阅读说明：本技术 一种杂交瘤细胞株、抗旋毛虫新生幼虫期丝氨酸蛋白酶的单克隆抗体及应用 (hybridoma cell strains, monoclonal antibody of trichina-resistant serine protease in new larva stage and application ) 是由 刘明远 刘晓雷 杨勇 P·布瓦罗 I·瓦利 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：一种杂交瘤细胞株、抗旋毛虫新生幼虫期丝氨酸蛋白酶的单克隆抗体及应用,属于旋毛虫(T.spiralis)的防治领域。针对如何对旋毛虫病进行特异性诊断的技术问题,本发明提供了一种杂交瘤细胞株,其保藏编号为CGMCC No.18319以及由上述杂交瘤细胞株所分泌单克隆抗体。所述单克隆抗体能够特异性的识别ASKEDS氨基酸基序。本发明建立旋毛虫(T.spiralis)血清学诊断方法奠定了基础。(hybridoma cell strains, monoclonal antibodies of trichina-resistant serine protease in the new larva period and application, belong to the field of prevention and treatment of trichina (T.spiralis), aiming at the technical problem of how to carry out specificity diagnosis on trichina, the invention provides hybridoma cell strains, the preservation number of which is CGMCC No.18319, and the monoclonal antibodies secreted by the hybridoma cell strains.)

一种杂交瘤细胞株、抗旋毛虫新生幼虫期丝氨酸蛋白酶的单 克隆抗体及应用

技术领域

本发明属于旋毛虫(T.spiralis)的防治领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株、抗旋毛虫新生幼虫期丝氨酸蛋白酶的单克隆抗体及应用。

背景技术

旋毛虫病主要是由于宿主生食或半生食含有旋毛虫的肉类而引发。人旋毛虫病潜伏期平均为2周，急性期患者的主要症状为发烧、肌肉剧烈疼痛、严重的腹泻、面部水肿以及嗜酸性粒细胞增多等，症状可以持续数周并导致机体衰竭，尤其重度感染者可出现心肌及大脑严重损伤，甚至死亡。

鉴于旋毛虫对公共卫生安全和人类健康造成的极大威胁与危害，世界动物卫生组织(OIE)将旋毛虫病列为屠宰动物强制性检验及首检必检病种。在我国，旋毛虫病一直被列为重中之重，更是除烈性***共患病之外可引起突发性公共卫生事件的典型病种之一。目前旋毛虫检测仍然采用相对费时费力，而且灵敏性低的镜检法(3条幼虫/g肉)和集样消化法(1条幼虫/g肉)进行旋毛虫检测。

国内外学者对旋毛虫检测的方法进行了大量的研究，如间接荧光免疫试验，免疫酶染色试验，免疫印迹试验，免疫吸附试验(ELISA)等，酶联免疫吸附试验(ELISA)是进行旋毛虫感染检测的最常用的免疫学方法，其具有高的敏感性，能检测底限可低至每100g肌肉组织中1条幼虫。目前，旋毛虫肌幼虫***分泌物ES抗原是OIE及国际旋毛虫委员会规定的唯一的用于血清学抗体检测的标准抗原。然而ES抗原成分复杂，制备繁琐、生产周期长、批次质量不均，而且存在严重的诊断盲区(感染后19d前无法检出)和交叉反应等问题，因而阻碍了其实际应用。

目前利用差减杂交SSH法(suppression subtractive hybridization)已成功构建旋毛虫新生幼虫差减cDNA文库，率先筛选并克隆到一条旋毛虫新生幼虫高反应原性及高特异性抗原基因-丝氨酸蛋白酶基因，命名为Ts-T668。Ts-T668由一个酶活性区和一个C末端区组成，但C末端区的功能不清楚。

发明内容

针对如何对旋毛虫病进行特异性诊断的技术问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.18319。

本发明还提供了一种抗旋毛虫新生幼虫期丝氨酸蛋白酶的单克隆抗体，是由上述杂交瘤细胞株CGMCC No.18319所分泌。

进一步地限定，所述单克隆抗体所识别的抗原表位多肽氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明所述的杂交瘤细胞株可用于制备诊断旋毛虫T.spiralis感染的试剂，本发明所述的SEQ ID NO.1所示的抗原表位多肽可用于制备诊断或预防旋毛虫T.spiralis感染的疫苗。

有益效果

单克隆抗体具有与抗原结合的特异性强、纯度好、重复性强、便于质量控制、亲和力好且可大量生产的优势，因而被广泛的应用于免疫学检测方法的建立。所以，筛选出可以分泌抗Ts-T668-C蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定出其所分泌的单克隆抗体所识别的Ts-T668-C蛋白特异性B细胞表位对旋毛虫病的诊断方法的改进，及亚单位疫苗的研制具有重要的意义。

本发明所制备的单克隆抗体特异的与旋毛虫新生幼虫和6日龄成虫粗提物抗原发生特异性反应。免疫荧光表明所获得的单克隆抗体特异性的识别新生幼虫和6日龄成虫的胚胎，不与其它的时期的虫体发生反应。Ts-T668-C竞争ELISA检测结果表明，单克隆抗体Ts-T668-5D4-Ab可以与旋毛虫感染阳性猪血清竞争结合Ts-T668-C抗原。

本发明利用肽扫描技术对Ts-T668-5D4-Ab所识别的Ts-T668-C抗原B细胞表位进行了鉴定，确定Ts-T668-5D4-Ab识别肽是³²⁷NSPEGTVKWASKEDS ³⁴¹和³³⁶ASKEDSPVDLSTASR³⁵⁰其含有6个共同的氨基酸基序“ASKEDS”，为该单克隆抗体的抗原识别表位。

附图说明

图1Ts-T668-C蛋白纯化后的SDS-PAGE结果，M:蛋白分子质量标准；1.纯化后rTs-T668-C蛋白；

图2单克隆抗体5D4与猪旋毛虫感染阳性血清竞争结合Ts-T668-C蛋白检测结果，纵坐标为阳性质控血清OD_450nm吸光度(P)与阴性质控血清OD_450nm吸光度(N)的比值，横坐标为质控血清稀释倍数；

图3单克隆抗体5D4对rT668-C蛋白特异性识别结果图，M：蛋白MARKER.1.SP2/0细胞细胞培养液，2.杂交瘤细胞培养液上清，3.小鼠感染300条旋毛虫阳性血清；

图4单克隆抗体对旋毛虫不同发育时期虫体的识别结果图，N：SP2/0细胞细胞培养液，rT668:抗T668-C单克隆抗体，其中1为肌幼虫粗提物，2为6日龄成虫粗提物，3为新生幼虫粗提物；

图5免疫荧光分析单克隆抗体对旋毛虫不同发育时期的虫体的识别结果图，其中N：SP2/0细胞培养液，rT668-C:抗T668-C单克隆抗体；AD：6日龄成虫，NBL：新生幼虫,ML：肌幼虫；

图6间接ELISA试验检测结果，横坐标为不同组别(不同的合成肽包被抗原)，纵坐标为OD450nm吸光度。

具体实施方式

新生幼虫期的Ts-T668-C抗原：通过对旋毛虫新生幼虫的cDNA文库进行免疫学筛选，获得一个高丰度强反应原性的抗原蛋白，命名为T668，生物信息学序列分析T668蛋白属于丝氨酸蛋白酶。肽扫描分析表明其C端是免疫显性区域，即主要的抗原区域，本发明使用的是其C端的免疫显性区域，记为Ts-T668-C。

本发明采用TRIZOL提取旋毛虫(T.spiralis)总RNA，进而利用反转录技术克隆Ts-T668-C(C端免疫显性区域)，将该cDNA***原核表达载体pET28a，利用pET28a原核表达载体对Ts-T668-C基因进行原核表达，将所表达出的可溶性形式的Ts-T668-C通过镍离子金属亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。并应用重组的Ts-T668-C作为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选，最终获得了一株稳定分泌抗Ts-T668-C蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，于2019年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCCNo.18319，本申请中命名为NBL-5D4。

本发明所用的主要实验材料和来源如下：

1.主要试剂和药品：Ni纯化柱HisTrapHP购自美国GE公司；胎牛血清、1640培养基购自Biological Industries公司；HAT培养基(50×)、HT培养基(50×)和抗体亚类鉴定试剂盒购自sigma公司；Soluble TMB substrate Solution购自TIANGEN公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠IgG抗体购自北京博奥森公司；预染蛋白Marker购自Fermentas公司；限制性内切酶EcoRI和XhoI、反转录酶、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自宝生物(大连)有限公司；ECL发光底物购自北京索莱宝公司。

2.实验动物：6周龄BALB/c小鼠由长春亿斯实验动物技术有限公司提供。

下面具体描述本发明所述的技术方案，下述实施例涉及的反转录、PCR、酶切等分子生物学实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规技术方法。

实施例1.Ts-T668-C蛋白的原核表达及纯化。

1.引物设计：根据Genbank中已登录的T668基因序列(登录号：AY491941)，设计PCR扩增引物，序列如下：

Ts-T668基因C段区域扩增所用模板为新生幼虫cDNA，扩增引物如下：

TsT668-F:5’-TAACGAATTC GAAAATTCTCCTGAAG-3’；

TsT668-R:5’-GACGCTCGAG TTACTTAGAAAAGTG-3’。

下划线部分为引入的EcoRI、XhoI酶切位点。

2.表达载体的构建：以反转录获得的新生幼虫cDNA为模板扩增Ts-T668-C。

PCR反应体系(50uL)如下：

反应条件为95℃预变性5min，95℃45s，55℃45s，72℃45s，循环30个，72℃终延伸10min。对PCR产物胶回收。将胶回收得到的目的基因Ts-T668-C以及原核表达载体pET28a分别进行双酶切，酶切体系如下：

同时，对原核表达载体pET28a进行双酶切，酶切体系如下：

将酶切反应体系置37℃水浴静置2h，之后进行胶回收。将双酶切后的目的基因与pET28a载体进行连接，体系为：10×T₄DNA Ligase Buffer 1uL，酶切后目的基因4uL，酶切后pET28a1.5uL，T₄DNA连接酶1uL，ddH₂O 2.5uL。16℃连接过夜。将连接产物全部转化EcoliDH5a感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定和测序。阳性重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞。

3.重组蛋白诱导表达与纯化：

对验证正确转入质粒Ts-T668-C的表达菌进行扩大培养，取10mL菌液接种于含50μg/mLKan的1L新鲜LB液体培养基中，于震荡摇床中37℃180rpm/min培养至菌液OD₆₀₀达到0.4～0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG，并将摇床温度设定为37℃，继续培养5h后将菌液倒入50mL离心管中，配平后，4℃，3000rpm，离心30min。弃去上清，沉淀用5mL的PBS洗涤菌体1次，然后用20mL细菌裂解液重悬后，反复冻融3-4次后超声破碎。超声条件为功率400W，超声时间4秒，间歇时间5秒，全程时间约为30分钟。超声破碎的菌体分装于1.5mL离心管，4℃12000g离心10min，保留上清。

使用美国GE HeaLthcare公司的AKTA Purifier 100系统纯化含His标签的重组蛋白。将His-Trap HP柱与系统连接，流速为1mL/min用5-10个柱体积的Bingding Buffer平衡His-Trap HP柱至紫外吸收曲线平稳。紫外吸收峰调零后用上样环进行蛋白上样，当Bingding Buffer洗脱峰平衡后改用Elution Buffer进行洗脱，出现洗脱峰后延迟500μL用无菌试管收集洗脱液，得到旋毛虫重组抗原Ts-T668-C，经SDS-PAGE检验纯化结果表明纯化后的蛋白上清液只有一条清晰明显的条带，且大小与理论值相符图1，说明本研究获得了较纯的rTs-T668-C可溶性蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒，对上述纯化的蛋白进行浓度测定，得出rTs-T668-C蛋白的浓度为1.25mg/mL。

细菌裂解液：Tris碱6.055g，NaCL 5.844，咪唑1.26g溶菌酶100mg，PMSF 0.17g，调节pH至7.4，定容至1000mL。

Bingding Buffer：NaCl 14.61g，咪唑1g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.2964g，Na₂HPO₄·12H₂O2.009g，溶于450mL ddH₂O，调节pH至7.4，定容至500mL。

Elution Buffer：NaCl 14.61g，咪唑17g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.2964g，Na₂HPO₄·12H₂O2.009g，溶于450mL ddH₂O，调节pH至7.4，定容至500mL。

实施例2.杂交瘤细胞株的制备方法。

1.小鼠免疫

以实施例1纯化的重组Ts-T668-C蛋白免疫5只6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫4次，每次免疫间隔两周，免疫剂量为50ug/只加入等体积的佐剂，第一次免疫为弗氏完全佐剂，其他三次为弗氏不完全佐剂，免疫途径为腹腔免疫。

分别在第3次免疫和第4次免疫后1周对小鼠进行断尾采血，分离血清(4℃，3000rpm离心30min)，用Ts-T668-C间接ELISA方法检测抗体水平。Ts-T668-C间接ELISA方法操作如下：重组的Ts-T668-C蛋白用包被液(0.1M的碳酸盐缓冲液，PH9.6，Na₂CO₃ 63.6g,NaHCO₃33.6g定容至1000mL)稀释，包被量为0.1ug/孔，每孔100ul。于37℃包被1h后4℃过夜。之后PBST(含0.05％吐温20)洗板3次。用封闭液(5％脱脂乳)37℃封闭2h。之后PBST洗板3次。待检血清倍比稀释(或者杂交瘤上清1:2倍稀释)后加入微孔板，每孔100ul。37℃孵育1h。之后PBST洗板3次。羊抗鼠二抗1:1000倍稀释，与37℃孵育30min。之后PBST洗板4次。37℃显色10min。2M H₂SO₄终止反应，读取OD450nm处光吸收值。

在细胞融合前3天，对免疫效果好的BALB/c小鼠进行加强免疫，每只小鼠尾静脉注射50ug免疫原。

2.细胞融合

融合前1天准备小鼠饲养层细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按照脾细胞1×10⁸与SP2/0骨髓瘤细胞2.5×10⁷(4:1)的比例混合，用1ml PEG1000进行细胞融合，1min内滴加结束。然后在1min内将预热至37℃的1ml 1640基础培养基滴加进细胞悬液中，边滴加边搅拌。在3min内将预热至37℃的1ml 1640基础培养基滴加进细胞悬液中，边滴加边搅拌。最后将10ml 37℃的1640基础培养基缓慢的加入细胞悬液中，整个过程在37℃水浴中操作。1000r/min离心10min，弃上清，用HAT培养基重悬细胞，将细胞均匀的铺至预先铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。

3.阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆

利用Ts-T668-C间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞进行扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的亚克隆，至少亚克隆3次，将亚克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得可以稳定分泌抗Ts-T668-C蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，于2019年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.18319，命名为NBL-5D4，并将其分泌的单克隆抗体命名为NBL-5D4-Ab以下分别简称5D4。

实施例3.抗Ts-T668-C蛋白单克隆抗体腹水的制备。

给12周龄左右健康的BALB/c小鼠腹腔注射石蜡油，0.5ml/只，1周后腹腔注射1×10⁶个实施例2制备的杂交瘤细胞，7～10天后当小鼠腹腔极度膨胀时抽取腹水，隔2天抽取一次，收集腹水。腹水利用protein G亲和层析介质进行纯化，纯化前10000rpm离心10min去除红细胞及脂肪，吸取上清液进行纯化。首先将层析柱与注射器用接合器连接，用注射器吸取5－10ml结合缓冲液，注入层析柱，流速为1mL/min，吸取准备好的腹水注入至层析柱中，用10－15mL的洗涤缓冲液冲洗柱子，洗脱杂蛋白，最后用5mL洗脱缓冲液洗脱，收集至离心管中，-20℃保存备用。

单克隆抗体的鉴定：

1.单克隆抗体的亚类鉴定

按照抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例2所得到单克隆抗体进行亚类鉴定。结果显示本发明单克隆抗体5D4的重链为IgG1，轻链为kappa链。

表1单克隆抗体亚型的鉴定

单抗名称	lgG1	lgG2a	lgG2b	lgG3	lgM	lgA	κ链	λ链
									NBL-5D4-Ab	1.126	0.362	0.327	0.366	0.373	0.365	0.891	0.362

2.Ts-T668-C竞争ELISA试验

包被封闭同实施例2所述的Ts-T668-C间接ELISA方法，从1:1开始2倍倍比稀释猪旋毛虫感染阳性和阴性血清，稀释后的待检血清各取50ul分别与抗T668-C单抗上清50ul等体积混合，取混合后溶液100ul加入微孔板，37℃作用1h，之后同间接ELISA，分析单抗上清能否与猪旋毛虫感染阳性血清竞争结合Ts-T668-C抗原。

试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体5D4能够与猪旋毛虫感染阳性血清竞争结合Ts-T668-C蛋白。

表2 5D4单克隆抗体与猪旋毛虫感染阳性血清竞争结合Ts-T668-C抗原的ELISA检测结果

3.Western blot鉴定

将旋毛虫不同发育时期的虫体(肌幼虫、6日龄成虫、新生幼虫)用ddH₂O洗涤3次，加入少量PBS，在冰浴中以组织研磨器研磨虫体至碎片，再于冰浴中用超声波细胞粉碎仪破碎虫体碎片。电压300V，超声5s间隔9s，工作5次，超声3个循环，光镜下观察虫体已粉碎成较小碎片时，置4℃和-20℃交替冻融5次，冻融后的虫体4℃1600g离心30min，吸取上清即为可溶性抗原。处理后与重组蛋白rT668-C进行SDS-PAGE，然后经电转印将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，5％脱脂乳4℃封闭过夜，加入单克隆抗体室温孵育1h，用PBST洗涤3次，再与10000倍稀释的AP标记的兔抗鼠鼠IgG抗体或3000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体室温孵育1h，PBST洗涤3次后，用NBT/BCIP或ECL发光底物显色液进行检测。

试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体特异的识别rT668-C(图3)，同时仅仅与旋毛虫新生幼虫和6日龄成虫反应，不与肌幼虫反应(图4)，表明所获得的单克隆抗体特异性的识别T668蛋白。

4.免疫组织化学鉴定

将不同发育时期的旋毛虫(6日龄成虫AD6、肌幼虫ML、新生幼虫NBL)用OTC包埋后，进行冰冻切片，切片厚度为10μm。切片放入4℃丙酮固定5-10min后，PBS洗涤3次，每次3min。然后浸泡在0.1％TritonX-100中，4℃静置1h。用PBS冲洗3次，每次5min后，用20μg/ml蛋白酶K消化冰切片5min。用PBS冲洗后，滴加5％正常山羊血清封闭30min。甩去正常山羊血清，滴加单克隆抗体，4℃孵育过夜。用PBS冲洗3次，每次10min。滴加二抗(用pH7.4的PBS 1:400稀释的Alexa Fluor 488Goat anti-mice IgG)，避光孵育1h后，用PBS冲洗3次，每次5min。甘油封片后，在荧光显微镜下观察并采集图像。绿色荧光为阳性信号。免疫荧光表明所获得的单克隆抗体特异性的识别新生幼虫和6日龄成虫的胚，不与其它的时期的虫体发生反应，如图5，结果与Western blot一致。

实施例4.B细胞表位多肽的鉴定。

为了对获得的单克隆抗体所识别的表位决定区进行进一步的表位鉴定，本发明设计了一套16个部分重叠的短肽，且相邻两条15肽之间有5-10个氨基酸的重叠，这16条短肽序列完全覆盖了整个T668-C的氨基酸序列，并命名为T668-1～T668-16，具体序列见下表。短肽合成及与BSA偶联由上海科肽生物科技有限公司完成。进一步进行间接ELISA试验检测，每条短肽包被量为0.2ug/孔。结果表明：Ts-T668-3和Ts-T668-4合成肽可以被5D4单克隆抗体所识别，阳性信号强，而5D4单克隆抗体对其他肽段不识别，基本无性信号，表明5D4单克隆抗体所识别的抗原表位定位于³²⁷NSPEGTVKWASKEDS ³⁴¹和³³⁶ASKEDSPVDLSTASR³⁵⁰所示氨基酸序列上，其含有6个共同的氨基酸基序“ASKEDS”。

表3短肽序列与位置

表4间接ELISA试验检测结果

综上所述，本发明制备并鉴定出了一种针对Ts-T668-C蛋白的单克隆抗体，本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的Ts-T668-C蛋白B细胞表位多肽可用于制备成诊断或预防旋毛虫(T.spiralis)感染的试剂或疫苗，为建立旋毛虫(T.spiralis)血清学诊断方法的建立奠定了基础。

氨基酸和核苷酸序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种杂交瘤细胞株、抗旋毛虫新生幼虫期丝氨酸蛋白酶的单克隆抗体及应用

<130>

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 抗原表位

<400> 1

Ala Ser Lys Glu Asp Ser

1 5

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> TsT668-F

<400> 2

taacgaattc gaaaattctc ctgaag 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> TsT668-R

<400> 3

gacgctcgag ttacttagaa aagtg 25

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-1

<400> 4

Val Tyr Ala Lys Val Pro Ser Tyr Val Thr Trp Leu Asn Lys Ala

1 5 10 15

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-2

<400> 5

Trp Leu Asn Lys Ala Ala Lys Glu Leu Glu Asn Ser Pro Glu Gly

1 5 10 15

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-3

<400> 6

Asn Ser Pro Glu Gly Thr Val Lys Trp Ala Ser Lys Glu Asp Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-4

<400> 7

Ala Ser Lys Glu Asp Ser Pro Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Arg

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-5

<400> 8

Leu Ser Thr Ala Ser Arg Pro Thr Asn Pro Tyr Thr Gly Ser Arg

1 5 10 15

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-6

<400> 9

Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg

1 5 10 15

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-7

<400> 10

Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser

1 5 10 15

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-8

<400> 11

Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg

1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-9

<400> 12

Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg

1 5 10 15

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-10

<400> 13

Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Tyr Thr Gly Ser Arg

1 5 10 15

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-11

<400> 14

Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Pro Gln Lys Pro Val Phe Pro

1 5 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-12

<400> 15

Gln Lys Pro Val Phe Pro Ser Tyr Gln Lys Tyr Pro Pro Ala Val

1 5 10 15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-13

<400> 16

Lys Tyr Pro Pro Ala Val Gln Lys Tyr Ile Asp Ser Leu Pro Ser

1 5 10 15

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-14

<400> 17

Ile Asp Ser Leu Pro Ser Gly Thr Gln Gly Thr Leu Glu Tyr Thr

1 5 10 15

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> T668-15

<400> 18

Gly Thr Leu Glu Tyr Thr Val Thr Gln Asn Gly Val Thr Thr Thr

1 5 10 15

<210> 19

<211> 13

<212> PRT

<213> T668-16

<400> 19

Asn Gly Val Thr Thr Thr Thr Tyr Tyr His Phe Ser Lys

1 5 10