狗尾草遗传保守性高效离体再生方法
阅读说明：本技术 狗尾草遗传保守性高效离体再生方法 (High-efficiency regeneration method of Setaria viridis genetic conservation in vitro ) 是由 朱木兰 孙婧朗 朱新广 郑珂媛 于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种狗尾草遗传保守性高效离体再生方法,其通过取成熟狗尾草种子消毒后的种子接种至添加2,4-D的MS液体培养基中,液体浅层振荡培养,并得到无菌芽；经过直接不定芽诱导培养和不定芽伸长培养；再经生根培养获得完整的再生植株。本发明从单个芽苗培育至移栽可活的稳定植株,最短仅需35天,能够保持狗尾草的遗传保守性。(The invention discloses a high-efficiency in-vitro regeneration method of Setaria viridis genetic conservation, which comprises the steps of inoculating sterilized seeds of mature Setaria viridis seeds into a MS liquid culture medium added with 2,4-D, carrying out liquid shallow layer oscillation culture, and obtaining sterile buds; performing direct adventitious bud induction culture and adventitious bud elongation culture; then the complete regeneration plant is obtained through rooting culture. The method can keep the genetic conservation of the green bristlegrass in only 35 days from the cultivation of a single bud seedling to the transplantation of a viable stable plant.)
技术领域
本发明涉及植物组培领域，具体涉及狗尾草狗尾草遗传保守性高效离体再生方法。
背景技术
狗尾草(Setaria viridis(L.)Beauv.)又名阿罗汉草、稗子草，主要分布在温带、热带和亚热带地区。狗尾草的抗盐碱、抗干旱等抗逆能力极强(张兰英,陈如珠,李耿光.狗尾草愈伤组织诱导和植株再生[J].植物生理学通讯,1992(06):433)，产量高，同时也是食草动物(马、牛、羊等)的优质饲料为畜牧业发展提供保障。狗尾草属热带C4植物，具有生长周期短，基因组小(赵辉,张丽丽,郭静远,霍姗姗,贺萍萍,夏启玉,符冬妹,郭安平.甘露醇胁迫下模式植物狗尾草种子萌发期抗旱性鉴定与评价指标研究[J].热带作物学报,2017,38(11):2060-2065)，易于种植转化等优点，是研究C4植物光合作用的模型，也是新型转基因模式植物(赵辉,郭静远,孔华,郭安平.狗尾草胚性愈伤高效农杆菌转化体系的建立[J].热带作物学报,2017,38(06):1106-1112.)。如能实现将狗尾草这些优良特性转移到粮食作物(如：水稻)上，必然能够大幅提高粮食作物的产量。而对狗尾草抗性植株进行群体数量的扩大，是实现粮食产量提高的第一步。目前，国内对于狗尾草再生的研究少之又少，主要集中在经由愈伤组织诱导而产生不定芽(赵辉,郭静远,孔华,郭安平.金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子高效遗传转化体系的建立[J].分子植物育种,2017,15(12):4955-4960.)，往往会造成一定量的变异株，影响种苗整齐度。总体来说，目前国内外对于狗尾草组织培养的研究为经过愈伤的间接不定芽再生，再生体系具有遗传不稳定、培养时间长的缺陷。
另外，由于狗尾草种子休眠现象严重，导致发芽率低，提高种子发芽率也是一大难题。贾风勤等人研究得出，5～15℃和10～20℃，黑暗条件下，狗尾草种子萌发率最高，可达49％和45％。(贾风勤,李幼龙,张会群.温度对狗尾草和金色狗尾草植物种子萌发的影响[J].种子,2016,35(04):30-33+43.)。刘金海等人通过交替变温处理将狗尾草种子发芽率提高到70.67％(刘金海,王琰,徐翠,蒋金娟,罗富成,王鹤桦.低温与变温对纳罗克非洲狗尾草种子发芽特性的影响[J].种子,2021,40(01):23-27.)。罗富成等人采用赤霉素(GA3)、吲哚丁酸(IBA)、6-糠氨基嘌呤(6-KT)、乙烯利(ETH)溶液进行浸种处理，其中400mg/L GA3溶液浸种效果最好，发芽率为54％。(罗富成,郭轶敏,彭健,段新慧,许文花,何超,郭凤根.外源激素对纳罗克非洲狗尾草种子休眠的破除效果[J].草业科学,2015,32(03):406-412.)。马向丽等人用200mg/L GA3浸种处理，发芽率达76％，10％PEG渗透处理，发芽率达63％(马向丽,毕玉芬,黄梅,刘倩,樊梅.不同赤霉素和聚乙二醇处理对非洲狗尾草种子萌发和幼苗的影响[J].热带作物学报,2009,30(10):1479-1483.)。陈艳宇等人采用预冷+KNO3处理(20～30℃)条件下达到最高发芽率26％(陈艳宇,曾昌友.野燕麦、金色狗尾草、滇苦荬和田贡蒿野生种子发芽试验[J].四川畜牧兽医,2009,36(10):31-32.)。郭瑞峰等人用800mg/L GA3浸种处理，萌发率达36.67％，采用25％盐酸浸种萌发率达34.00％(郭瑞峰,张建华,关望辉,王慧贤,曹昌林,白文斌.狗尾草种子休眠破除方法研究[J].山西农业科学,2017,45(07):1084-1086.)。可见前人研究中，主要采用GA3、IBA等激素，利用浸种处理的方式促进狗尾草发芽，而且发芽率仍然不高。因此，用传统种植的方法培育，狗尾草种子的萌发率低，耗时较长(冉光富,伍丽仙,陈永玻,罗家喜,罗克江,刘祖文,许艳梅,李娇,熊明波,周裕敬,匡崇义.非洲狗尾草快速繁育技术的研究及应用[J].草学,2020(05):53-56.)。
因此，急需研究狗尾草遗传保守性高效离体再生方法，即狗尾草群体数量快速扩大且遗传保守性又高的方法，以为转基因狗尾草提供支撑。
发明内容
针对现有技术的缺陷和需求，本发明就遗传稳定性和高繁殖系数双重目标开展研究，提出一种狗尾草高效快繁的方法，培育出遗传稳定性高的狗尾草种苗，在短时间内，扩大了狗尾草的群体数量。本发明提供国内外首个狗尾草高效不定芽离体再生方法，为狗尾草转基因抗性株提供最高效快速的群体扩繁方法。
由此，本发明提供一种狗尾草遗传保守性高效离体再生方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外植体材料的制备：取成熟狗尾草种子消毒后的种子接种至添加1-3mg/L 2,4-D的MS液体培养基中，液体浅层振荡培养，并得到无菌芽；
(2)直接不定芽诱导培养：将(1)获得无菌芽接种至不定芽诱导培养基上，产生不定芽；所述不定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，添加1-4mg/L 6-BA与0.1-0.4mg/LNAA；
(3)直接不定芽伸长培养：将(2)获得的不定芽接种至不定芽伸长培养基上，获得伸长的不定芽；所述不定芽伸长培养基使用MS作为基本培养基，添加0-0.5mg/L 6-BA与0-0.09mg/L NAA；
(4)生根培养：将(3)中不定芽诱导出的丛芽分成单株，接种至生根培养基中，进行生根诱导；
任选地，还包括(5)炼苗与移栽的步骤。
具体的实施方式中，第(1)步中的消毒方法是：先使用5‰高锰酸钾溶液处理2min，再使用75％乙醇溶液处理30s，最后使用10％NaClO溶液处理10min。
优选的方式中，第(3)和(4)步中培养条件为20-25℃，光照强度2000-3000lx，光照12h/d。
具体实施方式
，第(4)步中，生根培养基使用1/2MS作为基本培养基，添加1-3mg/L吲哚丁酸(IBA)。
在另一具实施方式中，所述(5)炼苗与移栽的操作方法是：挑选(4)中已生根且长势健壮的瓶苗进行炼苗，炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5-1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2-3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿，移栽后套袋保湿，湿度不够时使用喷壶喷洒植株表面，待苗生长强健后除去套袋，正常养护。
优选地，各步中培养基均添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8。如果液体培养基则不加琼脂粉。
本发明的优势在于：一是，目前国内外对于狗尾草组织培养的研究为经过愈伤的间接不定芽再生，相对于直接不定芽再生，具有遗传不稳定、培养时间长。而本发明从单个芽苗培育至移栽可活的稳定植株，最短仅需35天，能够保持狗尾草的遗传保守性。二是，狗尾草种子发芽时间较长，接种在常规固体培养基中需要25天左右，本发明首次提出采用添加2,4-D的MS培养基中进行液体浅层振荡培养，大幅缩短了发芽时间，仅需7天，从而缩短狗尾草的离体再生的整体时间，尤其是发芽率也大幅提高。三是国内对于狗尾草快速繁殖技术的研究全部集中在种植技术优化的层面，本发明利用组培技术对转基因狗尾草进行群体数量的扩大，大大地缩短育种时间。四是本发明筛选并利用常用的激素的组合，并通过研究获得最佳的激素用量和比例，在简化激素类型降低成本的同时实现狗尾草高效离体再生，为之后狗尾草优良特性转移至粮食作物的研究降低了成本。本发明通过上述各方面的最终达到本发明的技术方案即狗尾草遗传保守性高效离体再生方法。
附图说明
图1本发明采用的起始外植体，bar：1cm；
图2不定芽诱导，bar：1cm；
图3去除顶芽后的不定芽诱导，bar：1cm；
图4不定芽伸长，bar：0.5cm；
图5不定芽生根，bar：2cm；
图6土壤植株建成。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步的阐述，以更好理解本发明。但并不构成对本发明的限制。
(1)外植体材料的制备
取成熟狗尾草种子ME34作为起始外植体，一部分去壳处理，另一部分不去壳处理，先使用5‰高锰酸钾溶液处理2min，再使用75％乙醇溶液处理30s，最后使用10％NaClO溶液处理10min，将消毒后的种子接种至添加0、1、2、3mg/L2,4-D的Murashige&Skoog(MS)液体培养基中，液体浅层振荡培养15d后，统计发芽率。发芽后的种子接种至Murashige&Skoog(MS)固体培养基中，得到起始外植体(图1)。
结果表明，去壳更有助与种子发芽，植物激素2,4-D能够促进种子发芽，相比于常规的固体培养基培养，液体浅层振荡培养能够增加种子和氧气的接触面积，充分供氧。15d统计发芽率，MS+1mg/L 2，4-D中发芽率最高，可达88.33％(表1)，最短7天可发芽。
本发明首次采用添加2,4-D的MS培养基进行液体悬浮培养，大大提高了狗尾草的发芽率，可达88.33％，同时缩短了发芽时间。
表1是否去壳以及不同培养基组合对种子发芽的影响
(2)不定芽诱导培养
将无菌芽转接不定芽诱导培养基上，不定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，分别添加6-BA 1、2、3、4mg/L与NAA 0.1、0.2、0.3、0.4mg/L，共设置16组实验组与1组对照组，对照组添加0mg/L 6-BA+0mg/L NAA。其中，MS培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。25d后统计：增殖率、平均芽数。
结果表明，不同浓度的6-BA和NAA激素组合能诱导狗尾草产生不定芽(表1)。当NAA浓度一定时，随6-BA浓度升高，不定芽增殖率和平均芽数呈现先升后降的趋势，最适6-BA浓度为2-3mg/l。当6-BA浓度一定时，随NAA浓度升高，不定芽增殖率和平均芽数呈现先升后降的趋势，最适NAA浓度为0.2-0.3mg/l。培养7d后，茎基部长出侧芽(图2)，将芽苗的定芽切除，继续进行不定芽诱导培养。25d后统计，2mg/l 6-BA，0.2mg/l NAA不定芽诱导培养基上诱导效果最好，诱导率达到91.11％，平均芽数达到49.33个，植株活力好，不定芽紧密(图3)。综上，6-BA最适浓度范围为2-3mg/l，NAA最适浓度范围为0.2-0.3mg/l，其中2mg/l 6-BA和0.2mg/l NAA激素组合为不定芽诱导培养基最佳激素组合。
表2不同植物激素组合对不定芽诱导的影响
(3)直接不定芽伸长培养
将不定芽诱导培养中的不定芽转接至不定芽伸长培养基上。不定芽伸长培养基使用MS作为基本培养基，分别添加6-BA 0.03、0.07、0.1、0.3、0.5mg/L与NAA 0.01、0.02、0.03、0.05、0.07、0.09mg/L，共设置25组实验组与1组对照组，对照组添加0mg/L 6-BA+0mg/L NAA。其中，MS培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。25d后统计：伸长率。
结果表明，26种6-BA与NAA的不同激素组合促进狗尾草不定芽伸长，当NAA浓度一定时，随6-BA的浓度升高，不定芽伸长率呈现先升后降的趋势。6-BA最适浓度范围为0.03-0.3mg/l，NAA最适浓度范围为0.01-0.05mg/l，其中0.1mg/L 6-BA+0.03mg/L NAA为不定芽伸长诱导培养的最佳激素组合配方。培养15d可观察到芽明显伸长(图4)。
表3不同激素组合对不定芽伸长的影响
(3)生根培养
不定芽诱导出的丛芽分成单株，接种至生根培养基中，进行生根诱导，生根培养基使用1/2MS作为基本培养基，添加0.1-1mg/L IBA，7-10d可生根。IBA0.5mg/L为不定芽生根的最佳激素浓度，7d可生根，生根诱导率达98.5％。15天后，生根条数25-30条(图5)。
(4)炼苗与移栽
将已生根且长势健壮的瓶苗进行炼苗，炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5-1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2-3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿，移栽后套袋保湿，湿度不够时使用喷壶喷洒植株表面，待苗生长强健后除去套袋，正常养护(图6)。1个月后统计成活率，成活率在95％以上。
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