石榴种质化学离体保存方法
阅读说明：本技术 石榴种质化学离体保存方法 (Chemical in-vitro preservation method for pomegranate germplasm ) 是由 钱晶晶 王宁 于 2021-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了石榴种质化学离体保存方法,方法步骤如下：S11：将石榴组培苗切段,每段包含2-3个生长点；S12：配置WPM+IBA 0.5-0.7mg·L～(-1)+琼脂6g·L～(-1)+蔗糖20-30g·L～(-1)+多效唑5-9mg·L～(-1)培养基；S13：将S11中切段后的石榴组培苗接种到S2中的培养基,并置于培养室内变温保存。本发明石榴种质离体保存打破了常规石榴保存因自然灾害而出现的品种或种质丢失的困境,也可以在实际工业化大规模生产上,将不繁殖品种进行储存备用,在需要时直接扩繁,极适合企业工厂化育苗及科学研究,此外本发明打破木本果树由于褐化、极易木质化等问题带来的种质离体保存为零的研究状态,很好的克服了在离体保存过程中出现的褐化问题,显著地提高了离体保存时间,在保存180d时仍可保证组培苗100％的存活率。(The invention discloses a chemical in-vitro preservation method of pomegranate germplasm, which comprises the following steps: s11: cutting pomegranate tissue culture seedlings into sections, wherein each section comprises 2-3 growing points; s12: the WPM + IBA is prepared into 0.5-0.7 mg.L ‑1 + agar 6 g. L ‑1 + sucrose 20-30 g.L ‑1 + paclobutrazol 5-9 mg. L ‑1 A culture medium; s13: and inoculating the pomegranate tissue culture seedlings cut into sections in the S11 to a culture medium in the S2, and placing the pomegranate tissue culture seedlings in a culture room for temperature-changing storage. The method breaks the dilemma of variety or germplasm loss caused by natural disasters in the conventional pomegranate germplasm in vitro preservation, can also store the non-propagated variety for later use in actual industrialized large-scale production, directly expands and propagates the non-propagated variety as required, is extremely suitable for industrial seedling culture and scientific research of enterprises, breaks the research state that the germplasm in vitro preservation of woody fruit trees is zero due to the problems of browning, easy lignification and the like, well overcomes the browning problem in the in vitro preservation process, remarkably improves the in vitro preservation time, and can still ensure the survival rate of 100 percent of tissue culture seedlings when preserved for 180 days.)
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及石榴种质化学离体保存方法。
背景技术
离体保存是在组织培养技术基础上建立起来的种质资源保存方法，是植物种质资源遗传多样性的一种新兴途径，它不仅可以使组织培养苗保存周期延长，避免了继代过度频繁，节约了土地、劳动力和财力等成本，并且不受各种病虫害、自然灾害的影响，保持了组培苗品质优异和不易退化的优良特性。是种质收集、育种和工业化生产的重要研究手段之一。
目前对于石榴的离体保存来说，存在的最大问题在于其多酚含量较高，在保存过程中极容易出现褐化的现象，从而影响石榴种质离体保存的存活率。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了石榴种质化学离体保存方法，有效地抑制了石榴种质离体保存过程中的褐化问题，延长了保存周期。
本发明提出的石榴种质化学离体保存用培养基，所述培养基为：WPM+IBA0.5-0.7mg·L-1+琼脂6g·L-1+蔗糖20-30g·L-1+多效唑5-9mg·L-1。
本发明提出的石榴种质化学离体保存方法，方法步骤如下：
S11：将石榴组培苗切段，每段包含2-3个生长点；
S12：配置上述培养基；
S13：将S11中切段后的石榴组培苗接种到S12中的培养基，并置于培养室内变温保存。
优选地，所述培养基的pH为6.3-6.7。
优选地，所述培养基接种前进行高压灭菌，温度120-122℃、时间15-25min。
优选地，所述S13中变温保存的条件为：湿度50-80％、光照强度2000-5000Lx、光照周期16L:8D，且光照条件下的温度为23-27℃、避光条件下的温度为14-18℃。
优选地，所述S11中石榴组培苗经驯化处理以使其在离体保存中不产生褐化现象。
优选地，所述石榴组培苗驯化处理的方法步骤如下：
S21：配置包含活性炭的用于石榴组培的培养基；
S22：选取无病、无虫害的石榴枝条进行茎尖脱毒接种至S21中的培养基；
S23：每30-40d继代一次，继代1-2次后得驯化后的不产生褐化的石榴组培苗。
优选地，所述S21中培养基为WPM+IBA 0.5-0.7mg·L-1+琼脂6g·L-1+蔗糖20-30g·L-1+活性炭0.6-1.2g·L-1。
优选地，每次继代的新培养基中活性炭的添加量降低0.2-0.4g·L-1。
作用机理：
在组织培养中，褐化是由于酚酸类物质在多种氧化酶催化作用下形成醌类，醌类物质通过聚合作用产生有色物质而导致组织呈褐色；这种现象会抑制植物生长或者毒害整个外植体组织，对诱导外植体的脱分化和培养物的再分化产生严重影响，以至对某些植物的组织培养能否取得成功起决定性的作用。尤其是木本植物尤其是果树，其所含分类化合物远高于草本或者藤本类植物，因此，如何减少、抑制这些植物的褐化变成攻克果树组培的主要难关之一。
特别是对于石榴来说，其多酚含量极高，很容易在组培过程中出现褐化的问题，本申请通过对吸附剂和植物生长调节剂的选择，并通过变温进行离体保存，很好的解决了石榴离体保存过程中出现的褐化问题。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果：
(1)石榴离体培养是石榴种苗工业化生长的步骤之一，良好的脱毒效果能够确保石榴种苗的高产，长势一致的种苗能够保证生产中石榴树的统一管理，节省人力、物力，尤其是能够打破石榴依靠扦插繁殖的品种退化的困境。
(2)石榴种质离体保存打破了常规石榴保存因自然灾害而出现的品种或种质丢失的困境，也可以在实际工业化大规模生产上，将不繁殖品种进行储存备用，在需要时直接扩繁，极适合企业工厂化育苗及科学研究。
(3)本申请以石榴为研究样本，打破木本果树由于褐化、极易木质化等问题带来的种质离体保存为零的研究状态，很好的克服了在离体保存过程中出现的褐化问题，显著地提高了离体保存时间，在保存180d时仍可保证组培苗100％的存活率。
附图说明
图1为本发明提出的实施例1离体保存180d后组培苗；
图2为本发明提出的对比例1离体保存180d后组培苗；
图3为本发明提出的对比例2离体保存180d后组培苗。
具体实施方式
本发明中WPM为木本植物用培养基，购自青岛海博生物；IBA(吲哚乙酸)、琼脂、蔗糖、多效唑均为分析纯，购自国药试剂(沪试)。
实施例1
本发明提出的石榴种质化学离体保存方法，方法步骤如下：
S11：将石榴组培苗切段，每段包含2个生长点；
S12：配置WPM+IBA 0.5mg·L-1+琼脂6g·L-1+蔗糖20g·L-1+多效唑5mg·L-1培养基，培养基的pH为6.3，培养基接种前进行高压灭菌，温度120℃、时间15min；
S13：将S11中切段后的石榴组培苗接种到S12中的培养基，并置于培养室内变温保存，具体保存条件为湿度50％、光照强度2000Lx、光照周期16L:8D，且光照条件下的温度为23℃、避光条件下的温度为14℃。
石榴组培苗在离体保存前需进行驯化处理以使其在离体保存中不产生褐化现象，驯化处理的方法步骤如下：
S21：配置WPM+IBA 0.5mg·L-1+琼脂6g·L-1+蔗糖20g·L-1+活性炭0.6g·L-1培养基；
S22：选取无病、无虫害的石榴枝条进行茎尖脱毒接种至S21中的培养基；
S23：每30d继代一次，继代1次后得驯化后的不产生褐化的石榴组培苗，每次继代的新培养基中活性炭的添加量降低0.2g·L-1。
采用上述方案离体保存180d后组培苗存活率仍为100％。
实施例2
本发明提出的石榴种质化学离体保存方法，方法步骤如下：
S11：将石榴组培苗切段，每段包含3个生长点；
S12：配置WPM+IBA 0.7mg·L-1+琼脂6g·L-1+蔗糖30g·L-1+多效唑9mg·L-1培养基，培养基的pH为6.7，培养基接种前进行高压灭菌，温度122℃、时间25min；
S13：将S11中切段后的石榴组培苗接种到S12中的培养基，并置于培养室内变温保存，具体保存条件为湿度80％、光照强度5000Lx、光照周期16L:8D，且光照条件下的温度为27℃、避光条件下的温度为18℃。
石榴组培苗在离体保存前需进行驯化处理以使其在离体保存中不产生褐化现象，驯化处理的方法步骤如下：
S21：配置WPM+IBA 0.7mg·L-1+琼脂6g·L-1+蔗糖30g·L-1+活性炭1.2g·L-1培养基；
S22：选取无病、无虫害的石榴枝条进行茎尖脱毒接种至S21中的培养基；
S23：每40d继代一次，继代2次后得驯化后的不产生褐化的石榴组培苗，每次继代的新培养基中活性炭的添加量降低0.4g·L-1。
采用上述方案离体保存180d后组培苗存活率仍为100％。
实施例3
本发明提出的石榴种质化学离体保存方法，方法步骤如下：
S11：将石榴组培苗切段，每段包含2个生长点；
S12：配置WPM+IBA 0.6mg·L-1+琼脂6g·L-1+蔗糖25g·L-1+多效唑7mg·L-1培养基，培养基的pH为6.5，培养基接种前进行高压灭菌，温度121℃、时间20min；
S13：将S11中切段后的石榴组培苗接种到S12中的培养基，并置于培养室内变温保存，具体保存条件为湿度65％、光照强度3500Lx、光照周期16L:8D，且光照条件下的温度为25℃、避光条件下的温度为16℃。
石榴组培苗在离体保存前需进行驯化处理以使其在离体保存中不产生褐化现象，驯化处理的方法步骤如下：
S21：配置WPM+IBA 0.6mg·L-1+琼脂6g·L-1+蔗糖25g·L-1+活性炭1.0g·L-1培养基；
S22：选取无病、无虫害的石榴枝条进行茎尖脱毒接种至S21中的培养基；
S23：每35d继代一次，继代2次后得驯化后的不产生褐化的石榴组培苗，每次继代的新培养基中活性炭的添加量降低0.3g·L-1。
采用上述方案离体保存180d后组培苗存活率仍为100％，组培苗参照图1所示。
对比例1
该方案与实施例3的区别在于S13中采用恒温保存，保存温度25℃，其余条件均与实施例3相同。
采用上述方案离体保存180d后组培苗存活率仅为81.25％，组培苗参照图2所示。
对比例2
该方案与实施例3的区别在于组培前未进行驯化处理，其余条件均与实施例3相同，组培苗参照图3所示。
采用上述方案离体保存180d后组培苗存活率为0％，在组培过程中均出现褐化的问题。
此外，为了证明采用本申请的石榴种质化学离体保存方法的保存效果，对离体保存180d后的组培苗和驯化后的组培苗移栽90d后对各组培苗的生长量和生根状况进行分析，结果如表1和表2所示。
表1组培苗移栽90d生长量
组别
净高(cm)
地径(cm)
离体保存180d后组培苗
80.3±2.85<sup>a</sup>
15.6±0.41<sup>a</sup>
驯化后的组培苗
80.9±2.93<sup>a</sup>
16.2±0.35<sup>a</sup>
注：表中为平均数±标准差，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
表2组培苗移栽90d生根状况
组别
净高(cm)
地径(cm)
离体保存180d后组培苗
80.3±2.85<sup>a</sup>
15.6±0.41<sup>a</sup>
驯化后的组培苗
80.9±2.93<sup>a</sup>
16.2±0.35<sup>a</sup>
注：表中为平均数±标准差，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
由表1和表2可知，采用本申请的离体保存方法保存180d后的组培苗在炼苗移栽后的净生长量和生根状态均与直接移栽的驯化后的组培苗差异不显著，说明本申请的离体保存方法具有很好的保存效果，打破了常规石榴保存因自然灾害而出现的品种或种质丢失的困境，也可以在实际工业化大规模生产上，将不繁殖品种进行储存备用，在需要时直接扩繁，极适合企业工厂化育苗及科学研究。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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