一种无花果愈伤组织的培养方法
阅读说明：本技术 一种无花果愈伤组织的培养方法 (Method for culturing fig callus ) 是由 李静 马梓翔 颜志明 郭正兵 赵庆 魏世平 张旭 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种无花果愈伤组织的培养方法,包括：(1)茎段的无菌化处理：将植物材料带腋芽茎洗净、去枝条、消毒、清洗,将茎段切短,形态学下端接种于培养基上；(2)无花果无菌苗茎段培养：在遮光条件下培养,茎段边缘组织诱导出愈伤组织,将其切下置于继代培养基中培养,体积变为原来的1-2倍,颜色黄白色,备用；(3)筛选最佳的培养基和培养条件。本方法的‘玛斯义·陶芬’愈伤组织的培养方法,诱导率可达90％,为‘玛斯义·陶芬’分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径。(The invention discloses a method for culturing fig callus, which comprises the following steps: (1) and (3) sterile treatment of the stem sections: cleaning axillary bud and stem of plant material, removing branch, sterilizing, cleaning, cutting stem segment, inoculating morphological lower end on culture medium; (2) culturing the stem sections of the aseptic fig seedlings: culturing under shading condition, inducing callus from stem edge tissue, cutting off the callus, culturing in subculture medium until the volume is 1-2 times of the original volume, and keeping yellow and white; (3) screening for optimal medium and culture conditions. The method for culturing the 'Masui-ceramic' callus has the inductivity of 90 percent, and provides a new way for the research of 'Masui-ceramic' molecular biology and genetic engineering.)
技术领域
本发明涉及无花果栽培方法，特别涉及一种无花果愈伤组织的培养方法。
背景技术
无花果果实中富含人体所需的多种氨基酸和矿质元素，兼具药用价值、食用价值和观赏价值。目前无花果的研究多集中于营养价值、果实成熟、花芽分化等方面。在分子生物学层面，可选择拟南芥、烟草等模式植物进行基因功能验证，选择本源植物验证更有利于阐明问题，目前有报道无花果转基因的文章数量较少。因此，在无花果分子生物学研究中，急需探究一条新的方向来完善无花果基因功能验证。在植物分子机理研究方面，愈伤组织是常用的试验材料，同时也是进行基因转化所必需的材料。愈伤组织是指利用离体植物外植体，在人工可控制的条件下，给予适宜的激素环境可分化形成分裂能力旺盛的薄壁细胞，在适宜的条件下，可诱导其分化形成完整的再生植株。愈伤组织是外植体脱分化而形成的，因其具有以下特点而广泛应用于植物分子机理和基因工程研究中。愈伤组织具有的主要特点为：①无性繁殖，保持母本优良性状，繁殖系数高，实现工厂化育苗；②可进行单细胞悬浮培养，分离原生质体进行亚细胞定位、杂交育种等操作；③可进行无性系变异和突变体筛选；④利用工厂化生产的方式，避免季节和气候的影响，长期稳定产生所需次生代谢物；⑤为外源目的基因转化提供便于操作和保存的材料。无花果的果实为隐头花序，外观见果不见花而得名，江苏省果实成熟期可从7月中下旬延续至11月上旬，但由于其果实底部包含有果孔，造成灭菌困难，不适宜用于诱导愈伤组织。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种成功率高的无花果愈伤组织的培养方法。
技术方案：本发明提供一种无花果愈伤组织的培养方法，包括如下步骤：
(1)茎段的无菌化处理：将植物材料带腋芽茎洗净、去枝条、消毒、清洗，将茎段切短，形态学下端接种于培养基上；
(2)无花果无菌苗茎段培养：在遮光条件下培养，茎段边缘组织诱导出愈伤组织，将其切下置于继代培养基中培养，体积变为原来的1-2倍，颜色黄白色，备用；
(3)筛选最佳的培养基和培养条件。
进一步地，所述步骤(1)的植物材料是江苏省‘玛斯义·陶芬’6月底的新梢。
进一步地，所述步骤(1)的消毒方法：在无菌条件下，使用75％的乙醇消毒，无菌蒸馏水冲洗，随后使用2％的次氯酸钠消毒，之后无菌蒸馏水冲洗。
进一步地，所述步骤(3)最佳的培养基配方：诱导无花果茎段愈伤组织的培养基配方：
MS+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(8g/L)，pH值5.8。
进一步地，所述步骤(3)最佳的培养条件：茎段是采用培养1个月之后的幼嫩茎段，诱导愈伤组织时，遮光，温度25℃。
一般江苏省无花果早春4月初即可萌动，至11月底平茬之前均可采摘到带茎段的腋芽，具有采收期长、组织分生能力强旺、乳汁含量较少等优点。本发明中采用带腋芽的茎段为材料，先培育出无花果无菌苗，继而使用其茎段为材料诱导愈伤组织。在此条件下，实验材料的基因型、茎段生理状态能够保持高度一致，减少了试验误差。同时，也避免了多次灭菌外植体，操作费时费工。
本发明方法采用MS培养基为基本培养基，分别按比例配合使用植物生长调节剂6-BA(0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L)和NAA(0.1mg/L、0.3mg/L)附加蔗糖30g/L和琼脂粉8g/L，pH为5.8。无菌苗茎段接种在不同激素浓度配比的培养基上，研究不同激素配比对无花果愈伤组织诱导影响。筛选出的最佳培养基配方。
本发明中，筛选出适宜诱导无花果茎段愈伤组织的培养基配方：
MS+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(8g/L)，pH值5.8
比较适宜的茎段是培养的是培养1个月之后的幼嫩茎段。诱导愈伤组织时，遮光，温度25℃。在这个培养基配方和培养条件下愈伤诱导率可达90％。
MS培养基优选配方：为基本MS培养基，KNO3硝酸钾1900mg/L、NH4NO3硝酸铵1650mg/L、KH2PO4磷酸二氢钾170mg/L、MgSO4硫酸镁370mg/L、CaCl2氯化钙440mg/L、KI碘化钾0.83mg/L、H3BO3硼酸6.2mg/L、MnSO4硫酸锰22.30mg/L、ZnSO4硫酸锌8.6mg/L、NaMo04钼酸钠0.25mg/L、CuSO4硫酸铜0.025mg/L、CoCl2氯化钴0.025mg/L、EDTA-Na2乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、FeSO4硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L。
6-BA：6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素类的物质，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点是组织培养者最喜爱的细胞分裂素。可以诱导愈伤组织发生。本试验中将6-BA配制成1mg/mL的母液供配制培养基使用，添加1.0mg/L的6-BA就能够诱导效果。
NAA：萘乙酸，是类生长素，能够促进芽的形成，能够诱导愈伤组织。本试验中将NAA配制成0.1mg/mL的母液供配制培养基使用，添加0.1mg/L的NAA就能够诱导效果。
蔗糖：蔗糖在植物组织培养基中起到能源物质和渗透调节剂的作用，除供能之外，还能诱导愈伤组织的再分化，使用工业生产的分析纯的蔗糖。在本试验中，蔗糖都是添加30g/L。
琼脂粉：琼脂粉在培养基中主要的作用是固定支撑的作用。一般使用纯度较高，没有杂质的琼脂粉。在本试验中，琼脂的浓度为8g/L。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
本专利的‘玛斯义·陶芬’愈伤组织的培养方法，诱导率可达90％，为‘玛斯义·陶芬’分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径，为无花果基因工程研究和基因转化提供一种新的试验材料，同时也为无花果愈伤的培养提供了参考和借鉴。
具体实施方式
本实施例的无花果愈伤组织的培养方法，包括如下步骤：
1试验材料
所用植物材料是江苏省‘玛斯义·陶芬’6月底的新梢。
2试验方法
2.1茎段的无菌化处理
将带腋芽茎段蒸馏水轻柔洗净，去除运输过程中有损伤的枝条。在无菌条件下，使用75％的乙醇消毒30s，使用无菌蒸馏水冲洗3-5次去除残余酒精，随后使用2％的次氯酸钠7min，之后使用无菌蒸馏水3-5次去除残留次氯酸钠。将材料放置在无菌滤纸上吸干多余水分，使用无菌器械轻柔剥去芽体上的苞片，将茎段切成1cm长短，形态学下端接种于培养基上。
2.2无花果无菌苗茎段培养
在遮光条件下，25℃培养30天后，茎段边缘组织可诱导出愈伤组织，将其切下置于继代培养基中，30天左右，其体积可变为原来的1-2倍，颜色黄白色，可用于后续试验。
3培养基配方筛选过程
(1)将无花果‘玛斯义·陶芬’带腋芽的茎段消毒并获得无菌苗。利用生长1个月，长1cm的茎段接种于添加MS+6-BA(0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L)+NAA(0.1mg/L、0.3mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(8g/L)培养基pH值5.8，研究不同配比的植物生长调节剂对‘玛斯义·陶芬’愈伤组织培养的影响。
(2)将茎段接种于培养基MS+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂粉(8g/L)培养基pH值5.8的培养基上，一部分完全遮光，一部分在光照条件下，研究光照对‘玛斯义·陶芬’愈伤组织诱导的影响。
4茎段愈伤组织质量评价指标
愈伤组织的质量好坏，有几个评价指标：
(1)愈伤组织大小
以茎段诱导培养30天的愈伤组织为准，测量不同培养基和不同培养条件下诱导愈伤组织的大小，愈伤组织的直径小于3mm为不合格愈伤组织，直径大于3mm合格。
(2)愈伤组织的色泽
生活力旺盛的愈伤组织应该为黄白色，无水渍化现象，组织颗粒致密，有明显的表层致密层结构。
(3)愈伤组织的再分化能力
愈伤组织分化能力好坏取决于大小、色泽适中则分化能力强，分化出的愈伤组织也有较高的质量。
5试验结果
表1不同的激素配比对‘玛斯义·陶芬’茎段愈伤组织的诱导的影响
从试验结果可以得知，培养基中添加6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)时，诱导出的愈伤组织大小适中、颜色黄白色，组织分化能力强，愈伤组织诱导率达到90％，是本试验条件下最佳的茎段愈伤组织诱导激素配比。
表2光照对‘玛斯义·陶芬’茎段愈伤组织的诱导的影响
在遮光条件下，诱导‘玛斯义·陶芬’茎段得到的愈伤组织色泽、分化能力等方面均显著优于光照条件。因此，诱导‘玛斯义·陶芬’愈伤组织在遮光条件下效果更好。
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