方法中，所述步骤d，是先在C品上滴加1％的磷酸溶液，再滴加super-DHB和9-AA基质溶液的混合液，super-DHB和9-AA基质溶液的比例为1:2、1:1或2:1，得D品。

与现有技术相比，本发明主要是改进了磷脂的提取方法，先利用改进过的Bligh&Dyer法对水产品中的磷脂进行粗提取，增加了离心分离步骤并添加了甲醇，分三次提取磷脂并分次添加氯仿，从而提高了提取效率，并可减少了氯仿的用量，从而使检测不容易对人体造成危害；再制作TiO₂微孔阵列芯片，TiO₂对磷脂通过双齿桥联螯合具有选择性吸附作用，从而可将磷脂粗提液中的磷脂富集到TiO₂微孔阵列芯片的阵列点上，富集的磷脂纯度高、杂质含量低，可提升检测结果的精准度，且富集速度快，富集时间可在5分钟内完成，从而减少整个检测过程的耗时，提高检测效率。此外，根据本发明TiO₂微孔阵列芯片的合成方法得到的TiO₂微孔阵列芯片，具有阵列密度大的优点，可减少芯片尺寸；且可使TiO₂的生长形态和厚度易于控制，用于基质辅助激光解吸的结果重现性好，即同样有助于检测结果精准度的提高；技术较为简单，不需要昂贵的设备，便于推广和普及。

因此，本发明具有检测效率高、检测结果精准和不容易对人体造成危害的优点。

附图说明

图1是本发明得到的检测图。

图2是按现有技术得到的检测图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例1。一种磷脂快速检测方法，包括以下步骤，

a、对水产品中的磷脂进行粗提取，得磷脂粗提液，即A品，

b、合成TiO₂微孔阵列芯片，得B品，

c、用移液枪分多次将A品转移到B品上，每次转移10μL，静置，使磷脂与TiO₂反应完全，得C品，

d、在C品上滴加super-DHB和9-AA基质溶液的混合液，得D品，

e、干燥D品，使D品上的磷脂结晶，得E品，

f、E品采用现有的基质辅助激光解吸检测，得检测图。

所述基质辅助激光解吸是一种用于质谱的软的离子化的技术，可以得到用常规离子化方法容易解离而得到分子碎片的一些大分子的质谱信息，比如生物分子类的DNA，生物高分子、蛋白质、多肽和糖，以及其他大分子量的有机分子，如高分子、树状分子和其他大分子，在这方面类似于同样是软离子化方法的电喷雾离子法，不过更容易得单电荷的离子峰。

所述的步骤a，是采用改进后的Bligh&Dyer法对水产品中的磷脂进行粗提取，得磷脂粗提液，即A品；所述改进后的Bligh&Dyer法，包括以下步骤，

a1、取水产品的肌肉组织，均质，得A1品，

a2、按重量份计，将1份的A1和1.75份混合液振荡混匀，混合液中氯仿和甲醇的比例1:2，得A2品，

a3、A2品采用探头式超声冰浴提取10min，超声功率25kHz、60％变幅，得A3品，

a4，A3品中加入1.25份纯水，振荡混匀，得A4品，

a5、用冷冻离心机对A4品进行离心，冷冻离心机的转速8000rpm，离心时间15min，使A4品内溶液上下分层，得A5，

a6、用移液枪取出A5品中的下层溶液，得A6品，

a7、在A6品中加入2份氯仿，得A7品，

a8、A7品冷冻离心机进行离心，冷冻离心机的转速8000rpm，离心时间15min，使A7品内溶液上下分层，得A8品，

a9、移液枪取出A8品中的下层溶液，得A9品，

a10、在A6品中加入2份氯仿溶液，得A10品，

a11、A10品冷冻离心机进行离心，冷冻离心机的转速8000rpm，离心时间15min，使A10品内溶液上下分层，得A11品，

a12、用移液枪取出A11品中的下层溶液，

a13、将步骤a6中取出的下层溶液、步骤a9中取出的下层溶液和步骤a12中取出的下层溶液混合，得A13品，

a14、用氮气吹干A13品，得A14品，

a15、用甲醇水溶液溶解A14品，甲醇浓度90％，得磷脂粗提液，即A品。

所述TiO₂微孔阵列芯片的合成方法，包括以下步骤，

b1、将尺寸76×26mm的镀金盖玻片浸没于10mM的MPA溶液中静置8h，得B1品，

b2、用乙醇清洗B1品，得B2品，

b3、用去离子水清洗B2品，得B3品，

b4、用氮气吹干B3品，得B4品，

b5、向B4品表面喷PAH溶液，PAH溶液干燥后，喷TALH溶液，TALH溶液干燥后，B4表面形成一个复层单元，所述PAH溶液1mg/mL、pH 7.5，所述TALH溶液5wt％、pH 7.5，得B5品，

b6、在B5品表面形成再次形成复层单元，再次形成的复层单元数量为10个，得B6品，

b7、B6品用去离子水润洗，得B7品，

b8、干燥B7品，得B8品，

b9、B8品在马弗炉中老化老化4-6h，炉温500℃下，得TiO₂盖玻板，即B9品，通过扫描电镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)可观察到B9品表面微孔以及TiO₂颗粒的形态与大小，

b10、将B9品浸没于10mM的OTS甲苯溶液，使其表面合成一层输水层，得B10品，

b11、干燥B10品，得B11品，

b12、B11品置于热蒸汽中熏蒸1min，利用少量水分子加速OTS水解过程，得B12品，

b13、在B12品表面盖上具有阵列微孔的模具，紫外光下照射1h，所述紫外光波长254nm，使得OTS配体充分光催化裂解，在对应阵列微孔处形成TiO₂，得B13品，

b14、先后用乙醇和0.5mM的氢氧化钠溶液润洗B13品的阵列点，使阵列点处的TiO₂暴露出来，得B14品，

b15、去离子水清洗B14品，得TiO₂微孔阵列芯片的成品，即B品

所述的步骤d，包括以下步骤，

d1、用2％的TFA溶液对C品进行润洗，得D1品，

d2、用含2％TFA和40％甲醇的溶液对D1品进行润洗，得D2品，

d3、D2品上滴加super-DHB和9-AA基质溶液的混合液，super-DHB和9-AA基质溶液的比例为1:1，得D品。

实施例2。与实施例1不同之处在于：所述步骤a3中，所述超声冰浴提取的时间为5min；所述步骤b1中，所述镀金盖玻片浸没于10mM的MPA溶液中静置的时间为10h；所述步骤b9中，所述B8品在马弗炉中老化老化4h，炉温550℃；所述步骤b10中，所述OTS甲苯溶液为5mM；所述步骤b12中，所述B11品置于热蒸汽中熏蒸1.5min；所述步骤b14中，所述氢氧化钠溶液0.4mM；所述步骤d3中，所述super-DHB和9-AA基质溶液的比例为2:1。

实施例3。与实施例1不同之处在于：所述步骤a3中，所述超声冰浴提取的时间为15min；所述步骤b1中，所述镀金盖玻片浸没于10mM的MPA溶液中静置的时间为5h；所述步骤b9中，所述B8品在马弗炉中老化老化6h，炉温450℃；所述步骤b10中，所述OTS甲苯溶液为15mM；所述步骤b12中，所述B11品置于热蒸汽中熏蒸0.5min；所述步骤b14中，所述氢氧化钠溶液0.6mM；所述步骤d3中，所述super-DHB和9-AA基质溶液的比例为1:2。

实施例4。与实施例1不同之处在于，所述步骤d，是先在C品上滴加1％的磷酸溶液，再滴加super-DHB和9-AA基质溶液的混合液，super-DHB和9-AA基质溶液的比例为1:2、1:1或2:1，得D品。

实施例5。与实施例1不同之处在于，所述步骤f，是将E品嵌入MALDI点样板后采用现有的基质辅助激光解吸检测。基质辅助激光解吸采用4800MALDI-TOF质谱仪(美国ABSciex公司)，配以200Hz三倍频Nd:YAG激光脉冲源，波长为355nm。正离子和负离子检测均采用20kV加速电势的反射模式。离子采集范围为450-1000m/z，采集时间延迟450ns。激光能量在建议放射阈值的基础上增加5-10％，以获得更好的同位素质量分辨率。质谱数据采集使用4000Series Explorer v3.5.2(美国AB Sciex公司)，所有谱图均经同位素校正，确保微量磷脂的离子峰不受其他高浓度磷脂离子峰干扰，从而提高精度。

实施例1、实施例2和实施例3的步骤d中，均包含有d1和d2两次润洗的步骤，以去除不含磷酸集团的杂质，减少杂质在步骤f中对磷脂的信号干扰，提升检测的精准度；实施例4的在步骤d中滴加了磷酸溶液，可有效从TiO₂上释放磷脂分子，增强磷脂信号强度，从而提升提升检测的精准度，因此可省去两次润洗的步骤，从而进一步降低整个检测过程的耗时长度。

作为与现有技术的对比验证。实施例1至实施例5得到的检测图如图1所示，相互之间存在一定差异但是并不非常大，可检测到的磷脂分子种类明显要比图2的要多，且信号强度有所提高，对于检测结果精准度的提升幅度较大。

作为对本发明在检测结果精准度方面的方法验证，以精密度、灵敏度和回收率作为评价指标。其中，精密度分日内精密度和日间精密度，日内精密度是指同一天内不同时间对同一被测物进行次平行测定时，各个结果间的接近程度，日间精密度指在不同天内对同一被测物进行重复测量所得结果间的一致程度；其中，灵敏度的指标包括LOD和LOQ，LOD和LOQ分别为检测样品的最低检出限和定量浓度。验证对象为磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，分别配置多种浓度的磷脂酰胆碱溶液和磷脂酰乙醇胺溶液分别单独进行检测，得表格1的检测结果：

表格1

从表格1中，可看出本发明的检测结果精准度高。