具体实施方式

1、肌萎缩侧索硬化症

肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis：ALS)是运动神经选择性受损的进行性神经退行性疾病。ALS大致分为家族性ALS和散发性ALS，多数为散发性(95％)。ALS是进行性的，患病后症状不会减轻，全身的肌肉逐渐无法运动，最终由于呼吸衰竭导致死亡。目前，ALS的发病病因不明，不存在根治性方法。

最近，血脑屏障(BBB)和血脊髓屏障(BSCB)的破坏所引起的神经损害作为ALS的原因之一受到关注。已知MSC分泌各种神经营养因子，本申请发明人确认了静脉内施予MSC使得患病部位的GDNF表达升高。并且确认了MSC的静脉内施予使得作为GDNF家族之一的神经秩蛋白(Neurturin)(Nrtn)的表达在患处增加(见下文实施例)。

2、间充质干细胞

本发明的医药组合物中使用的所谓“间充质干细胞”，是在间充质组织的间质细胞中微量地存在的具有多分化能力及自我复制能力的干细胞，已知其不仅分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等结缔组织细胞，还具有分化为神经细胞、心肌细胞的分化能力。

作为间充质干细胞的来源，可以是由ES细胞、诱导性多能干细胞(iPS细胞)分化诱导出的细胞，也可以是经株系化的细胞，还可以是从生物体分离·增殖而得到的细胞。为生物体的情况下，可举出骨髓、末梢血、脐带血、胎儿胚胎、脑等，但优选来源于骨髓或血液的间充质干细胞，特别优选骨髓间充质干细胞，其中优选人骨髓间充质干细胞。来源于骨髓的间充质干细胞具有以下优点：1)可以期待显著的效果，2)副作用的危险性低，3)可以期待充分的供体细胞的供给，4)是非侵入性的治疗，可进行自体移植，因此，5)传染病的风险低，6)不用担心免疫排斥反应，7)没有伦理问题，8)易于被社会接受，9)作为普通医疗而易于广泛定植；等等。此外，骨髓移植疗法是已经在临床现场使用的治疗，安全性也得到确认。另外，来源于骨髓的干细胞的迁移性高，除了向局部移植以外，还可通过静脉内施予到达目标损伤组织，可以期待治疗效果。

细胞可以来源于异体细胞也可以来源于自体细胞，优选来源于自体细胞(来源于患者自身的细胞)的间充质干细胞。

本发明中使用的间充质干细胞优选处于未分化的状态。这是因为未分化的状态下细胞增殖率及导入生物体内后的存活率高。未分化可以通过例如作为分化标志物的CD24阴性来进行确认。本申请的发明人还开发了取得这样的细胞的方法，其详细内容记载于WO2009/002503号。

本申请的发明人开发出的前述方法中，使用包含同种血清(优选自体血清；在人用医药组合物中为人血清)、且不含或者以极低浓度包含抗凝剂(肝素等)的培养基使在实质上不与抗凝剂(肝素等)接触的条件下从骨髓液等中分离出的细胞进行增殖。所谓“不含或者以极低浓度包含抗凝剂”，是指不含作为抗凝剂的有效量的抗凝剂。具体地，例如如果为肝素、其诱导体，则通常作为抗凝剂的有效量为约20～40μ/mL左右，在发明人开发出的方法中，通过将预先添加到用于试样采集的采血管中的量设为最小限度，从而从生物体采集的试样中的量变为小于5U/mL，优选小于2U/mL，进一步优选小于0.2U/mL，在培养细胞时培养基中存在的量相对于培养基的容积而言，变为小于0.5U/mL，优选小于0.2U/mL，进一步优选小于0.02U/mL(参见WO2009/034708号)。

培养基中的细胞密度对细胞的性质及分化的方向性产生影响。在间充质干细胞的情况下，如果培养基中的细胞密度大于8,500个/cm²，细胞的性质将会发生变化，因此优选以至多8,500个/cm²以下的方式进行传代培养，更优选在达到5,500个/cm²以上的时间点进行传代培养。

本申请的发明人开发出的前述方法中，由于使用含有人血清含有培养基，考虑到血清供体的负担，优选尽可能减少培养基更换的次数，例如，至少每周进行1次、更优选每周进行1～2次培养基更换。

就培养而言，重复进行传代培养直到细胞的总数成为10⁸个以上。需要的细胞数量可以根据使用目的而变化，认为用于治疗例如脑梗塞等缺血性脑疾病的移植所需的间充质干细胞的数量为10⁷个以上，本发明中为10⁶个以上。根据本申请的发明人开发的方法，12天左右可以得到10⁷个间充质干细胞。

根据需要，可以通过冷冻保存等方法(例如，在-152℃的深冻冰箱中)保存增殖后的间充质干细胞直至使用。冷冻保存中，使用包含血清(优选人血清，更优选自体血清)、葡聚糖、DMSO的培养基(RPMI等哺乳动物细胞用的培养基)作为冷冻保存液。例如，可以在包含进行了通常的过滤灭菌的RPMI 20.5mL和从患者处采集的自体血清20.5mL、葡聚糖5mL、DMSO 5mL的冷冻保存液中将细胞悬浮，并于-150℃进行冷冻保存。例如，作为DMSO，可以使用NIPRO株式会社制的Cryoserv，葡聚糖可以使用大塚制药制的低分子葡聚糖L注射液(LOWMOLECULAR DEXTRAN L INJECTION)，但不限于这些。

如上所述制备的间充质干细胞可以a)向包含间充质干细胞的培养物中添加细胞因子，确认间充质干细胞表达CX3CL1；或者b)确认间充质干细胞表达EGFR及/或ITGA4，由此来确认该间充质干细胞的品质·功能。

作为所使用的“炎性细胞因子”，可举出TNF-α、INFγ、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18，其中优选包含TNF-α、INFγ、和IL-6，更优选使用TNF-α、INFγ、和IL-6的混合物。

前述方法还可以进一步包括：确认(未添加细胞因子的)培养物中的选自BDNF、VEGF、及HGF中任一者以上的存在的步骤。特别地，确认BDNF及/或VEGF的存在是重要的，最重要的是确认BDNF的存在。

如果通过添加炎性细胞因子而使间充质干细胞表达CX3CL1，则可以期待该间充质干细胞的炎症调节作用(免疫调节作用)优异，如果间充质干细胞的90％以上表达EGFR及/或ITGA4，则可以期待该间充质干细胞向损伤部位的蓄积能力优异。另外，如果在培养基中存在BDNF、VEGF、及HGF等营养因子中的任一者，则可以期待包含神经保护作用高的间充质干细胞，其中BDNF及/或VEGF的存在、特别是BDNF的存在可以是神经保护作用高的MSC的重要指标。间充质干细胞即使未刺激也会分泌BDNF、VEGF及/或HGF，但分泌能力的确认可以评价来自未刺激的细胞的分泌，也可以评价来自炎性细胞因子刺激后的细胞的分泌。

就上述CX3CL1、EGFR、ITGA4、BDNF、VEGF、HGF的表达而言，与基因水平相比，优选将蛋白质水平的表达设为指标，为EGFR、ITGA4等细胞表面蛋白质的情况下，从简便性和灵敏性的观点考虑，优选使用流式细胞术(FCM)进行测定，为CX3CL1、BDNF、VEGF、HGF等分泌蛋白的情况下，从简便性和灵敏性的观点考虑，优选使用微珠测定法。

3、本发明的医药组合物

本发明的医药组合物为用于治疗ALS的医药组合物，其特征在于，含有间充质干细胞，并被静脉内施予。

本发明的医药组合物中含有的间充质干细胞的细胞数量越多越优选，考虑到针对患者的施予时间、培养所需要的时间，显示出效果的最小量是实用的。因此，在本发明的医药组合物的优选方式中，1次施予中含有的间充质干细胞的细胞数量为10⁶个以上，优选为5×10⁶个以上，更优选为10⁷个以上，更优选为5×10⁷个以上，更优选为10⁸个以上，进一步优选为5×10⁸个以上。

本发明的医药组合物为静脉内施予制剂。静脉内施予制剂为水性或非水性的等渗性无菌溶液或悬浮液的形态，例如，可与药理学上允许的载体或者介质等适当组合，制剂化为合适的单元施予形态，具体而言有灭菌水、生理盐水、培养基(尤其是RPMI等用于培养哺乳动物细胞的培养基)、PBS等生理缓冲液、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘结剂等。

作为注射用的水溶液，例如可举出生理盐水、培养基、PBS等生理缓冲液、包含葡萄糖、其他助剂的等渗液，例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠等，还可与适当的助溶剂、例如醇(具体而言，乙醇、多元醇、丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂(例如聚山梨醇酯80、HCO-50等)并用。

就作为本发明的医药组合物的施予对象的ALS而言，不限于家族性或散发性，对轻症或重症也没有限定。在轻症ALS的情况下，通过施予本发明的医药组合物可以期待症状的改善和抑制发展，在中等程度至重症ALS的情况下，可以期待抑制发展。

对于本发明的医药组合物的施予次数、施予间隔而言，没有特殊限定。例如，2次以上、3次以上、4次以上、5次以上，只要能够预期治疗效果即可，可以多次重复施予。首次施予后，可以在每次症状发展时进行施予，也可以定期地进行施予。因此，根据症状，施予间隔可以是1个月至十几年，例如，1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、1年、2年、3年～十几年。通过重复施予，可以将症状保持在良好的状态，延长存活时间。

本发明的医药组合物可以与已知的ALS治疗药、例如利鲁唑(riluzole)、依达拉奉、青霉素、β内酰胺类抗生素等联用。

本发明的医药组合物能够在抑制BBB/BSCB的破坏的同时促进神经营养因子的表达，抑制神经损害。对于本发明的医药组合物而言，无论症状的发展程度如何，均能够抑制运动功能降低，延长存活时间。

实施例

以下，通过实施例具体地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

参考例1：来源于大鼠骨髓的间充质干细胞的制备

以下实施例中使用的MSC是根据以往报道通过以下步骤制备的。

实验按照札幌医科大学的动物实验管理规定来实施。根据以往报道，将从成熟SD大鼠的大腿骨得到的骨髓用杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM)稀释成25ml，添加经过加热灭活的10％FBS、2mM的l-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素，在5％CO₂气氛下于37℃孵育3天(Kim S.等,Brain Res.2006；1123:27-33.Ukai R.等,J.Neurotrauma.2007；24:508-520.)。培养直至汇合状态(confluent)，用胰蛋白酶-EDTA将黏附细胞剥离，以1x10⁴个细胞/ml的密度传代培养3次，得到间充质干细胞(MSC)。

实施例1：ALS模型大鼠的自然病程

1、行为评价

方法

ALS模型大鼠(SOD1大鼠(SD Tg(SOD1G93A)L26H))自Taconic Biosciences购得，实施行为评价。已知SOD1大鼠具有SOD1基因突变(SOD1G93A)，非常好地重现了人ALS的病况。

(https://www.taconic.com/rat-model/sod1-rat)。

结果

发病表现为尾部下垂、或后肢异常步态，迅速(约10天)发展至后肢瘫痪。中等程度(中度阶段：BBB分数15～11)的情况下，大鼠典型地在单一后肢显示出最早的瘫痪。重度(重度阶段：BBB分数10～8)的情况下，虽然双腿瘫痪，但能使用前肢走动。在末期(末期阶段)，大鼠不再具有翻正反射(图1)。

2、组织学评价

方法

为了在组织学上评价ALS模型大鼠的自然病程，将作为后肢运动功能评价指标的BBB分数为21分、11分、0分的大鼠的脊髓通过Kluver-Barrera染色(以下为KB染色)而对神经细胞和髓鞘进行染色，观察运动神经细胞数量的变化。BBB评分是将大鼠放入旷场使其自由活动5分钟、对后肢的运动功能进行评价的方法(正常为21分，分数随症状恶化而下降，为11分时步行困难，0分最差，无法步行)。

对ALS模型大鼠用麻醉药(氯胺酮100mg/kg、甲苯噻嗪20mg/kg)施以深度麻醉，用含有PBS和4％多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液(4％PFA)实施灌流固定。将脊髓取出，分切成C1、T6、L4区，在4％PFA中固定过夜。固定后进行石蜡包埋，切出10μm厚的切片贴附于载玻片上。然后，实施KB染色，用荧光显微镜(KEYENCE BZ9000)进行拍照。

结果

图2中示出了染色图像。随着从正常(Normal，BBB分数为21)发展为中度(Moderate，BBB分数为11)症状，颈髓(C1)、胸髓(T6)、腰髓(L4)中，运动神经细胞(700μm²以上的大细胞)的数量均变少。并且，虽然在成为末期症状(BBB分数为0)的大鼠的颈髓、胸髓中确认到了神经细胞残留，但腰髓中神经细胞几乎完全消失。

实施例2：ALS模型大鼠中的MSC静脉施予的效果(研究1：中度阶段)

1、行为评价

方法

将BBB分数降低至15分的ALS模型大鼠分为MSC施予组(n＝6)和媒介物施予组(n＝13)这2个组，MSC施予组中，从大腿静脉经静脉施予使MSC(1.0×10⁶个)溶解于1mL媒介物(新鲜的DMEM)而得的溶液。媒介物施予组中，经静脉施予1mL的DMEM。从施予MSC和媒介物的前一天开始至末期阶段为止，针对所有大鼠每天腹腔内施予作为免疫抑制剂的环孢菌素A(10mg/kg)。

使用BBB分数进行行为评价，每周2次以上，将大鼠放入旷场使其自由活动5分钟，对后肢的运动功能进行评价。评价者并不清楚大鼠属于哪个治疗组。

结果

BBB分数的降低在MSC施予组中得到了显著抑制(图3(A))。尤其是在施予第3天的评价中，MSC施予组中观察到了症状的改善。示出了BBB分数的变化量。MSC施予组中，BBB分数的变化量小于媒介物施予组(图3(B))。

2、存活时间

方法

针对实施了行为评价的大鼠，使用Kaplan-Meier曲线评价施予MSC或媒介物后40天的存活率。

结果

40天后，媒介物施予组中半数以上死亡，而MSC施予组中80％以上得以存活(图4)。

3、脊髓运动神经细胞数量

方法

将BBB分数降低至15分的ALS模型大鼠分为MSC施予组(n＝3)和媒介物施予组(n＝6)这2个组，与上述同样地施予MSC或媒介物，在施予后第14天就脊髓(腰髓)前角运动神经细胞进行比较。从施予MSC和媒介物的前一天开始至施予14天后的最终评价日为止，针对所有大鼠每天腹腔内施予作为免疫抑制剂的环孢菌素A(10mg/kg)。运动神经细胞的定义为面积为700μm²以上的细胞。

结果

较之媒介物施予组而言，MSC施予组中，明显更多的运动神经细胞得以保留(图5)。

4、血脑屏障/血脑脊髓屏障(BBB/BSCB)的破坏

方法

将BBB分数降低至15分的ALS模型大鼠分为MSC施予组(n＝4)和媒介物施予组(n＝4)这2个组，与上述同样地施予MSC或媒介物，在施予后第14天，为了对血脑屏障/血脑脊髓屏障(BBB/BSCB)的破坏进行评价，向各大鼠从尾静脉施予4％伊文思蓝(EvB，Sigma，4ml/kg)。1小时后，用麻醉药(氯胺酮100mg/kg、甲苯噻嗪20mg/kg)施以深度麻醉，用PBS和4％PFA进行灌流固定。将脑和脊髓取出后，分成脑、脑干(延髓)、颈髓、腰髓这4个部位，分别用OCT化合物包埋，并将其冷冻于冷却至-80℃的丙酮中。使用Cryostat以100μm间隔切出9片20μm的切片，贴附于载玻片上。使用DAPI进行对比染色，使用VECTASHIELD(VectorLaboratories)加盖盖玻片。切片使用共聚焦显微镜进行观察，使用Image J软件(NIH)测定漏出至血管外的伊文思蓝的面积。Ex/Em(405nm用于DAPI，488nm用于FITC-凝集素，561nm用于EvB；LSM780 ELYRA S.1system，Zeiss)。

结果

在脑皮质、脑干(延髓)、颈髓、腰髓中，均确认到MSC施予组中伊文思蓝的漏出显著减少，从而确认了BBB/BSCB的破坏得到抑制或修复(图7)。

5.Nrtn的表达分析(定量RT-PCR)

方法

将BBB分数降低至15分的ALS模型大鼠分为MSC施予组(n＝4)和媒介物施予组(n＝4)这2个组，与上述同样地施予MSC或媒介物，24小时后，用麻醉药施以深度麻醉，然后取出脊髓(腰髓)，使用RNeasy Plus mini kit(QIAGEN，Venlo，The Netherlands)提取RNA。RNA的品质使用Bioanalyzer RNA 6000nano kit(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)对RIN number进行确认，仅使用RIN>8.0的样本。定量通过qRT-PCR法进行，使用TaqMan(注册商标)Universal Master Mix II with Uracil-N glycosylase(UNG)和TaqMan(注册商标)Gene Expression assays(Gapdh，Rn01775763＿g1；Nrtn)、PRISM7500with7500software v2.3(Thermo Fisher Scientific Inc.)。使用ΔΔCt法，以Gapdh作为内参对照，比较MSC施予组相对于媒介物施予组的基因表达比(n＝4)。热循环仪的方案如下所述。

50℃2分钟、95℃10分钟后，将95℃15秒、60℃1分钟实施40个循环。

结果

MSC施予组中，Nrtn的表达量显著升高(图7)。Nrtn为GDNF家族的一员，确认到其mRNA表达在MSC施予组中显著增加。由这一结果可以认为，通过MSC移植，发挥了针对脊髓前角的运动神经细胞的神经营养作用，在组织学方面，残留神经细胞数量变多，从而起到了对于神经症状的治疗效果。

实施例3：ALS模型大鼠中的MSC静脉施予的效果(研究2：重度阶段)

方法

将BBB分数降低至11分的、呈现出重度运动功能损害的ALS模型大鼠分为2个组，MSC施予组(n＝6)中，使MSC(1.0×10⁶个)溶解于1mL媒介物(新鲜的DMEM)，从大腿静脉经静脉施予。媒介物施予组(n＝7)中，经静脉施予1mL媒介物(新鲜的DMEM)，评价运动功能和存活时间。从施予MSC和媒介物的前一天开始至末期阶段为止，针对所有大鼠每天腹腔内施予作为免疫抑制剂的环孢菌素A(10mg/kg)。

结果

对于运动功能的降低而言，较之媒介物施予组(n＝7)，其在MSC施予组(n＝6)中得到显著抑制(图8)，存活时间也得到显著延长(图9)。

实施例4：ALS模型大鼠中的MSC多次施予的效果

1.行为评价

方法

针对BBB分数降低至15分的、呈现出中等程度的运动功能损害的ALS模型大鼠，将MSC(1.0×10⁶个)按每隔1周1次的方式多次进行静脉内施予。基于BBB分数评价多次施予组(n＝9)的运动功能，与单次施予组(n＝5)和媒介物施予组(n＝6)进行比较。从施予MSC和媒介物的前一天开始至最终评价日为止，针对所有大鼠每天腹腔内施予作为免疫抑制剂的环孢菌素A(10mg/kg)。

结果

MSC的多次施予组中，不仅在第1次施予中，在第2次施予中也可见运动功能的改善(图10)。施予第7天、第14天均较之媒介物施予组而言显著地抑制了运动功能。

2.长期运动功能

方法

将MSC多次施予组(n＝7)的长期运动功能的变化与MSC单次施予组(n＝6)和媒介物施予组(n＝13)进行比较。从施予MSC和媒介物的前一天开始至末期阶段为止，针对所有大鼠每天腹腔内施予作为免疫抑制剂的环孢菌素A(10mg/kg)。

结果

较之单次施予组、媒介物施予组而言，多次施予组中可以维持长期运动功能(图11)。

3.存活时间

方法

将MSC多次施予组(n＝7)的存活时间与MSC单次施予组(n＝6)和媒介物施予组(n＝13)进行比较。

结果

多次施予组中，存活时间较之单次施予组、媒介物施予组而言得到显著延长(图12)。

实施例5：ALS模型大鼠中的由MSC施予量造成的效果差异

方法

将MSC施予量分为低剂量组(1.0×10⁵个，n＝3)、常规剂量(1.0×10⁶个，n＝4)、高剂量(1.0×10⁷个，n＝3)这3个组，经静脉内施予至BBB分数降低至15分的ALS模型大鼠，将BBB分数的变化量与媒介物施予组(n＝6)进行比较。

从施予MSC和媒介物的前一天开始至最终评价日为止，针对所有大鼠每天腹腔内施予作为免疫抑制剂的环孢菌素A(10mg/kg)。

结果

常规剂量施予组和高剂量施予组中，运动功能降低得到显著抑制(图13)。

实施例6：ALS模型大鼠中的由MSC施予方法造成的效果差异

方法

将MSC的施予方法分为静脉内施予(n＝3)和髓腔内施予(n＝3)这2个组，就后肢运动功能的变化与媒介物髓腔内施予组(n＝3)进行比较。静脉内施予组将从大腿静脉施予溶解于1mL的DMEM的MSC 1.0×10⁶个，髓腔内施予组使用汉密尔顿注射器(HAMILTON)将1.0×10⁵个MSC施予至枕大池(cisterna magna)内。从施予MSC和媒介物的前一天开始至最终评价日为止，针对所有大鼠每天腹腔内施予作为免疫抑制剂的环孢菌素A(10mg/kg)。

结果

施予第14天的评价中，静脉内施予组中运动功能降低得到了显著抑制。此外，于施予第3天在静脉内施予组中确认到症状的改善(图14)。

产业上的可利用性

本发明的医药组合物在防止BBB/BSCB的破坏的同时，促进神经营养因子的分泌，抑制神经损害，从而能够阻遏ALS的发展，延长存活时间。根据本发明，使迄今为止缺乏有效治疗手段的ALS的治疗成为可能。

在本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请均作为参考而原样并入本说明书中。