阅读说明：本技术 一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法 (Preparation method of human somatostatin anti-idiotype yolk antibodies ) 是由 金晓航 黄威权 田超 赵锋 李丹 黄晓文 欧阳森 于 2019-11-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法,涉及抗体制备技术领域,通过制备生长抑素免疫原；制备生长抑素多克隆抗体；采用所述生长抑素免疫原和不完全弗氏佐剂混合,按照第一预设条件对小鼠进行免疫后,获得所述小鼠脾细胞；培养扩增小鼠骨髓瘤细胞,将所述小鼠脾细胞与所述小鼠骨髓瘤细胞按照第二预设条件进行细胞融合,获得杂交瘤细胞；当融合后的杂交瘤细胞满足第三预设条件时,获得单克隆抗体,并筛选出中和性单克隆抗体；制备所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物；获得所述产蛋鸡的生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品；获得所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品；对所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品进行检测。(The invention discloses a preparation method of human somatostatin anti-idiotype yolk antibodies, which relates to the technical field of antibody preparation and comprises the steps of preparing somatostatin immunogens, preparing somatostatin polyclonal antibodies, mixing the somatostatin immunogens with incomplete Freund's adjuvant, immunizing a mouse according to preset conditions to obtain spleen cells of the mouse, culturing and amplifying myeloma cells of the mouse, carrying out cell fusion on the spleen cells of the mouse and the myeloma cells of the mouse according to second preset conditions to obtain hybridoma cells, obtaining monoclonal antibodies and screening out neutralizing monoclonal antibodies when the fused hybridoma cells meet third preset conditions, preparing immunogen complexes of the neutralizing monoclonal antibodies, obtaining crude products of the laying hen somatostatin anti-idiotype yolk antibodies, obtaining the purified products of the somatostatin anti-idiotype yolk antibodies, and detecting the purified products of the somatostatin anti-idiotype yolk antibodies.)

一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法

技术领域

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法。

背景技术

目前，许多肿瘤和癌组织都高表达SS受体，这些受体经SS或SS类似物激活后，对肿瘤的增值、恶变进程起到很好抑制作用。所以，SS和SS类似物如奥曲肽对胃癌、肝癌、乳腺癌、胃肠胰内分泌瘤均有较好疗效。对糖尿病及因糖尿病引起的视网膜病变也有很好的治疗效果。但迄今尚未出现关于SS抗独特型卵黄抗体治疗以上疾病的报道。

基因重组表达SS和人工合成SS类似物主要缺点是分子量小，稳定性差，进入机体后容易被分解失效，半衰期很短。这些小分子很易被胃酸破坏，口服无效，只能注射给药，用药途径单一。另外它们有种族界限，取材和应用范围受到限制。

发明内容

本申请实施例通过提供一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法，解决了现有技术中的基因重组表达SS和人工合成SS类似物分子量小，稳定性差，进入机体后容易被分解失效，半衰期很短，用药途径单一，取材和应用范围受到限制的技术问题，达到了取材更容易，资源更丰富，研发和制备简便，成本低，性能稳定，应用途径多样的技术效果。

本发明实施例提供了一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法，包括：步骤1：制备生长抑素免疫原；步骤2：制备生长抑素多克隆抗体；步骤3：采用所述步骤1中获得的所述生长抑素免疫原和不完全弗氏佐剂混合，按照第一预设条件对小鼠进行免疫后，获得所述小鼠脾细胞；步骤4：培养扩增小鼠骨髓瘤细胞，将所述小鼠脾细胞与所述小鼠骨髓瘤细胞按照第二预设条件进行细胞融合，获得杂交瘤细胞；步骤5：当融合后的杂交瘤细胞满足第三预设条件时，将所述杂交瘤细胞进行培养，获得单克隆抗体，并筛选出中和性单克隆抗体；步骤6：根据所述步骤5中获得的所述中和性单克隆抗体，制备所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物；步骤7：采用所述步骤5中获得的所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物和不完全弗氏佐剂混合，按照第四预设条件对产蛋鸡进行免疫后，获得所述产蛋鸡的生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品；步骤8：对所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，获得所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品；步骤9：依次对所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品进行效价检测、特异性检测、竞争抑制试验、诱导异种动物产生生长抑素抗体试验以及对不同癌细胞株体外抑制作用试验。

优选的，在所述步骤2中，所述制备生长抑素多克隆抗体，包括：将所述步骤1中获得的生长抑素免疫原和不完全弗氏佐剂混合，搅拌均匀后按照第五预设条件对兔或者小鼠外的其他动物进行免疫；经过第一预设时间后，采集所述兔或者小鼠外的其他动物的血液，离心后获得血清并检测所述血清中生长抑素多克隆抗体的效价，判断所述检测结果是否满足第六预设条件；当满足所述第六预设条件时，经过第二预设时间后，采集所述动物的血清并获得所述生长抑素多克隆抗体。

优选的，在所述步骤3中，还包括：采用腹腔注射给所述小鼠，每只所述小鼠每次免疫0.2mL，生长抑素含量为10μg，免疫预定次数；在第二次免疫后，采集所述小鼠的血液，离心获取血清；当所述血清中的生长抑素抗体效价满足第一预设阈值时，在第三次免疫后获得所述小鼠脾细胞；制备所述小鼠脾细胞悬液。

优选的，在所述步骤4中，包括：对所述骨髓所述小鼠骨髓瘤细胞进行扩增培养，获得所述小鼠骨髓瘤细胞悬液；分别采集所述小鼠脾细胞悬液和所述小鼠骨髓瘤细胞悬液各10mL，以及培养液至离心管中，摇匀、离心后去除上清液；加入体积浓度为50％的融合剂聚乙二醇溶液0.7mL和培养液，离心后去除上清液；加入20mL的HAT培养液，吹打沉淀细胞，将细胞悬液加入至设有饲养细胞的第一培养板中，每孔加量为0.1mL；将所述第一培养板置于37℃，CO₂浓度为5％的孵箱中培养。

优选的，在所述步骤5中，包括：采用间接ELISA法对所述杂交瘤细胞进行阳性孔检测，判断所述杂交瘤细胞是否满足第三预设条件；对满足所述第三预设条件的杂交瘤细胞进行吹打均匀后计数，并进行逐级稀释；将逐级稀释后的所述杂交瘤细胞在第七预设条件下进行培养，记录单克隆孔，并按照第三预设时间进行阳性检测；将满足要求的阳性单克隆孔的所述杂交瘤细胞，转至第二培养板中在所述第七预设条件下进行培养增殖后，转入细胞培养瓶中在所述第七预设条件下进行扩大培养；将呈对数生长的所述杂交瘤细胞收集于离心管中，离心并去除上清液后进行冻存。

优选的，所述第七预设条件具体为：培养液为含20％小牛血清的RPMI-1640培养液，在CO₂孵箱培养，温度为37℃，CO₂浓度为5％。

优选的，在所述步骤5中，还包括：将冻存后的所述杂交瘤细胞进行复苏扩增培养；将扩增培养后的所述杂交瘤细胞吹打，离心并去除上清液；加无血清培养液至沉淀的所述杂交瘤细胞中，调整细胞浓度为1×10⁶/mL，每只BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL，接种所述杂交瘤细胞后7～14天，吸取腹水离心，收集上清液获得单克隆抗体，并筛选出中和性单克隆抗体；对所述中和性单克隆抗体效价检测、特异性检测以及对抗原中和性检测。

优选的，在所述步骤6中，包括：采用PBS缓冲液将所述中和性单克隆抗体按照1：1进行稀释，将10mgBSA溶解至1mL蒸馏水中；将10mg/mL的BSA和稀释后的所述中和性单克隆抗体混合搅匀，边搅拌边滴加1mL 2.5mL/L的戊二醛溶液，滴加完后，继续搅拌10～15min，室温下静置第四预设时间后稀释至10mL，获得所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物。

优选的，在所述步骤7中，包括：在第五预设时间后，对所述产蛋鸡进行筛选，判断所述产蛋鸡的鸡蛋中蛋黄是否具有生长抑素抗独特型卵黄抗体，且所述生长抑素抗独特型卵黄抗体的效价满足第二预设阈值；当满足时，在第六预设时间后，采集所述产蛋鸡的鸡蛋，并采用人工或机器分离蛋黄；对所述蛋黄进行卵黄组织破碎和杂蛋白去除后，获得所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品。

优选的，在所述步骤8中，包括：根据所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品的体积加入50％～60％冷酒精，搅拌、离心后获得第一沉淀物；向所述第一沉淀物中加入蒸馏水，以使第一混合液的体积与所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品的体积保持一致，加入冷酒精，使其体积达到所述第一混合液体积的25％～30％，搅拌、离心后获得第二沉淀物；向所述第二沉淀物中加入蒸馏水，以使第二混合液的体积与所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品的体积保持一致，加入冷酒精，使其体积达到所述第二混合液体积的20％～25％，搅拌、离心后获得所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品。

本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下一种或多种技术效果：

在本发明实施例提供的一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法，所述方法包括：步骤1：制备生长抑素免疫原；步骤2：制备生长抑素多克隆抗体；步骤3：采用所述步骤1中获得的所述生长抑素免疫原和不完全弗氏佐剂混合，按照第一预设条件对小鼠进行免疫后，获得所述小鼠脾细胞；步骤4：培养扩增小鼠骨髓瘤细胞，将所述小鼠脾细胞与所述小鼠骨髓瘤细胞按照第二预设条件进行细胞融合，获得杂交瘤细胞；步骤5：当融合后的杂交瘤细胞满足第三预设条件时，将所述杂交瘤细胞进行培养，获得单克隆抗体，并筛选出中和性单克隆抗体；步骤6：根据所述步骤5中获得的所述中和性单克隆抗体，制备所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物；步骤7：采用所述步骤5中获得的所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物和不完全弗氏佐剂混合，按照第四预设条件对产蛋鸡进行免疫后，获得所述产蛋鸡的生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品；步骤8：对所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，获得所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品；步骤9：依次对所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品进行效价检测、特异性检测、竞争抑制试验、诱导异种动物产生生长抑素抗体试验以及对不同癌细胞株体外抑制作用试验，从而解决了现有技术中的基因重组表达SS和人工合成SS类似物分子量小，稳定性差，进入机体后容易被分解失效，半衰期很短，用药途径单一，取材和应用范围受到限制的技术问题，达到了取材更容易，资源更丰富，研发和制备简便，成本低，性能稳定，应用途径多样的技术效果。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的

具体实施方式

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附图说明

图1为本发明实施例的一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法的流程示意图。

具体实施方式

本申请实施例通过提供了一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法，解决了现有技术中的基因重组表达SS和人工合成SS类似物分子量小，稳定性差，进入机体后容易被分解失效，半衰期很短，用药途径单一，取材和应用范围受到限制的技术问题。

本发明实施例中的技术方案，总体思路如下：本发明实施例提供的一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法，通过步骤1：制备生长抑素免疫原；步骤2：制备生长抑素多克隆抗体；步骤3：采用所述步骤1中获得的所述生长抑素免疫原和不完全弗氏佐剂混合，按照第一预设条件对小鼠进行免疫后，获得所述小鼠脾细胞；步骤4：培养扩增小鼠骨髓瘤细胞，将所述小鼠脾细胞与所述小鼠骨髓瘤细胞按照第二预设条件进行细胞融合，获得杂交瘤细胞；步骤5：当融合后的杂交瘤细胞满足第三预设条件时，将所述杂交瘤细胞进行培养，获得单克隆抗体，并筛选出中和性单克隆抗体；步骤6：根据所述步骤5中获得的所述中和性单克隆抗体，制备所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物；步骤7：采用所述步骤5中获得的所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物和不完全弗氏佐剂混合，按照第四预设条件对产蛋鸡进行免疫后，获得所述产蛋鸡的生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品；步骤8：对所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，获得所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品；步骤9：依次对所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品进行效价检测、特异性检测、竞争抑制试验、诱导异种动物产生生长抑素抗体试验以及对不同癌细胞株体外抑制作用试验，从而达到了取材更容易，资源更丰富，研发和制备简便，成本低，性能稳定，应用途径多样的技术效果。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

本实施例提供了一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法，请参考图1，所述人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法包括：

步骤1：制备生长抑素免疫原。

具体而言，本实施例中的生长抑素免疫原可以根据实际需要进行获得。例如可根据需要购入人生长抑素标准品，并且该人生长抑素标准品为14个氨基酸的肽类物质，其分子量为1400Da，该人生长抑素标准品的氨基酸序列为：Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys。由于它是小分子肽类，免疫原性很小，需要将其偶联到分子量大于10000Da的蛋白质载体，制成SS免疫原复合物。具体的偶联方法如下：将10mg载体蛋白如牛血清白蛋白、血蓝蛋白等溶解到1mL PBS(pH 6.5～7.0)，将1mg SS溶解于1mL蒸馏水，将两者混合搅匀，然后边搅拌边滴加1mL 0.25％戊二醛溶液，滴加完后继续搅拌5～10分钟，然后在室温下静置让其继续反应2～3小时，稀释至10mL，则制成SS免疫原复合物，进而分装置于-20℃冰箱保存待用。其中，SS是生长抑素(somatostatin)的简称，是一种典型的脑肠肽，是由下丘脑释放的，能够抑制垂体生长激素的释放。PBS是磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和KCl。

步骤2：制备生长抑素多克隆抗体。

进一步的，在所述步骤2中，所述制备生长抑素多克隆抗体，包括：将所述步骤1中获得的生长抑素免疫原和不完全弗氏佐剂混合，搅拌均匀后按照第五预设条件对兔或者小鼠外的其他动物进行免疫；经过第一预设时间后，采集所述兔或者小鼠外的其他动物的血液，离心后获得血清并检测所述血清中生长抑素多克隆抗体的效价，判断所述检测结果是否满足第六预设条件；当满足所述第六预设条件时，经过第二预设时间后，采集所述动物的血清并获得所述生长抑素多克隆抗体。

具体而言，在对生长抑素多克隆抗体的制备过程中，主要包括如下步骤：首先，是免疫过程，具体为：用等体积的上述步骤1中获取到的SS免疫原复合物和不完全弗氏佐剂混合，搅匀后即可对兔或者小鼠外的其他动物进行免疫，本实施例中以兔或者小鼠外的其他动物分别为免疫大鼠、家兔作为优选。其中，第五预设条件为：大鼠每只每次免疫15～20μg，家兔每只每次免疫20～40μg，共免疫3～4次，间隔7～10天；接着，是对于SS多克隆抗体效价检测，具体为：在经过第一预设时间后，其中，第一预设时间为第二次免疫后3～5天，分别采大鼠、家兔的血液(大鼠麻醉后取尾静脉血，家兔麻醉后取耳静脉血)，离心取血清，采用ELISA检测血清中SS抗体的效价，然后判断SS抗体的效价是否满足了第六预设条件。本实施例中以第六预设条件为效价达1×10^-4以上作为优选，例如当效价达1×10^-4以上时，则再次经过第二预设时间后，其中，第二预设时间为第三次免疫后第5～7天，放血取血清。如果效价达不到1×10^-4，则作淘汰处理，此时需要更换动物重新免疫；最后，是SS多克隆抗体的收取及保存：如前所述，在第二次免疫后检SS抗体的效价达标的(效价达1×10^-4)动物第三次免疫后5～7天，即可放血，大鼠麻醉后断头放血，家兔麻醉后颈动脉插管放血。离心后获取血清，分装后置于-20℃保存备用。其中，ELISA是enzyme linked immunesorbent assay(酶联免疫吸附测定)的简写，指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法

步骤3：采用所述步骤1中获得的所述生长抑素免疫原和不完全弗氏佐剂混合，按照第一预设条件对小鼠进行免疫后，获得所述小鼠脾细胞。

进一步的，在所述步骤3中，还包括：采用腹腔注射给所述小鼠，每只所述小鼠每次免疫0.2mL，生长抑素含量为10μg，免疫预定次数；在第二次免疫后，采集所述小鼠的血液，离心获取血清；当所述血清中的生长抑素抗体效价满足第一预设阈值时，在第三次免疫后获得所述小鼠脾细胞；制备所述小鼠脾细胞悬液。

具体而言，在对SS单克隆抗体制备时，首先需要进行的是免疫过程。具体为：采用上述步骤1中获取到的SS免疫原复合物和等体积不完全弗氏佐剂混匀后腹腔注射给小鼠，本实施例中以小鼠为免疫BALB/c小鼠作为优选。进一步的，第一预设条件为：每次每只小鼠免疫0.2mL，含SS 10μg，共免疫三次，间隔时间为一周。第二次免疫后第5天剪尾取血，离心取血清，进而检测血清中SS抗体的效价，然后判断SS抗体的效价是否满足第一预设阈值。本实施例中以第一预设阈值为1×10^-4作为优选。即就是说如果效价达到1×10^-4，则在第三次免疫后第三天断颈，取脾细胞进行细胞融合。

进一步的，即可对获取到的脾细胞进行免疫脾细胞的制备。具体的操作过程为：取免疫小鼠脾脏，置于200目的不锈钢网上，放入盛有5mL不完全培养液(不加小牛血清的1640培养液)的平皿中，研磨使脾细胞通过网孔进入培养液中。将脾细胞悬液转入50mL离心管中，加不完全培养液至30mL，混匀后经1000rpm离心5min，弃上清。将不完全培养液30mL加入有沉淀脾细胞的离心管内，轻轻震动，使脾细胞重新悬起。再经1000rpm离心5min，弃上清，用不完全培养液将沉淀细胞重悬至10mL。混匀，用细胞计数器计数，总细胞数调为1×10⁸。

步骤4：培养扩增小鼠骨髓瘤细胞，将所述小鼠脾细胞与所述小鼠骨髓瘤细胞按照第二预设条件进行细胞融合，获得杂交瘤细胞。

进一步的，在所述步骤4中，包括：对所述骨髓所述小鼠骨髓瘤细胞进行扩增培养，获得所述小鼠骨髓瘤细胞悬液；分别采集所述小鼠脾细胞悬液和所述小鼠骨髓瘤细胞悬液各10mL，以及培养液至离心管中，摇匀、离心后去除上清液；加入体积浓度为50％的融合剂聚乙二醇溶液0.7mL和培养液，离心后去除上清液；加入20mL的HAT培养液，吹打沉淀细胞，将细胞悬液加入至设有饲养细胞的第一培养板中，每孔加量为0.1mL；将所述第一培养板置于37℃，CO₂浓度为5％的孵箱中培养。

具体而言，在得到脾细胞之后，接着即可培养扩增小鼠骨髓瘤细胞，本实施例中以该骨髓瘤细胞为SP20小鼠骨髓瘤作为优选。因此，在制备SP20小鼠骨髓瘤细胞悬液时，具体的操作方法为：将SP20小鼠骨髓瘤细胞进行扩增培养，培养液为20％小牛血清的RPMI-1640培养液，在CO₂孵箱中培养，温度为37℃，CO₂浓度为5％。将四瓶扩增培养的骨髓瘤细胞收集到50mL离心管，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清。加入30mL不完全培养液，轻轻震动，使细胞重悬。再经1000rpm离心5min，弃上清，用不完全培养液将沉淀细胞重悬至10mL。混匀，用细胞计数器计数，总细胞数调为2～3×10⁷。

进一步的，即可将脾细胞悬液和所述小鼠骨髓瘤细胞悬液进行细胞融合，其中，第二预设条件具体为：分别取含1×10⁸脾细胞悬液和2～3×10⁷小鼠骨髓瘤细胞悬液各10mL，加到50mL离心管中，补加不完全培养液至30mL，充分摇匀。1000rpm离心7min，弃上清。然后，加入体积浓度为50％的融合剂聚乙二醇(PEG)溶液0.7mL。加入25mL不完全培养液，使PEG稀释失去促融作用。在800rpm的条件下离心7min后，弃上清。接着，加入20mL的HAT培养液(含20％小牛血清的RPMI-1640培养液中加入2％的由次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷组成的选择性培养液)，轻轻吹打沉淀细胞，混匀使其重悬。将细胞悬液加到铺有饲养细胞(小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔培养板中，每孔加量为0.1mL，将培养板置37℃，CO₂浓度为5％的孵箱中培养。

步骤5：当融合后的杂交瘤细胞满足第三预设条件时，将所述杂交瘤细胞进行培养，获得单克隆抗体，并筛选出中和性单克隆抗体。

进一步的，在所述步骤5中，包括：采用间接ELISA法对所述杂交瘤细胞进行阳性孔检测，判断所述杂交瘤细胞是否满足第三预设条件；对满足所述第三预设条件的杂交瘤细胞进行吹打均匀后计数，并进行逐级稀释；将逐级稀释后的所述杂交瘤细胞在第七预设条件下进行培养，记录单克隆孔，并按照第三预设时间在第七预设条件下进行阳性检测；将满足要求的阳性单克隆孔的所述杂交瘤细胞，转至第二培养板中在所述第七预设条件下进行培养增殖后，转入细胞培养瓶中在所述第七预设条件下进行扩大培养；将呈对数生长的所述杂交瘤细胞收集于离心管中，离心并去除上清液后进行冻存。

进一步的，所述第七预设条件具体为：培养液为含20％小牛血清的RPMI-1640培养液，在CO₂孵箱培养，温度为37℃，CO₂浓度为5％。

在所述步骤5中，还包括：将冻存后的所述杂交瘤细胞进行复苏扩增培养；将扩增培养后的所述杂交瘤细胞吹打，离心并去除上清液；加无血清培养液至沉淀的所述杂交瘤细胞中，调整细胞浓度为1×10⁶/mL，每只BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL，接种所述杂交瘤细胞后7～14天，吸取腹水离心，收集上清液获得单克隆抗体，并筛选出中和性单克隆抗体；对所述中和性单克隆抗体效价检测、特异性检测以及对抗原中和性检测。

具体而言，采用间接ELISA法对培养板中进行阳性孔检测，具体的检测方法为：首先，用包被缓冲液将SS溶液稀释至10μg/mL，然后用其包被反应小孔，每孔100μL，含SS 1μg；然后，加入有克隆生长的孔中培养上清100μL；接着，加入酶标抗小鼠IgG抗体100μL；进一步的，加入底物液(含0.05％邻苯二胺溶液)100μL，室温避光显色10～20min；最终，在酶联免疫反应仪492nm波长处测A值，空白对照调零。第三预设条件具体为：若待测孔A值大于或等于阴性对照孔2.1倍，即可判定为阳性孔，孔内生长的克隆为阳性克隆，则说明培养孔中的杂交瘤细胞满足了第三预设条件，为阳性孔。

进一步的，即可将96孔培养板中被检测为SS抗体阳性孔标记出来，用加样器将孔内杂交瘤细胞反复吹打均匀后计数，然后用有限稀释法进行逐级稀释，再加到96孔板在第七预设条件下进行培养，观察克隆生长。记录单克隆孔，并在第三预设时间后及时进行阳性检测。其中，第三预设时间可根据实际需要进行设置，进而将阳性单克隆孔的细胞转到24孔板中在第七预设条件下培养，待其增殖到一定数量后再转入细胞培养瓶中同样在第七预设条件下进行扩大培养。由于克隆化过程中每一步骤中需要保证培养条件相同，因此，本实施例中的第七预设条件具体为：培养液为含20％小牛血清的RPMI-1640培养液，在CO₂孵箱培养，温度为37℃，CO₂浓度为5％。

进一步的，对得到的杂交瘤细胞进行冻存：将呈对数生长的杂交瘤细胞收集于离心管，1000rpm离心10min，弃去上清，加入1mL冻存液(含30％小牛血清，60％RPMI-1640培养液，10％二甲基亚砜)混匀，然后加到冻存管。在-70℃低温冰箱过夜后转入液氮罐长期保存。

进一步的，即可制备得到腹水型单克隆抗体，具体为：将冻存的杂交瘤细胞复苏扩增培养，将扩增培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm离心10min，收集上清做亚型试验。加无血清培养液到沉淀的杂交瘤细胞中，调整细胞浓度为1×10⁶/mL，每只BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL，接种杂交瘤细胞后7～14天，拉颈脱臼处死小鼠，吸取腹水离心，收集上清，即为腹水型单克隆抗体。分装后于-20℃冰箱保存备用。

进一步的，即可对单克隆抗体进行相应的检测。第一种检测为效价检测：用包被缓冲液将SS稀释成10μg/mL，然后加到ELISA反应板小孔内，每孔100μL，含SS量为1μg。在室温下静置1h，弃去孔内液体，用PBS洗三次，每次3min。用PBS将两株单抗腹水进行10倍系列稀释，共稀释10级。然后加到有SS包被的反应小孔内，每孔100μL。在室温静置30min，弃去孔内液体，用PBS洗三次，每次3min。加酶标抗小鼠IgG抗体(1:1000稀释)，每孔100μL。在室温静置30min，弃去孔内液体，用PBS洗三次，每次3min。加显色剂(含0.045％过氧化氢液体和0.05％邻苯二胺的pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液)100μL，室温避光显色10～15min，加终止液。在酶标仪492nm波长处测A值，空白对照调零。若待测孔A值大于或等于阴性对照孔2.1倍，即判为阳性反应。检测结果如表1，表1显示1A3单抗腹水的效价为1×10^-5，2G1单抗腹水的效价为1×10^-4。

表1 单抗腹水效价检测结果表

第二种检测为特异性检测：用包被缓冲液分别将生长抑素(SS)、生长激素(GH)、胰岛素(insulin)、胃泌素(gastrin)稀释为10μg/mL，然后分别加到反应板小孔内，每孔100μL，含相关抗原为1μg。在室温下静置1h，移弃孔内液体，用PBS洗三次，每次3min。分别加1A3和2G1单抗腹水(1:500稀释)在室温下静置30min，移弃孔内液体，用PBS洗三次，每次3min。加酶标抗小鼠IgG抗体(1:500稀释)，每孔100μL。在室温静置30min，弃去孔内液体，用PBS洗三次，每次3min。加显色剂在室温避光显色10～15min，加终止液。在酶标仪492nm波长处测A值，若待测孔A值大于或等于阴性对照孔2.1倍，即判为阳性反应。检测结果：特异性检测结果见表2

表2 单抗腹水特异性检测结果表

从表2中可以看到，1A3和2G1只和SS发生免疫反应，不和GH、insulin、gastrin发生免疫反应。说明1A3和2G1是SS特异性单克隆抗体。

第三种检测为对抗原中和性检测：用包被缓冲液将SS稀释成10mg/mL，然后加到反应板小孔内，每孔100μL，含SS 1μg，在室温下静置1h，移弃孔内液体，分别加1A3和2G1(1:500稀释)在室温静置30min，移弃孔内液体，分别加大鼠抗SS抗体(1:500稀释)和兔抗SS抗体(1:500稀释)在室温静置30min，移弃孔内液体，用PBS洗3次，每次3min，分别加酶标羊抗兔IgG和羊抗大鼠IgG抗体，(1:500稀释)，在室温静置30min,移弃孔内液体，用PBS洗3次，每次3min。加显色剂在室温避光显色10～15min，加终止液，在ELISA仪测吸光值(A值)如果待测孔内的A值大于或等于阴性对照孔2.1倍，即判为阳性反应，用PBS取代1A3和2G1作对照，设5个重复孔。

检测结果：结果见表3。

表3 单抗对SS免疫中和试验结果表

表3显示，SS经和1A3和2G1反应后，其和兔抗SS及大鼠抗SS抗体的免疫反应受到了外常显著抑制，说明1A3和2G1是SS中和性抗体，它们可用以再免疫动物制备SS抗独特型抗体。

步骤6：根据所述步骤5中获得的所述中和性单克隆抗体，制备所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物。

进一步的，在所述步骤6中，包括：采用PBS缓冲液将所述中和性单克隆抗体按照1：1进行稀释，将10mgBSA溶解至1mL蒸馏水中；将10mg/mL的BSA和稀释后的所述中和性单克隆抗体混合搅匀，边搅拌边滴加1mL 2.5mL/L的戊二醛溶液，滴加完后，继续搅拌10～15min，室温下静置第四预设时间后稀释至10mL，获得所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物。

具体而言，在对SS mAb1免疫原复合物的制备时，具体过程为：用PBS缓冲液(PH7.0)将SS mAb1(1A3)腹水按1：1稀释，将10mgBSA溶解到1mL蒸馏水中，用蒸馏水将戊二醛稀释成为2.5mL/L的溶液。将10mg/mL的BSA和稀释后的1A3混合搅匀，然后边搅拌边滴加1mL 2.5mL/L的戊二醛溶液，滴加完后，继续搅拌10～15min,室温下静置第四预设时间，其中，第四预设时间为2～3h，让其继续反应2～3h。即成SS mAb1免疫原复合物。稀释至10mL，平均分成10管，置-20℃冰箱保存备用。其中，牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。

步骤7：采用所述步骤5中获得的所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物和不完全弗氏佐剂混合，按照第四预设条件对产蛋鸡进行免疫后，获得所述产蛋鸡的生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品。

进一步的，在所述步骤7中，包括：在第五预设时间后，对所述产蛋鸡进行筛选，判断所述产蛋鸡的鸡蛋中蛋黄是否具有生长抑素抗独特型卵黄抗体且所述生长抑素抗独特型卵黄抗体的效价满足第二预设阈值；当满足时，在第六预设时间后，采集所述产蛋鸡的鸡蛋，并采用人工或机器分离蛋黄；对所述蛋黄进行卵黄组织破碎和杂蛋白去除后，获得所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品。

具体而言，在得到SS mAb1免疫原复合物之后，接着即可进行免疫，具体的：用PBS将1管SS mAb1(1A3)免疫原复合物稀释至2.5mL，再和等体积不完全弗氏佐剂混合乳化，第四预设条件具体为：肌肉注射免疫10羽产蛋鸡，每羽0.5mL，含SS mAb1 20μg，共免疫3～4次，间隔7～10天；进一步的，是对高价免疫鸡的筛选：在免疫第五预设时间时间后，其中，第五预设时间为第2次免疫后第3～5天，采集各产蛋鸡当天的鸡蛋，用ELISA检测其蛋黄是否含有SS抗独特型卵黄抗体及效价。如果有SS抗独特型卵黄抗体且效价值满足第二预设阈值要求，其中，第二预设阈值为效价达1×10^-4以上，则说明该产蛋鸡可以被定为高价免疫鸡；进一步的，是高价免疫鸡蛋的采集：在经过第六预设时间后，其中，第六预设时间为第3次免疫后第3天，开始采集高价免疫鸡的鸡蛋，连续采集20d，20d后，如需要，再追加免疫1次，然后继续采集20d。直到产蛋鸡被淘汰；接着，即可进行卵黄分离与保存：将鸡蛋经自来水洗净，再利用700mL/L的酒精浸泡10min杀菌消毒，捞出传入洁净间晾干。最后利用人工或机器分离蛋黄。分离的蛋黄如不马上制备卵黄抗体，可置-20℃保存，可保存6个月；进一步的，是卵黄组织的破碎以及杂蛋白去除：用破壁机或高压均质机(60pa)破碎卵黄组织，然后加15～35倍蒸馏水，搅拌均匀；用盐酸和氢氧化钠调节卵黄液pH值至5.2～6.0，使卵黄液产生混浊沉淀，置4～8℃过夜，使杂蛋白沉淀，第二天吸取上清液，底部混浊部分经3500～4000rpm离心20～30min，取上清，将两部分上清混和，经微孔滤膜(0.4μm)过滤，进一步去除杂蛋白和脂肪。收集滤液，即成SS抗独特型卵黄抗体粗制品。

步骤8：对所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，获得所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品。

进一步的，在所述步骤8中，包括：根据所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品的体积加入50％～60％冷酒精，搅拌、离心后获得第一沉淀物；向所述第一沉淀物中加入蒸馏水，以使第一混合液的体积与所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品的体积保持一致，加入冷酒精，使其体积达到所述第一混合液体积的25％～30％，搅拌、离心后获得第二沉淀物；向所述第二沉淀物中加入蒸馏水，以使第二混合液的体积与所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品的体积保持一致，加入冷酒精，使其体积达到所述第二混合液体积的20％～25％，搅拌、离心后获得所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品。

具体而言，用冷酒精沉淀法纯化SS抗独特型卵黄抗体，具体的操作程序为：第一次按卵黄抗体的体积加入50％～60％冷酒精(－20℃)充分搅拌使其沉淀，经4000rpm离心20～30min，取沉淀物，加蒸馏水恢复到卵黄抗体原来的体积。再加冷酒精，使其体积达到卵黄抗体液体积的25％～30％。充分搅拌使其沉淀，同上离心取沉淀物。加蒸馏水使其体积恢复到原卵黄抗体溶液的体积。再加冷酒精，使其达到卵黄抗体液体积的20％～25％，充分搅拌使其沉淀，同上离心取沉淀物，沉淀物子37℃温箱烤干或加适量蒸馏水使其溶解，即成固体或液体的SS抗独特型卵黄抗体的精制品。

步骤9：依次对所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品进行效价检测、特异性检测、竞争抑制试验、诱导异种动物产生生长抑素抗体试验以及对不同癌细胞株体外抑制作用试验。

具体而言，对抗独特型卵黄抗体检测，包括：效价检测、特异性检测、竞争抑制试验、诱导异种动物产生生长抑素抗体试验以及对不同癌细胞株体外抑制作用试验。具体如下：

效价检测：采用间接ELISA检测SS抗独特型卵黄抗体的效价，具体程序为：用包被缓冲液将兔抗SS抗体稀释为1:500，然后包被到ELISA反应小孔内，每孔100μL，在常温下静置1h，弃去孔内液体，用PBS洗3次，每次3min。用PBS将抗独特型卵黄抗体进行10倍系列稀释，共稀释10级，分别加到包被孔内，每级加2个重复孔，对照组加PBS，每孔100μL。在常温下静置30min,弃去孔内液体，用PBS洗3次，每次3min。加酶标山羊抗IgY抗体(1:1000)，每孔100μL。在常温下静置30min，弃去孔内液体，用PBS洗3次，每次3min。加显色剂，在常温避光显色10～15min，加终止液，在酶标仪492nm波长下测吸光度(A)值。待测孔A值大于或等于对照孔2.1倍，即为阳性反应。

检测结果：SS抗独特型卵黄抗体的效价见表4，表4显示，SS抗独特型卵黄抗体的效价为1×10^-5。

表4 SS抗独特型卵黄抗体效价检测结果表

特异性检测：采用间接ELISA检测SS抗独特型卵黄抗体的特异性，具体方法如下：分别用兔抗SS抗体、兔抗GH抗体、兔抗gastrin抗体、兔抗insulin抗体(均为1:500稀释)包被反应小孔，每孔100μL，在常温下静置1h，洗涤程序同上，然后加1:1000稀释的SS抗独特型卵黄抗体，在常温下静置30min,后续程序同5.1。检测结果：SS抗独特型卵黄抗体特异性检测结果见表5，表5显示，SS抗独特型卵黄抗体和兔抗SS抗体呈免疫反应阳性，但和兔抗GH抗体、兔抗gastrin抗体、兔抗insulin抗体呈免疫反应阴性。

表5.SS抗独特型卵黄抗体特异性检测结果表

竞争抑制试验：采用间接ELISA法作竞争抑制试验。具体程序为：用SS mAb1(1A31:1000)包被反应小孔，加SS(10μL/mL)孵育30min，加抗独特型卵黄抗体(1:1000)，加酶标山羊抗IgY抗体(1:1000)，加显色剂(含0.045％过氧化氢液体和10～20mg邻苯二胺的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液)显色，用PBS取代SS做对照，检测两组ELISA反应的A值，计算出均值，标准差及差别的显著性意义。

检测结果为表6，从表6中可以看到：SS能显著抑制SS抗独特型卵黄抗体和SS mAb1(1A3)的结合，实验组A值为0.565±0.01，对照组A值为1.310±0.02，两者差别具有显著性意义(P<0.05)。说明SS抗独特型卵黄抗体具有SS的免疫功能，带有SS内影像可作SS使用。

表6.竞争抑制试验结果

SS抗独特型卵黄抗体能诱导异种动物产生SS抗体：用动物实验，了解SS抗独特型卵黄抗体能否诱导小鼠产生SS特异性抗体，具体方法如下：雄性昆明鼠10只，体质量10～15g，分成两组：实验组5只，每只皮下注射免疫SS抗独特型卵黄抗体和不完全弗氏佐剂混合液0.5mL，(含SS抗独特型卵黄抗体3.2μg)，隔周免疫1次，共免疫3次。对照组免疫等量PBS和不完全弗氏佐剂混合液，第三次免疫后第7～8天，剪尾取血，离心取血清，用ELISA检测两组血清与SS的免疫反应。程序如下：用SS(1μg/孔)包被反应小孔，分别加两组血清(1:500)，加酶标山羊抗小鼠IgG抗体，加显色剂，检测ELISA反应A值，计算出均值，标准差及两组差别显著性意义。

ELISA反应结果如表7显示。

表7.SS卵黄Ab2诱导小鼠产生SS特异性抗体

SS抗独特型卵黄抗体免疫小鼠后，其血清中ELISA反应的A值为1.330±0.102，对照组A值为0.103±0.002。实验组A值较对照组有显著性意义差别(P<0.01)。

SS抗独特型卵黄抗体对不同癌细胞株体外抑制作用试验：癌细胞如表8所示。

表8.癌细胞类型

用MTT法检测SS抗独特型卵黄抗体对各种癌细胞株体外抑制作用。具体方法如下：将各株癌细胞进行扩增培养，待其达到对数生长期，将癌细胞从培养瓶吹打下来，把细胞浓度调至5×10⁴/mL，将以上浓度的癌细胞加到96孔培养板的小孔内，每孔100μL，含细胞数约5000个，将抗独特型卵黄抗体分成3个梯度即30μL、50μL、100μL，分别加到有癌细胞的小孔内，每个梯度加5个重复孔，不足100μL的用无菌生理盐水或PBS补足100μL，对照组5个重复孔，每孔加100μL无菌生理盐水或PBS，将培养板置CO₂孵箱培养36小时，将培养板取出，移弃孔内液体，加入新鲜培养液100μL，然后加10μL MTT，置CO₂孵箱孵育4小时，将培养板取出，每孔加50μL DMSO，吹打充分混匀，在37℃孵育10分钟。在镜下观察蓝色结晶体完全溶解后，在ELISA仪490nm波长处测A值，计算各组A值，均值及标准差，及两组相差的显著性意义，计算公式为：

检测结果：MTT检测结果如表9所示，各组例数n＝5，从表9中可以看到：SS抗独特型卵黄抗体不同剂量对各种癌细胞均有不同程度抑制作用，剂量100μL抑制率非常显著，达37％～57％。

表9.SS抗独特型卵黄抗体体外抑癌试验(MTT法)

因此，本实施例中的SS抗独特型卵黄抗体资源丰富、制备简便、产量高成本低；抗独特型卵黄抗体性能稳定、耐酸碱、耐高温，进入人体后不易被分解失效；抗独特型卵黄抗体注射、口服都能发挥较好效果，应用途径多样，推广更方便。

本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下一种或多种技术效果：

在本发明实施例提供的一种人生长抑素抗独特型卵黄抗体的制备方法，所述方法包括：步骤1：制备生长抑素免疫原；步骤2：制备生长抑素多克隆抗体；步骤3：采用所述步骤1中获得的所述生长抑素免疫原和不完全弗氏佐剂混合，按照第一预设条件对小鼠进行免疫后，获得所述小鼠脾细胞；步骤4：培养扩增小鼠骨髓瘤细胞，将所述小鼠脾细胞与所述小鼠骨髓瘤细胞按照第二预设条件进行细胞融合，获得杂交瘤细胞；步骤5：当融合后的杂交瘤细胞满足第三预设条件时，将所述杂交瘤细胞进行培养，获得单克隆抗体，并筛选出中和性单克隆抗体；步骤6：根据所述步骤5中获得的所述中和性单克隆抗体，制备所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物；步骤7：采用所述步骤5中获得的所述中和性单克隆抗体的免疫原复合物和不完全弗氏佐剂混合，按照第四预设条件对产蛋鸡进行免疫后，获得所述产蛋鸡的生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品；步骤8：对所述生长抑素抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，获得所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品；步骤9：依次对所述生长抑素抗独特型卵黄抗体精制品进行效价检测、特异性检测、竞争抑制试验、诱导异种动物产生生长抑素抗体试验以及对不同癌细胞株体外抑制作用试验，从而解决了现有技术中的基因重组表达SS和人工合成SS类似物分子量小，稳定性差，进入机体后容易被分解失效，半衰期很短，用药途径单一，取材和应用范围受到限制的技术问题，达到了取材更容易，资源更丰富，研发和制备简便，成本低，性能稳定，应用途径多样的技术效果。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。