用于分子传感器的结合探针电路
阅读说明：本技术 用于分子传感器的结合探针电路 ([db:专利名称-en]) 是由 巴瑞·L·迈瑞曼 文卡泰什·A·高文达拉什 保罗·莫拉 蒂姆·吉索 吉娜·科斯塔 于 2018-04-25 设计创作，主要内容包括：在各个实施例中,公开了一种分子电路。该电路包括负电极、与负电极间隔开的正电极、以及导电地附接至正电极和负电极两者从而形成具有通过结合探针的导电通路的电路的结合探针分子。在各个示例中,结合探针是抗体、抗体的Fab结构域、蛋白质、核酸寡聚物杂交探针、或适体。电路还可包括用于将结合探针接线至电极的分子臂。在各个实施例中,电路用作传感器,其中在靶标与结合探针相互作用时测量电信号,诸如电路中的电压、电流、阻抗、电导率或电阻的变化。在各个实施例中,电路提供一种用于测量溶液中分析物的存在、不存在或浓度的手段。([db:摘要-en])
对相关申请的引用
本申请要求于2017年5月9日提交的名称为“用于分子传感器的结合探针”的美国临时专利申请62/503,812的优先权和权益，该临时专利申请的公开内容通过完整引用结合在此。
技术领域
本公开总体涉及分子传感器，更具体地说，涉及一种在其中由结合探针闭合两个电极之间的电路的分子传感器。
背景技术
在二十世纪七十年代，艾维拉姆和拉特纳带来了分子电子学的广阔领域。分子电子学通过使用单个分子作为电路元件实现了电路的终极缩小。根据分子的性质，包含单分子元件的分子电路可用作开关、整流器、致动器和传感器。特别令人感兴趣的是这种电路作为传感器的应用，其中分子相互作用为单分子传感提供了基础。尤其是，信息性的电流变化可包括电流的增大或减小、脉冲、或其他时间变化。
虽然在分子电子学领域取得了不少成就，但仍需要可用作分子传感器的新分子电路。尤其是，仍需要一种改良的单分子系统，这种系统能够产生具有更大信噪比的分子信息，从而使真正表示分子相互作用的信号与非信息性噪声区分开来。
发明内容
在多个实施例中，公开了一种基于单分子结合探针的电路，其中单个结合探针分子直接连接至正电极和负电极以形成电路。这些电路能够产生高度信息性的结合活性信号。这些改良信号具有更高的信噪比水平，因此信号与噪声之间的区别更大，并且这些改良信号包括携带关于结合探针与靶标结合配偶之间的接合的详细信息的特征。
在多个实施例中，一种分子传感器包括如本文所述的基于结合探针的分子电路(导电通路)。这样的传感器可用于感测靶标与结合探针的结合，从而确定在给定的测试溶液中存在靶标。这提供了在测试溶液中使用这种传感器检测靶标分子的存在或不存在或者获得靶标分子浓度信息的基础。因此，靶标分子与结合探针活性位点的结合被感测为电路中的电气变化，例如电路中的电压、电流、阻抗、电导率或电阻的变化。
在本公开的多个实施例中，公开了一种分子电路。该电路包括：正电极；与正电极隔开的负电极；以及连接至正电极和负电极从而在正电极与负电极之间形成导电通路的结合探针。
在多个方面中，该电路的结合探针可包括连接至正电极的第一接线点和连接至负电极的第二接线点。
在多个方面中，该电路还可包括至少一个具有两个端部的臂分子，其中一端与结合探针结合，而另一端与该电极中的至少一个结合，其中该至少一个臂分子作为该结合探针与该电极中的至少一个之间的电线。
在多个方面中，该至少一个臂分子可选自由双链寡核苷酸、肽核酸双链体、肽核酸-DNA杂交双链体、蛋白质α螺旋、类似石墨烯的纳米带、天然聚合物、合成聚合物和抗体Fab结构域组成的组。
在多个方面中，该电极中的至少一个连接至结合探针的内部结构元件。
在多个方面中，该内部结构元件可选自由α螺旋、β褶板和串联的多个这种元件组成的组。
在多个方面中，该电极中的至少一个可在结合探针的能够发生构象变化的位置连接至结合探针。
在多个方面中，至少一个臂分子可包括具有取决于张拉(tension)、扭曲(twist)或扭转(torsion)的电导率的分子。
在多个方面中，该结合探针可从结合探针中的不止两个位置连接至正电极和负电极。
在多个方面中，该结合探针可包括抗体Fab结合结构域。
在多个方面中，该结合探针可包括适体。
在多个方面中，该结合探针可包括核酸寡聚物杂交探针。
在多个方面中，一种分子传感器包括电路，该电路进一步包括：正电极；与正电极隔开的负电极；以及结合探针，该结合探针包括连接至正电极和负电极从而在正电极和负电极之间形成导电通路的抗体Fab结合结构域，其中该传感器可用于感测关于在测试溶液中是否存在对应的抗体抗原或该抗体抗原的浓度的信息。
在多个方面中，一种分子传感器包括电路，该电路进一步包括：正电极；与正电极隔开的负电极；以及结合探针，该结合探针包括连接至正电极和负电极从而在正电极和负电极之间形成导电通路的适体，其中该传感器可用于感测关于在测试溶液中是否存在该适体的靶标分子或该靶标分子的浓度的信息。
在多个方面中，一种分子传感器包括电路，该电路进一步包括：正电极；与正电极隔开的负电极；以及结合探针，该结合探针包括连接至正电极和负电极从而在正电极和负电极之间形成导电通路的核酸寡聚物杂交探针，其中该传感器可用于感测关于在测试溶液中是否存在靶标DNA或RNA分子或该靶标DNA或RNA分子的浓度的信息。
在多个方面中，包括抗体Fab结合结构域、适体或核酸寡聚物杂交探针的结合探针可被改造为具有额外的电荷基团，在结合探针与靶标接合时，该额外的电荷基团可变地影响导电通路。
在多个方面中，一种电路包括：正电极；与正电极隔开的负电极；以及连接至正电极和负电极从而在正电极与负电极之间形成导电通路的结合探针，该结合探针与正电极和负电极中的至少一个之间的连接可包括天然半胱氨酸、基因工程半胱氨酸、具有接合残基的基因工程氨基酸、或包括具有接合配偶的肽的基因工程肽结构域中的至少一种。
在多个方面中，本文公开的分子电路还可包括栅电极。
在多个方面中，一种用于检测溶液中的分析物浓度的方法包括：提供电路，该电路包括正电极、与正电极隔开的负电极、以及连接至正电极和负电极从而在正电极与负电极之间形成导电通路的能够与分析物结合的结合探针；引发通过该电路的电压或电流中的至少一种；使该电路暴露于溶液一段时间；并且在测量探针与分析物接合时测量该电路中的电信号，其中对该电信号进行处理以识别提供关于溶液中的分析物浓度的信息的特征。
在多个方面中，一种分子检测方法包括：提供电路，该电路包括正电极、与正电极隔开的负电极、以及连接至正电极和负电极从而在正电极与负电极之间形成导电通路的结合探针；引发通过该电路的电压或电流中的至少一种；使该电路暴露于以下至少一种条件：降低的离子强度的缓冲液、在主电极上施加的特定电压、栅电极电压、或施加至主电极或栅电极的电压谱或扫描；以及测量该电路中的电气变化。
附图说明
在说明书的总结部分中特别指出并明确要求保护本公开的主题。但是，通过结合附图参阅详细说明和权利要求，能够最佳地获得对本公开的更全面的理解，在附图中：
图1示出了分子电子电路的一般概念；
图2示出了结合探针与分子电子电路接合(例如与其靶标接合) 作为结合探针传感器的一般概念；
图3示出了多个实施例的直接接线至电流路径的结合探针；
图4示出了多个实施例的直接接线至电流路径的结合探针，其中该连接是连接至结合探针中的内部α螺旋结构；
图5示出了多个实施例的直接接线至电流路径的结合探针，其中该连接是连接至结合探针中串联的两个或更多内部α螺旋结构；
图6示出了多个实施例的直接接线至电流路径的结合探针，其中该连接是连接至结合探针中的内部β褶板结构；
图7示出了直接接线至电流路径的结合探针，其中该连接是连接至结合探针中的构象变化点，以在结合活性期间在电路中引起张力变化；
图8示出了直接接线至电流路径的结合探针，其中形成了附加连接，以稳定探针的位置；
图9示出了多个实施例的直接接线至电路的电流路径的结合探针的示意图，其中该探针直接耦合至电极，而不使用臂分子；
图10示出了多个实施例的通过两个接触点直接接线至电路的结合探针的示意图，并且该结合探针还具有与分子线的单点接合，从而利用一对电极来测量联合传导；
图11示出了多个实施例的通过两个接触点直接接线至电路的结合探针的示意图，并且该结合探针还具有与分子线的单点接合，从而利用两对电极来独立地测量这两个传导模式；
图12示出了抗体Fab片段结合探针的探针结构图及其溶菌酶蛋白结合靶标，示出了α螺旋、β褶板和连接环结构的存在；
图13示出了多个实施例的直接接线至电路的电流路径的Fab结合探针的示意图，其中特定的β褶板用于接触点，并且分子臂实现与电极的耦合；
图14示出了多个实施例的直接接线至电路的电流路径的Fab结合探针的示意图，其中特定的β褶板用于接触点，并且该探针直接耦合至电极，而不使用臂分子；
图15示出了多个实施例的直接接线至电路的电流路径的Fab结合探针的示意图，其中臂接线至当Fab与其靶标表位结合时发生相对运动的点；
图16示出了直接接线至电路的电流路径的Fab结构域的示意图，并且其中连接有附加的连接臂，以实现稳定化和固定的空间取向；
图17示出了多个实施例的直接接线至电路的电流路径的完整IgG抗体分子的示意图，其中特定的β褶板用于接触点，并且分子臂实现与电极的耦合；
图18示出了多个实施例的直接接线至电流路径的结合探针，其中该结合探针包括与靶标结合的线形分子，并且臂连接在该线形分子的末端处或末端附近；以构成与电极连接的电路；
图19示出了多个实施例的直接接线至电流路径的结合探针，其中该结合探针包括与靶标结合的线形分子，并且电极直接连接在该线形分子的末端处或末端附近；
图20示出了多个实施例的直接接线至电流路径的适体结合探针，其中所示的适体是单链DNA或RNA或其他的类似XNA核酸的寡聚物，并且该臂连接在该线形分子的末端处或末端附近，以构成与电极连接的电路；
图21示出了多个实施例的直接接线至电流路径的适体结合探针，其中该适体是单链DNA或RNA或XNA，并且电极直接连接在该线形分子的末端处或末端附近；
图22示出了多个实施例的核酸杂交结合探针分子的示意图，该核酸杂交结合探针分子由单链RNA或DNA或其他的类似XNA核酸的寡聚物组成，并直接接线至电路的电流路径，其中该单链的末端处或末端附近的位点与分子臂接合，该分子臂实现与电极的耦合；
图23示出了多个实施例的核酸杂交结合探针分子的示意图，该核酸杂交结合探针分子由单链RNA或DNA或其他的类似XNA核酸的寡聚物组成，并直接接线至电路的电流路径，其中该单链的末端处或末端附近的位点直接接合至电极；和
图24示出了一种使用结合探针传感器电路进行浓度测量的方法，其中N个传感器实例暴露于测试溶液并检测靶标，并对结果进行统计，以获得浓度的相关性。
具体实施方式
在此参照附图对示例性实施例进行详细说明，这些附图以示意性方式示出了示例性实施例以及其最佳模式。虽然对这些示例性实施例的说明足够详细，能使本领域技术人员实践在此详述的发明，但是应理解，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，还可实现其他实施例，并且可做出逻辑、化学和机械变化。因此，在此给出的详细说明仅是出于示例性目的，而不是限制性的。例如，除非另有说明，否则在任何方法或过程说明中叙述的步骤可按任何顺序执行，并且不必受限于所给出的顺序。此外，对单数的任何引用包括多个实施例，并且对不止一个部件或步骤的任何引用可包括单个实施例或步骤。而且，对附接、固定、连接等的任何引用可包括永久的、可移除的、临时的、部分的、完全的和/或任何其他可能的附接方案。另外，对无接触(或类似短语)的任何引用也可包括减少接触或最少接触。
在本公开的多个实施例中，公开了一种分子电路。该分子电路包括：正电极；与正电极隔开的负电极、以及连接至正电极和负电极从而在正电极与负电极之间形成导电通路的结合探针。在多个示例中，该结合探针包括连接至正电极的第一接线点和连接至负电极的第二接线点。
定义和解释
在本文所用的术语“结合探针”指以特定方式与另一个分子或一组分子结合的分子。在生物技术中常用的结合探针分子包括单链DNA 寡聚物、单链RNA寡聚物，其中的任何一种均可用作可与小分子靶标结合的杂交结合探针、适体(由肽、DNA、RNA、PNA、LNA等组成)；以及抗体和包括抗体Fab结合结构域的各种抗体衍生物，它们与其同源抗原或特定抗原表位结合。在生物学中常用的结合探针包括种类繁多的免疫球蛋白，例如IgG、IgY、IgM、scFV、hcIgF、IgNAR、以及其他免疫球蛋白，包括这些蛋白分子的原生形式和基因修饰形式。此类免疫球蛋白与被限定为靶标的任何表位结合，例如与通过体内免疫反应或通过合成生物学方法直接对此类分子的结合环进行改造所产生的任何表位结合。这些免疫球蛋白的结合结构域或其基因修饰形式(例如Fab结构域)也是结合探针。
其他众所周知的结合探针包括亲合素系蛋白质，它们与作为靶标的生物素结合。在一些实施例中，结合探针包括亲合素的基因修饰形式，例如链霉亲和素、中性亲和素、亲合素、或亲合素系的任何其他成员。
在此所用的结合探针可包括单个或多个蛋白氨基酸链，例如具有重蛋白链和轻蛋白链的IgG或抗体Fab结构域。本文的结合探针可选地与其他类型的分子(例如RNA、多糖等)复合。结合探针可一次结合单个靶标，也可一次结合多个靶标，例如，在IgG的情况下，IgG可一次结合两个表位。适体结合探针通常由RNA或肽组成。用于核酸杂交的结合探针是一类特殊的探针，其中探针寡聚物与同源结合靶标结合并形成螺旋双链体，并且这种结合基于DNA、RNA、PNA、 LNA或其他核酸类似物(通常称为XNA)中存在的经历相似的互补或简并配对的核酸碱基之间的众所周知的互补碱基对A:T、C:G及其各种形式。
在本文所用的结合探针的术语“靶标”指结合探针特异性结合的任何分子或分子组分。例如，在IgG抗体的特定情况下，抗体的表位是靶标，包含这些表位的较大分子或复合物也是靶标。
在本文所用的用于结合探针的术语“缓冲液”指结合探针在其中可存活并起作用的溶液。这样的缓冲液通常可单独地或以各种组合形式包含盐、去污剂和表面活性剂、以及特定的辅因子和靶标分子。这种缓冲液可具有从标准形式修改的组成，以增***露于该缓冲液的传感器中的信号特性等。
在本文所用的术语“电极”指可作为载荷子的高效源或汇的任何结构。其中最常见的是金属或半导体结构，例如在电子电路中使用的结构。在此所述的一对间隔开的电极可包括源电极-漏电极对。在本公开的多个实施例中，基于结合探针的分子电路可进一步包括栅电极。当存在时，“栅”电极用于施加电压而不是转移载荷子。因此，它支持载荷子的积累以产生局部电场，但不旨在传递电流。栅电极通过某种形式的绝缘层或材料与电路的主导电通路电隔离。
在本文所用的术语“接合”是指将一个分子物理附接至另一个分子或者表面或粒子的多种手段中的任何一种。此类方法通常涉及形成共价或非共价化学键，但也可能依靠蛋白质之间的相互作用、蛋白质与金属之间的相互作用、或者通过分子间力(范德华力)的作用实现的化学或物理吸附。接合化学领域的技术人员知道许多此类方法。在此所述的常见接合方法包括但不局限于硫醇-金属键、马来酰亚胺-半胱氨酸键，材料结合肽(例如金结合肽)和点击化学。
在本文所使用的术语“引发”在电气参数的背景下比“施加”电气值的概念更宽泛。例如，可在电路中引发电流。电流的这种引发可能是向电路施加电压的结果，但是，也可能是除了施加电压之外的其他动作导致的。此外，可在电路中引发电压。电压的这种引发可能是向电路施加电流的结果，但是，也可能是除了施加电流之外的其他动作导致的。在其他示例中，作为向整个电路施加电压或电流的结果，可在电路的一部分中引发电压或电流。在一个非限制性示例中，可通过施加到电路的栅电极的电压来控制在本公开的电路中引发的电子从负电极向正电极的流动。
在本公开的多个实施例中，分子传感器包括连接至正电极和负电极以构成电路的结合探针。结合探针与各种靶标的相互作用可作为整个电路中测量的电流或其他电气参数的变化检测。本发明的分子传感器与分子电子电路的一般概念的不同之处在于，结合探针直接“接线”至正电极和负电极，而不是键合至跨越电极之间的间隙的分子桥分子，以形成一条完整的电路。
在本公开的各个方面中，在基于结合探针的分子电路中引发电压或电流中的至少一种。当靶标与结合探针相互作用时，可感测到电路中的电气变化。这些电气变化或信息性电信号可包括电流、电压、阻抗、电导率、电阻、电容等。在一些示例中，在电路中引发电压，然后在靶标与结合探针相互作用时测量通过电路的电流的变化。在其他示例中，在电路中引发电流，然后在靶标与结合探针相互作用时测量通过电路中的电压的变化。在其他示例中，测量阻抗、电导率或电阻。在电路还包括栅电极(例如位于正负电极之间的间隙下方)的示例中，可向栅电极施加电压或电流中的至少一种，并且当靶标与结合探针相互作用时可测量电路中的电压、电流、阻抗、电导率、电阻或其他电气变化。
图1示出了分子电子电路的一般概念，该分子电子电路具有附接至并桥接电极10之间的间隙25的桥分子10、以及将分子结合至电极的某种类型的接合基团15或其他机构(描绘为带阴影的小方块)。图1还示出了电流(i)可通过该分子，并可测量电流(i)与时间(t) 的关系，如插图20所示。
图2示出了一种分子电子传感器，其中结合探针30与跨电极40 的分子桥元件35接合，其中当结合探针暴露于适当的缓冲溶液时，监测电流提供了一种感测结合探针与其靶标分子45的结合的方式。在这种传感器系统中，由靶标与结合探针的接合引起的局部电荷微扰对通过主电桥元件进行的电荷传送产生微扰，因此被记录为电导率或电流随时间的变化，如图2中电流(i)与时间(t)的电流插图50中的台阶状变化所示。
与图1和图2中所示的一般分子电路概念相反，在本公开的多个实施例中，分子传感器包括直接接线至电路路径的单个结合探针，从而经过分子电路的所有电流必须流过该结合探针。因此，该结合探针是电路中的基本导电路径，就像电路板上的电子元件一样。本发明的概念总体上在图3中示出，其中示出了连接在两个分子臂60之间的结合探针55。通过迫使电路中的所有电流流过结合探针，载流子被迫在更靠近结合探针与其靶标65之间的电化学相互作用的精确位置通过，从而使这种相互作用对载流子产生更大的影响，并且又使总电流对这些相互作用的细节更加敏感。这由图3中的电流与时间(i与t) 的曲线插图70示意性地示出，其中，所示出的电流阶越比由图2的配置产生的电流阶越大得多，并且还包括在如图2所示的电流与时间关系图中不存在的附加特征。较高的电流阶跃能改善信号传导。本文中的相关方法和实施例促进了基于结合探针的分子传感器的信号传导的改善。此外，作为基本导电路径的结合探针的构型与图2的通用构型有本质的不同，在图2中，有许多不通过结合探针的导电路径，并且可能没有载流子实际穿过结合探针，而且没有提供任何手段来引导载荷子通过结合探针中的关键活性位点附近。
在多个实施例中，该结合探针可在两个或更多点处耦合至正电极和负电极，以确保穿过分子结构的载荷子进入结合探针并从结合探针出来。
如图3的实施例中所示，两个分子臂与结合探针接合75以提供物理锚点以及电流通过结合探针的进出路径。这样的臂可包括在结合探针与电极62之间提供导电连接或半导电连接的任何方便的分子。此外，分子臂可提供跨越长度延伸量，以帮助跨越比结合探针的三维结构宽的较大电极间隙。这样的臂还可提供在可能与电极发生不利或破坏性的相互作用的位置(例如对电极的变性或其他破坏性的吸附) 使结合探针远离并且不与任何一个电极接触的优点。这样的臂还可使与电极的耦合的相容性更好或更高效，例如经由在结合探针上不容易发现或获得的化学基团耦合至电极。例如，在一个特定实施例中，电极包括金，并且分子臂包括硫醇基，从而该臂通过众所周知的硫醇- 金结合耦合至金电极。因此，分子臂实现了结合，而结合探针可能没有这种可用的巯基。或者，在另一个实施例中，该臂可具有点击化学结合基团，用于耦合至通过同源结合配偶衍生的点击化学电极。
在多个实施例中，分子臂包括与结合探针的某种形式的接合、以及它们与电极的接合或耦合。许多接合化学方法可用于此目的。在一个非限制性示例中，这种接合包括化学交联，该化学交联可优先将臂上的适当化学基团耦合至结合探针上的氨基酸残基。在多个实施例中，该臂上的马来酰亚胺基团耦合至结合探针上的表面半胱氨酸。在其他方面中，可产生和使用结合探针的基因修饰形式，例如包括被改造为提供特定接合位点的氨基酸结构的特定氨基酸或蛋白质结构域的结合探针。例如，在结合探针的特定位点改造的半胱氨酸氨基酸提供了呈现马来酰亚胺基团的臂附接点。两个这样的半胱氨酸位点接合至两个马来酰亚胺衍生的臂，从而产生如图3所示的构型。在这种情况下，可从氨基酸序列“改造”出一种或多种提供竞争性臂结合位点的天然半胱氨酸。如果不能去除所有这些位点，那么可使用合成化学中的多种纯化方法从不需要的构型中分离出所需的结合探针-臂接合物。在其他变化形式中，使用基因方法改造为包括唯一地与臂上的同源基团接合的残基的结合探针氨基酸序列。这种变化包括使用非标准氨基酸的情况，例如通过蛋白质表达系统修饰为呈现点击化学基团的氨基酸，该蛋白质表达系统使用经过修饰的遗传密码和经过修饰的转移RNA 将非原生氨基酸在表达的结合探针的蛋白组分中置于特定序列位点。
在其他实施例中，将与该臂上的同源基团特异性结合的肽结构域改造为结合探针的蛋白组分序列。在一个这样的实施例中，将作为抗体的抗原的肽改造为结合探针，并且在该臂上使用该抗体的Fab结合结构域。一个这样的实施例是使用FLAG肽基序DYKDD和任何适当的ANTI-FLAG Fab结构域。通过将肽抗原改造为结合探针上的所需接合位点，可按类似的方式使用任何其他肽抗原及其同源Fab结构域将该臂接合至改造的蛋白中的特定位点。通过将SPY-TAG结构域或 SPY-CATCHER结构域改造为结合探针的蛋白组分，并将同源结构域置于该臂中，其他此类肽结构域可利用SPY-TAG/SPY-CATCHER蛋白质间结合系统。当将这样的肽结合结构域改造为结合探针时，另一个实施例包括添加作为靶标肽的侧翼的短接头肽序列，以增强用于结合的结构域的可用性。如蛋白质工程领域的技术人员所知的，此类短接头可包括短甘氨酸和富含丝氨酸的接头，包括但不限于接头氨基酸序列G、GS、GSG、GGSG等。
在多个示例中，该臂分子包括为载流子进出结合探针提供传导作用的任何分子。在一些实施例中，这种臂包括分子电子学领域中已知的多种形式的分子线，这种分子线通过适当的接合和结合基团功能化，以接线至电极和结合探针。在多个方面中，这种臂可包括单链DNA、双链DNA、肽核酸(PNA)、肽、肽α螺旋、抗体、抗体的Fab结构域、碳纳米管、石墨烯纳米带、天然聚合物、合成聚合物、具有用于电子离域的p轨道的其他有机分子、或者金属或半导体纳米棒或纳米颗粒。在另一些实施例中，该臂可包括在一端具有承载巯基的基团并在另一端具有耦合至结合探针的马来酰亚胺的双链DNA、或者在一端具有半胱氨酸或金结合肽并在另一端具有耦合至结合探针的马来酰亚胺的肽α螺旋、或者在一端具有承载巯基的基团并在另一端具有耦合至结合探针的承载马来酰亚胺的基团的石墨烯纳米带。在一些实施例中，该用于将结合探针耦合至两个电极的两个臂分子是相同的分子，而在其他实施例中，这两个臂分子是不同的分子。在一些示例中，可存在“正电极”臂和“负电极”臂，以将结合探针定向结合至图3 中的对应“正”电极和“负”电极。
在多个实施例中，臂接合点直接连接至结合探针内的特定蛋白质结构元件。在图4中示出了一个非限制性的示例，其中两个分子臂80 被示为直接接线至结合探针82中的α螺旋结构85。这种结构元件提供了通过结合探针的优先导电路径。直接接线至结合探针内的自然导电路径可将电流导引至更靠近结合探针内的所关注的活性区域(例如靶标结合袋)，从而可提供进一步增强的电流信号或者载有更多关于结合探针-靶标相互作用的信息的电流信号。例如，图4中示出了一个实施例，其中该臂直接接线至横跨结合探针的表面上或附近的两个点之间的α螺旋。在图5中示出了另一个示例，其中该臂90直接接线至结合探针98内部的串联的两个α螺旋(第一α螺旋95和第二α螺旋97)，并且单个连接环100将这两个α螺旋分开。在图6中示出了另一个实施例，其中该臂105直接接线至结合探针109内部的β褶板110上的两个点108。
通常，结合探针的蛋白组分具有包含众所周知的二级结构元件 (例如α螺旋和β褶板)的三维结构。这些二级结构元件主要是氢键连接结构，它们可提供穿过结合探针的主体的分立导电路径，使得载流子(例如电子)能高效地沿着此类结构或限定此类结构的氢键跳跃，与跳出或隧穿此类结构的情况相比，这种跳跃的阻力较小。这些结构提供了可导引载荷子的优先导电路径，并且，通过选择此类结构，电荷被迫在靠近结合探针的活性区域的位置通过，并且能改善基于电流的活性感测。通过使该臂直接连接至这种结构或在这种结构的端部的少量氨基酸内，能使沿着这些期望路径流动的电流最大化，因而使来自沿着这些路径流动的电流的期望信号最大化。通过这种方式，能最大限度地减少在结合探针内的其他位置通过的电流，因而还能最大限度地减少因对这些信息性较弱的区域进行探测而引起的噪声。
在多个示例中，该接线可以是以“串联”形式出现在结合探针中的结构，例如，如图5所示的两个串联的α螺旋、或与α螺旋串联的β褶板、或三个连续的α螺旋。通常，串联的每个连续元件在结合探针的主氨基酸序列中表现为通过数个氨基酸与前一个元件隔开，例如0、1、2或最多大约10个氨基酸，这些氨基酸通常在二级结构中形成连接环。串联元件的接线也可通过接线至以下结构实现：该结构在结合探针中的蛋白的主氨基酸序列中不连续但在空间上连续且导电接触，并因氢键、盐桥、二硫桥或其他类型的分子相互作用而形成优选导电路径的结构桥，该分子相互作用形成二级、三级或四级蛋白质结构，并且可提供从一个结构元件(β褶板、α螺旋)至另一个结构元件的明确限定且有利的导电路径。当检查所涉及的蛋白质的三维结构时，从晶体结构能够观察到，尤其是在检查通过X-射线或NMR晶体照相术获得的蛋白质结构能够观察到，无论这些用于接线的结构元件是隔离的还是串联的，它们都最为明显。这种有用的结构信息形式由图12 和图13中所示的Fab域结构示出，因为它与将这种Fab结合探针接入电路的优选接线有关。
在其他实施例中，臂115接线至结合探针130上的点125，该点 125在结合探针的结合期间发生构象变化或相对运动，如图7所示。在此情况下，该臂接线至两个点，这两个点被示为在结合探针活动期间具有相对运动，这导致结合探针的构象变化(如插图120所示)。这种构造能通过多种方式增强信号传导。首先，这种运动能改变该臂的张力，并且，众所周知的是，分子中的张力变化能改变其电导率，因此该运动可通过张力转换为臂的电导率变化，因而在电流信号中显现出来。通过这种方式，电流可包含关于结合探针中的构象变化的信息。其次，类似地，这种构造在改变构象时能在结合探针中引起张力，从而改变结合探针的电导率。由于结合探针是基本电流路径，因此构象变化会转换为电流变化，从而在传感电流中表现构象信息。这种构造还可通过改变结合探针的构象变化来增强信号传导，这在某些情况下可能导致原生结合探针或经过改造而专门受益于这种构象敏感接线的结合探针的增强信号。在一个实施例中，对结合探针进行改造以使其具有发生更大构象变化或相对运动的延长结构域(例如，如通过延长图7所示的结合探针的两个末端的长度所示)，以增大运动范围，从而增大该臂和该结合探针中的张力变化范围。
在其他方面中，结合探针的构象变化(例如当在结合探针与底物之间发生诱导结合时)被转化为至少一个臂的扭曲、扭转或旋转，并且该扭曲、扭转或旋转改变该臂的电导率。一个这样的示例是包括有机聚合物的臂，该有机聚合物进一步包括多环芳环，例如聚噻吩或聚亚苯基，其中在该臂响应于结合探针的构象变化而扭曲、扭转或旋转时，先前排成一线的p轨道通过C-C键旋转而旋转错位。在该臂扭曲、扭转或旋转时，电子阻止有机聚合物的π系统中的离域。在一些实施例中，这种受阻流动可仅作用于一部分载荷子上，这取决于载荷子的极化或其他量子态等，例如电子载荷子的自旋极化、或载荷子的动量或能态。
在图8中示出了另一个示例，其中分子传感器电路包括不止两个臂，例如3个臂(第一臂135、第二臂136和第三臂137)。使用额外的结合探针接线点和相关的臂的益处包括：增加了结合探针138中的其他所需导电路径，并提高了结合探针中的总体传导效果。这种额外的臂还能提供稳定性，强制空间曲向(例如使结合探针的活性位点沿特定方向取向)，或降低物理自由度或构象熵，这可通过减少具有更多可用构象的系统的传导变化来改善感测。这种额外的臂可以是导电的，但如果它们主要是为了提供稳定性，控制取向或减少空间自由度，那么它们也可以是绝缘的。这种额外的臂可连接至电极，或者连接至结构的其他部分，例如连接至支撑电极的底物。在包括不止两个电极的系统中(包括具有栅电极(例如埋栅电极)的系统的情况)，这样的臂可连接至附加的电极。与栅电极的连接可指与栅的导电部分的连接，也可指与将实际的导电栅与电路分开的绝缘层的连接，或者，在埋栅的情况下，指埋栅上方的表面层，例如与图16中所示的表面的连接。
如图9所示，该结合探针可直接连接至电极142，作为基本导电路径，而无需使用臂分子。在这种情况下，结合探针141上的基团140 直接耦合至电极。或者，在另一个实施例中，一个接线连接包括直接耦合至结合探针，而另一个接线连接经由臂分子实现。这种无臂构造的优点在于能最大限度减小导电路径的长度，因为结合探针外部的导电路径部分可能是不应有的噪声、电阻或电容的源头。上面关于与臂接线的情况的考虑一般也适用于无臂构造的特殊情况、以及与直接结合探针耦合结合的单臂构造的特殊情况。具体而言，在没有臂的实施例中，结合探针仍可通过内部结构或在构象变化点处接线。
对于包括作为基本导电路径的直连结合探针的传感器，可通过多种环境因素增强其信号性能。例如，可调整缓冲液的选择、缓冲液添加剂、温度和施加的电压，以改善信号质量。尤其是，由于结合探针可与调节其动力特性的各种辅因子复合，并且缓冲液中的盐度也像温度一样影响结合探针动力特性，因此可利用这些因素来改善信号传导。另外，缓冲溶液的总离子强度限定溶液中的德拜长度(即，电场在溶液中延伸的距离)，并且可能因结合探针和底物中的电荷分布而影响载流子穿过结合探针的能力，因此缓冲液离子强度或总盐浓度是影响或增强信号传导的另一种手段。
可优化施加的驱动电压，以改善连接为基本导电路径的结合探针的信号传导。根据结合探针内的能垒，某些电压可能改善信号传导性能。除了施加的电压之外，多个实施例还可具有栅电极(例如图3中所示的下部底物下方的埋栅)，从而施加至栅电极的电压进一步调节结合探针电路的信号传导特性。一些实施例可采用电压谱法，其中驱动电压或栅极电压扫过一定范围的值，并且所关注的信号在该扫描的响应中，该响应包含关于结合探针与其结合靶标之间的相互作用的信息。
本公开的分子电路传感器一般包括具有至少两个电接触点的结合探针的接线，从而使结合探针成为基本导电路径。这与图2的构造相反。结合探针的两点接线可与接合物结合到分子线上，如图10和 11所示。在这些实施例中，可驱动电流穿过结合探针145以进行感测，并且该结合探针还可调节流过另一条分子线的电流，作为附加的感测模式。在图10中，这些导电模式由单个电极对150监视，并且结合以产生单个电流，而在图11中，这两个导电模式可由两个独立的电极对(第一电极对155和第二电极对160)监视，产生两个电流测量值157。在一些实施例中，该传感器可包括与两个或更多接触点连接起来作为导电路径的结合探针，并结合有其他传感器构造特征。将结合探针在两个点与输入和输出电触点连接可增强信号传导。在图10 和11中示出了其他可能且非限制性的构造。
在多个实施例中，一种分子电路传感器包括Fab抗体结合结构域。图12示出了一种代表性的Fab结合探针，该探针是与作为靶标的溶菌酶蛋白结合的Fab结构域。图12从两个不同的角度示出了结合探针结构165的带状图，其中结合探针与其溶菌酶靶标170(位于其上方)结合。该结合探针结构包含β褶板175和α螺旋180、以及环结构185。在此情况下，结合探针由复合在一起的重链和轻链蛋白质组成。该Fab结构域的二级结构和三级结构如图12所示。在该Fab与其靶标结合的过程中，这些结构特征会参与电气、化学、机械和构象扰动，在电路内与这些特征的接线会将这些扰动转换为测量信号。
图13示出了一个实施例，其中Fab结合探针190接线为基本导电路径，具体而言是接线至重链和轻链上的β褶板195的末端，这些β褶板195复合在一起，以提供将重链和轻链保持在一起的相互作用的一部分。图13中所示的臂200可包括以马来酰亚胺终止的双链寡核苷酸，该马来酰亚胺与经基因工程改造到Fab结构域的突变形式的精确位置的半胱氨酸耦合。在另一个实施例中，该臂包含以马来酰亚胺封端的蛋白质α螺旋，该马来酰亚胺与这种半胱氨酸耦合。
图14示出了一个替代实施例，其中图13的突变Fab直接接合205 至电极206，耦合至内部β褶板208，而不使用连接臂。这种耦合例如可利用金电极和带有马来酰亚胺封端的金结合肽(GBP)来实现，以使马来酰亚胺将GBP在上述的半胱氨酸位点接合至该突变Fab，并且GBP接合至金电极，从而通过这两个半胱氨酸位点在该Fab中接线。使用具有结合至Fab上的半胱氨酸的X-马来酰亚胺形式的接合基团，能够获得以马来酰亚胺中介的直接接合至电极的其他实施例，其中X是随后结合至电极表面的基团。
图15示出了图13的突变Fab的一个替代实施例，其中连接臂280 接线至内部β褶板285上的两个点。在多个实施例中，这两个点在探针结合活性期间具有相对运动，这导致结合探针的构象变化。这种相对运动会导致连接臂的张力和电导率发生变化。
图16示出了使用多个臂(下对210和上对214)将Fab 212连接为基本导电路径并稳定其相对于电极和底物的位置和取向的一个实施例。根据多个实施例，所示的下臂对可以是导电的或绝缘的。
在多个实施例中，一种电路包括连接为基本导电路径的结合探针。该电路可包括第一和第二接线点，这些接线点连接至第一和第二电极，例如正电极和负电极。
在多个实施例中，该电路还可包括至少一个具有两个端部的臂分子，其中一端与结合探针结合，而另一端与该电极中的至少一个结合，其中该至少一个臂分子作为该结合探针分子与该电极中的至少一个之间的电线。这种臂分子可选自由双链寡核苷酸、肽核酸(PNA)双链体、PNA-DNA杂交双链体、蛋白质α螺旋、类似石墨烯的纳米带、天然聚合物、合成有机分子(例如合成聚合物)、以及抗体Fab结构域组成的组。在其他示例中，该结合探针直接接线至电极，而不使用任何臂分子。该接线可以是连接至结合探针中的内部结构元件，例如α螺旋或β褶板、或者串联或空间邻近的多个此类元件。
在多个实施例中，一种电路包括在发生相对构象变化的点连接的结合探针。在一些方面中，臂包括具有取决于张力的电导率的分子。在其他示例中，臂分子可具有取决于扭转或扭曲的电导率。可使用附加的接线点将结合探针耦合在附加位点。
在多个实施例中，一种电路包括抗体或抗体Fab结构域，例如Fab 片段结合溶菌酶，其中该接线是直接在蛋白质结构内部相互作用的主内部β褶板。这种连接可依赖于基因工程半胱氨酸在这些氨基酸位置处或附近的位置、或特定位点处的其他接合基团中的基因工程。包括抗体Fab的电路可用于检测与该抗体对应的抗原的存在。
本公开的多个实施例的包括抗体Fab结构域的电路可暴露于可能包含对应抗原的溶液，并且可用于检测抗原的存在或浓度。
结合探针与正电极和负电极中的至少一个之间的连接可包括以下物质中的任何一种：天然半胱氨酸、基因工程半胱氨酸、具有接合残基的基因工程氨基酸、或包括具有接合配偶的肽的基因工程肽结构域。在某些方面中，该接线是连接至结合探针上的点，其中当结合探针与其靶标接合时，这些点发生超过0.5纳米的相对运动。在其他方面中，结合探针被改造为具有延长结构域，该延长结构域随着结合探针与其靶标接合而产生更大范围的相对运动。例如，可通过延长探针中的各种结构域来加强探针的构象变化。结合探针还可改造为具有额外的电荷基团，这些电荷基团随着该结合探针与其靶标接合而可变地影响内部导电路径。
在多个实施例中，电路暴露于包含结合探针的靶标的溶液。在一些情况下，结合探针是抗体、抗体Fab结构域或适体的基因修饰形式。在其他示例中，电路暴露于以下一种或多种条件：降低的离子强度的缓冲液、在主电极上施加的特定电压、栅电极电压、或施加至主电极或栅电极的电压谱或扫描。
在多个实施例中，结合探针可以是完整的IgG抗体分子215(如图17所示)，具有例如连接至内部β褶板220的接线，如图所示。这样的分子可以是天然形式或基因工程突变体形式。
在多个实施例中，如图18和19所示，结合探针225可包括具有结合靶标232的线形分子230。在多个实施例中，如图20和21所示，该线形分子可以是适体235，该适体235通常是DNA、RNA或XNA (类似核酸的寡聚物)的单链或结合至特定分子靶标的氨基酸肽，通常是小分子，例如维生素B12 237，如图20和21所示。这样的适体可设计或选择为与特定的分子靶标结合，并且很多种靶标分子可具有同源的特异性适体结合探针。因此，基于标准的基础分子框架，适体构成了一个重要的结合探针大系，它们在多样性和特异性潜力方面有点类似于抗体。
在其他多个实施例中，如图22和23所示，图18和19所示的线形分子组分可包括单链DNA、RNA或XNA杂交探针240。基于熟知的DNA双链结构的互补碱基配对键A:T和G:C，这样的探针特异性地靶向DNA或RNA靶标分子。因此，单链探针序列与互补靶标序列结合并形成双链“杂交”分子，通常具有双螺旋结构。任何包含互补序列的DNA或RNA分子都是结合靶标。这样的杂交探针广泛用于经典测定中(例如Southern印迹)，并且也是广泛使用的DNA微阵列技术的基础。这种杂交探针通常是长度为8至200个碱基或长度为16 至90个碱基的寡聚物。图22示出了如何利用臂245将这种杂交探针接入电路中。图23示出了如何在不使用臂的情况下将这种杂交探针 241直接接入电路，其中接合点250位于线形结合探针分子的末端处或附近。尤其是，由于单链和双链核酸分子的电导率差异很大，因此这是一种用于检测导致从单链分子向双链分子转化的杂交事件的高灵敏度传感器。这为即使在可能含有多种DNA和RNA片段以及其他种类分子的复杂溶液中也可用于检测特定DNA或RNA片段是否存在并推断此类靶标分子的浓度的传感器提供了基础。
此外，虽然这种传感器的单个实例仅能实现对单个靶标分子的存在或不存在的检测，但是使用多个传感器实例能获得关于测试溶液中的分析物浓度的信息。在图24A中示出了这种方法的一个实施例，其中将在测量时段内指示靶标结合260的电信号255视为+1数值，并且将在该时段内未观测到靶标结合270的电信号265视为0数值。如图24B所示，通过使用一个传感器依次进行、使用多个传感器并行进行、或者这些方法的任意组合的方式对测试溶液进行大量测量，并计算观测时段内的检测总数值275，可提供靶标分析物浓度的度量值，例如汇总为检测总数值M与有效总传感器试验次数N的比值M/N。将分析物浓度与这种实验中的总检测率相关联，以提供浓度的定性量度，还可对这种关联性进行校准，以提供浓度的定量量度，而这种定量量度还可具有基于M和N以及校准数据估算的统计置信区间。在一些实施例中，完全并行地应用传感器的大量实例，以实现这种测量。在另一个实施例中，这样的传感器存在于具有传感器像素电子元件阵列的传感器阵列电子测量芯片(例如CMOS芯片)上，每个这种像素元件监测来自单条结合探针分子电路的电信号。这种芯片可设置在便于使液体测试样品暴露于芯片传感器并对测量的信号数据进行捕获和处理的仪器中。在一个非限制性实施例中，还可使用可追溯的标识或条形码对样品进行编码，从而可向仪器提供多个样品，以进行高效的多样品测试。许多此类编码方法是已知的，并且可包括使用独立编码的孔或管，或者使用施加到各个样品上的可检测的分子条形码或标签，这些样品随后可合并为单个测试样品。使用结合探针分子电路的此类检测实验可替代经典的、众所周知的定性和定量结合实验，例如ELISA(抗体-抗原结合)、Southern印迹(DNA-DNA结合)、Northern印迹(DNA-RNA结合)、Western印迹(蛋白质-蛋白质结合)和DNA微阵列(DNA-DNA与DNA-RNA结合)、以及其他形式的微阵列。
在一些示例中，公开了一种进行结合检测实验的方法。该方法包括：提供基于结合探针的分子电路，该分子电路具有间隔开的正电极和负电极、以及连接至正电极和负电极以在电极之间形成导电路径的结合探针分子；引发通过该电路的电压或电流中的至少一种；使电路暴露于可能含有靶标分子的溶液；并且在测量探针与靶标结合时测量该电路中的电信号，其中对该电信号进行处理以识别提供关于探针与其靶标正确结合的信息的特征。
在其他方面中，公开了一种分子检测方法。该方法包括：(a) 提供基于结合探针的分子电路，该分子电路具有间隔开的正电极和负电极、连接至正电极和负电极以在电极之间形成导电路径的结合探针分子、以及栅电极；(b)引发通过该电路的电压或电流中的至少一种；(c)使该电路暴露于以下至少一种条件：降低的离子强度的缓冲液、在主电极上施加的特定电压、栅电极电压、或施加至主电极或栅电极的电压谱或扫描；以及(d)测量该电路中的电气变化。
本发明提供了一种基于结合探针的分子传感器及其制造和使用方法。对“多个实施例”、“单个实施例”、“一个实施例”、“示例性实施例”等的引用表示所述的实施例可包括特定的特征、结构或特性，但是不一定每个实施例都包括该特定特征、结构或特征。而且，这样的短语不一定指代同一个实施例。此外，在结合实施例说明特定特征、结构或特性时，应认识到，在本领域技术人员的知识范围内，此类特征、结构或特性可结合其他实施例实施，不论这些实施例在本文中是否已明确说明。在阅读说明书之后，如何在替代实施例中实现本公开对于相关领域的技术人员来说将是显而易见的。
本发明的益处、其他优点和问题的解决方案在上文中是参照具体实施例说明的。但是，这些益处、优点、问题的解决方案、以及可能带来任何益处、优点或解决方案或使其变得更加明显的任何元素不应理解为是本公开的关键、必要或本质特征或元素。因此，本公开的范围仅受所附权利要求的限制，在所附权利要求中，除非另行明确声明，否则对单数形式的元件的引用并不旨在表示“一个且仅有一个”，而是表示“一个或多个”。此外，在权利要求或说明书中使用类似于“A、B 和C中的至少一个”或“A、B或C中的至少一个”的短语时，应将该短语解读为指在一个实施例中可单独存在A、在一个实施例中可单独存在B、在一个实施例中可单独存在C、或者在单个实施例中可存在元素A、B和C的任何组合；例如A和B、A和C、B和C或A和B 和C。
本领域普通技术人员已知的上述各个实施例的元素的所有结构、化学和功能等同物通过引用明确地结合在本文中，并且意图被本权利要求所涵盖。而且，装置或方法不一定必须解决本公开寻求解决的每个问题，因为这些问题被权利要求所涵盖。此外，本公开中的任何元件、部件或方法步骤都不意图贡献给公众，无论在权利要求中是否明确列举了该元件、部件或方法步骤。任何要求保护的元素都不意图引用35U.S.C.112(f)，除非使用短语“用于......的装置”明确叙述该元素。在本文中所使用的术语“包括”、“包含”或其任何其他变化形式意图涵盖非排他性的包含，从而包括一系列元素的分子、组成、过程、方法或装置不仅包含这些元素，还可包含未明确列出或此类分子、组成、过程、方法或装置所固有的其他元素。