阅读说明：本技术 一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法 (Production method for preparing ferrous chelated peptide and high oleic acid fish oil by using crisped grass carp viscera ) 是由 李琳 潘子强 郑子懿 沈志华 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法,包括以下步骤:A、制备高油酸鱼油：将脆肉鲩内脏与纯净水混合搅拌破碎,加入合适的蛋白酶进行酶解,煮沸灭酶后,冷却至常温离心收集上层油相,得到的粗鱼油；精制得高油酸鱼油；B、制备亚铁螯合肽：下层酶解液继续酶解,煮沸灭酶后冷却至常温,离心去除上层油相后将酶解液过滤去除沉淀,调节酶解液pH值,加入活性炭静置,使用冷冻高速离心机离心处理,取离心之后的酶解液,加入氯化亚铁恒温震荡,然后置于旋转蒸发仪中真空浓缩后冷冻干燥,得到亚铁螯合酶解物。本发明通过生物酶解方式水解脆肉鲩内脏,确定适宜的蛋白酶及酶解条件,在释放品质较好鱼油的同时制备出具有螯合亚铁离子的酶解液。(The invention discloses a production method for preparing ferrous chelate peptide and high oleic acid fish oil by utilizing crisped grass carp viscera, which comprises the following steps: mixing and stirring crisped grass carp viscera and purified water, crushing, adding proper protease for enzymolysis, boiling to inactivate enzyme, cooling to normal temperature, centrifuging, and collecting an upper oil phase to obtain crude fish oil; refining to obtain high oleic acid fish oil; B. preparing ferrous chelate peptide: and continuously carrying out enzymolysis on the enzymolysis liquid on the lower layer, boiling to inactivate enzyme, cooling to normal temperature, centrifuging to remove the oil phase on the upper layer, filtering the enzymolysis liquid to remove precipitate, adjusting the pH value of the enzymolysis liquid, adding activated carbon for standing, carrying out centrifugal treatment by using a freezing high-speed centrifuge, taking the centrifuged enzymolysis liquid, adding ferrous chloride, carrying out constant-temperature oscillation, then placing in a rotary evaporator for vacuum concentration, and carrying out freeze drying to obtain the ferrous chelate enzymolysis product. According to the invention, crisped grass carp viscera is hydrolyzed in a biological enzymolysis mode, appropriate protease and enzymolysis conditions are determined, and the enzymatic hydrolysate with chelated ferrous ions is prepared while fish oil with better quality is released.)

一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产 方法

技术领域

本发明属于水产品废弃物综合利用技术领域，涉及一种利用酶解技术处理脆肉鲩内脏并同时制备出亚铁螯合肽及鱼油的方法。

背景技术

草鱼经脆化养殖后成为了一种新兴的养殖对象-脆肉鲩，以外观色泽晶莹、肉质爽脆紧密、鱼肉不易拉丝、久煮不烂、甜美可口，且高蛋白、低胆固醇、营养丰富等特点，受到了广大渔农和消费者的亲睐，成为了华南地区的特色鱼种。随着脆肉鲩的深度加工和远程销售，其产生了大量包括鱼头、鱼鳞、内脏等在内的下脚料。如把这些下脚料随意丢弃，不仅造成资源浪费，同时污染环境。脆肉鲩体型较大，一般在6kg-10kg左右，它的内脏很大，一副大多在300g至800g 之间，富含脂肪和蛋白质。经检测，脆肉鲩内脏含水量为 11.58±0.53％，灰分为1.25±0.21％，蛋白质含量6.94±0.76％，脂肪含量78.67±2.53％，是动物油脂的良好来源。

蛋白酶可破坏脂肪细胞与鱼内脏组织之间的联系，将脂肪细胞释放出来，酶解条件温和，生产的鱼油质量较高，如能对酶解过程进行控制(酶的种类、酶解条件)，则在释放鱼油的同时酶解组织中的蛋白质，产生具有较高营养价值和生理活性的氨基酸或短肽。食物中常见的铁元素主要以三价形式存在，不能直接被机体吸收利用，这使得缺铁成为当前世界上最普遍的营养缺乏问题之一。目前使用的补铁制剂主要有化学合成制剂及生物制剂两种，存在价格高、吸收利用率低等缺点，寻找天然且吸收率高的铁补充剂成为了膳食补充剂领域的热点。脆肉鲩鱼内脏经蛋白酶水解后可以生成小肽和游离氨基酸，可与微量元素螯合形成小分子络合物，这种螯合物可通过小肠粘膜细胞直接被机体吸收。相对于传统补铁制剂，铁肽复合物可以促进铁离子在肠道中的溶解度，提高其吸收率及利用率。

励建荣等人发明了综合利用秘鲁鱿鱼内脏的方法(公开号： CN1923052B)，通过酶法可制备出精制鱿鱼油，下层液体制成动物添加剂；潘风光等利用碱性蛋白酶酶解血红蛋白，制备出猪血红蛋白铁螯合肽(公开号：CN105420323A)并发明了一种含铁螯合肽补铁剂；朱蓓薇等人利用胃蛋白酶和中性蛋白酶水解鱼下脚料后并通过酯化反应进行改性，最终制备出EPA乙酯和DHA乙酯含量>50％的鱼油，最终通过喷雾干燥的方法得到鱼油乙酯微胶囊(公开号： CN101940240B)；李汴生、林婉玲、杨少玲、郁二蒙、李琳等人分别发明了利用脆肉鲩制备鱼片(公开号：CN103584181B，CN101965859B， CN110089695A)以及检测脆肉鲩脆度的方法(公开号： CN103994937B,CN109212173)，均不是脆肉鲩内脏利用的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种以生物酶解方式水解脆肉鲩内脏，以合适的蛋白酶种类及酶解条件，在释放品质较好鱼油的同时制备出具有螯合亚铁离子的酶解液的生产方法。

将鱼油精制后用于制备饲料油脂，利用酶解液与亚铁离子的螯合作用制备出一种天然的铁补充剂。该发明不仅实现了下脚料的综合利用，同时可在制备鱼油的同时得到具有螯合金属离子的生物活性酶解物。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法，其特征在于包括以下步骤:

A、制备高油酸鱼油：

S1、将脆肉鲩内脏清洗并沥干水分，按重量计，取脆肉鲩内脏 100份，按照内脏：水＝1:1的比例加入100份纯净水并搅拌破碎，混合均匀，得匀浆液；将该匀浆液置于酶解罐中升温至中心温度达 50-60℃后调节酶解pH值，加入蛋白酶1.5-3份，混合均匀后酶解 1-3h，煮沸灭酶，得到氨基酸含量为3.4-4.8mg/ml的酶解液；

S2、冷却酶解液至常温，6000-10000r/min，1-6℃离心10-20min，收集上层油相，得到的粗鱼油；

S3、对步骤S2的粗鱼油进行精制，得常温呈液态，油酸含量为 44.52-45.92％的高油酸鱼油；

B、制备亚铁螯合肽：

S-1、将制备高油酸鱼油过程中步骤S2中的下层酶解液置于40 -80℃酶解罐中继续酶解0.5-2h后煮沸灭酶；

S-2、将步骤S-1中的酶解液冷却至常温，6000-10000r/min， 1-6℃离心10-20min，去除上层油相后将酶解液过滤去除沉淀，调节酶解液pH值，按重量份计，取酶解液100份，加入活性炭0.5-2份，静置10-30分钟使其由浑浊变得澄清，使用冷冻高速离心机， 10000-14000r/min，2-6℃，离心5-15分钟，取离心之后的酶解液，加入1-3份的氯化亚铁，20-60℃恒温震荡20-90min后置于旋转蒸发仪中真空浓缩后冷冻干燥，得到亚铁螯合酶解物。

作为本发明一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法的另一种改进，步骤S3中粗鱼油按脱胶-中和-脱色-除臭的方式进行精制备。本发明中脱胶-中和-脱色-除臭过程均为现有的制备工艺，并为本发明技术人员所熟知。

作为本发明一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法的另一种改进，步骤S1中酶解pH值为7.8-8.2。

作为本发明一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法的另一种改进，步骤S1中煮沸灭酶10-30min。

作为本发明一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法的另一种改进，步骤S-2中调节酶解液pH值至6.9-7.1。

作为本发明一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法的另一种改进，所述步骤S1中所述蛋白酶为lcalse、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中的一种两种以上的混合物。

作为本发明蛋白酶的进一步改进，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶 Alcalse、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶按质量比 1:3:0.5:2.5:1.5的混合物。

作为本发明一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法的另一种改进，步骤S-2中真空浓缩的温度为20-40℃，浓缩时间为2-4h；冷冻干燥为-50℃至-30℃，冷冻时间为10-18h。

作为本发明一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法的另一种改进，步骤S-2中氯化亚铁的摩尔浓度为0.5-1.5mol/L。

作为本发明一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法的另一种改进，步骤S2中粗鱼油的提取率为 56.50-67.27％，碘价为70.47-87.6gI₂/100g；酸价为7.11-13.62 g/100g；过氧化值为3.84-4.67milliequivalent/1000g。

综上所述，本发明相对于现有技术其有益效果是：

本发明中脆肉鲩体型巨大，内脏占比高且易收集处理。本发明以控制酶解技术为基础，通过对酶的筛选及酶解条件的控制同时制备出富含油酸的脆肉鲩内脏油脂及具有螯合亚铁离子的酶解物，不仅为饲料用油提供了新的途径，同时产生了一种新的补铁天然复合物，更重要的是通过此发明，实现了对低值鱼下脚料的综合利用，对环境友好，有利于脆肉鲩产业的可持续发展。

本发明脆肉鲩高油酸鱼油符合国家食用动物油脂卫生标准(GB 10146-2005)的脆肉鲩油脂，该油脂常温呈液态，饱和脂肪酸占比 31.84％，单不饱和脂肪酸占比47.23％，多饱和脂肪酸占比 19.93-20.45％，其中占比最高的脂肪酸是油酸(44.52-45.92％)。精制后的油脂动脉粥样硬化指数(Atherogenicity indices,AI) 和促凝指数(thrombogenicityindices,TI)分别是0.62-0.69和 0.89-0.95。

附图说明

图1为本发明脆肉鲩内脏同步制备鱼油和亚铁螯合酶解物的流程示意图；

图2为本发明不同蛋白酶酶解脆肉鲩内脏后制备的鱼油粗品的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述：

实施例1

(1)将脆肉鲩内脏解冻后清洗并沥干水分，按重量计，取脆肉鲩内脏100份，按照内脏：水＝1:1的比例加入100份纯净水并搅拌破碎，待其混合为匀浆后(得到匀浆液)置于酶解罐中升温至中心温度达 60℃后调节其最适的酶解pH＝8.0，加入蛋白酶Alcalase 2份，混合均匀后酶解2h后冷却酶解液至常温，8000r/min，4℃离心15 分钟，收集上层油相，即为鱼油粗品；在此条件下的鱼油提取率为 57.39％，碘价为87.45±4.21g I₂/100g；酸价为7.59±0.48mg/g；过氧化值为3.98±0.26milliequivalent/1000g；按照脱胶-中和- 脱色-除臭的方式进行精制。

(2)将下层的酶解液置于60℃酶解罐中继续酶解1h后煮沸灭酶，冷却酶解液至常温，8000r/min，4℃离心10-20分钟，去除上层油相后酶解液过滤去除沉淀，调节酶解液pH＝7.0。按重量计，取酶解液100份，加入活性炭1份，静置20分钟使其由浑浊变得澄清，使用冷冻高速离心机，12000r/min，4℃离心10分钟，取离心之后的酶解液，加入2份1mol/L的氯化亚铁，35℃恒温震荡1h后置于旋转蒸发仪中真空浓缩后冷冻干燥，制备出亚铁螯合酶解物。该亚铁螯合酶解物的亚铁螯合能力为2.85mg EDTA/g酶解物。

实施例2

(1)将脆肉鲩内脏解冻后清洗并沥干水分，按重量计，取脆肉鲩内脏100份，按照内脏：水＝1:1的比例加入100份纯净水并搅拌破碎，待其混合为匀浆后(得到匀浆液)置于酶解罐中升温至中心温度达 40℃后调节其最适的酶解pH＝2.0，加入胃蛋白酶2份，混合均匀后酶解2h后冷却酶解液至常温，8000r/min，4℃离心10-20分钟，收集上层油相，即为鱼油粗品；在此条件下的鱼油提取率为56.5％，碘价为87.6±3.21g I₂/100g；酸价为7.11±0.31mg/g；过氧化值为3.84±0.25milliequivalent/1000g；按照脱胶-中和-脱色-除臭的方式进行精制。

(2)将下层的酶解液置于40℃酶解罐中继续酶解1h后煮沸灭酶，冷却酶解液至常温，8000r/min，4℃离心10-20分钟，去除上层油相后酶解液过滤去除沉淀，调节酶解液pH＝7.0。按重量计，取酶解液100份，加入活性炭1份，静置20分钟使其由浑浊变得澄清，使用冷冻高速离心机，12000r/min，4℃离心10分钟，取离心之后的酶解液，加入2份1mol/L的氯化亚铁，35℃恒温震荡1h后置于旋转蒸发仪中真空浓缩后冷冻干燥，该混合物无亚铁螯合能力。

实施例3

(1)将脆肉鲩内脏解冻后清洗并沥干水分，按重量计，取脆肉鲩内脏100份，按照内脏：水＝1:1的比例加入100份纯净水并搅拌破碎，待其混合为匀浆后(得到匀浆液)置于酶解罐中升温至中心温度达 60℃后，加入木瓜蛋白酶2份，混合均匀后酶解2h后冷却酶解液至常温，8000r/min，4℃离心10-20分钟，收集上层油相，即为鱼油粗品；在此条件下的鱼油提取率为63.68％，碘价为70.47±3.17g I₂/100g；酸价为13.62±0.45mg/g；过氧化值为4.67±0.31 milliequivalent/1000g；按照脱胶-中和-脱色-除臭的方式进行精制。

(2)将下层的酶解液置于60℃酶解罐中继续酶解1h后煮沸灭酶，冷却酶解液至常温，8000r/min，4℃离心10-20分钟，去除上层油相后酶解液过滤去除沉淀，调节酶解液pH＝7.0。按重量计，取酶解液100份，加入活性炭1份，静置20分钟使其由浑浊变得澄清，使用冷冻高速离心机，12000r/min，4℃离心10分钟，取离心之后的酶解液，加入2份1mol/L的氯化亚铁，35℃恒温震荡1h后置于旋转蒸发仪中真空浓缩后冷冻干燥，该混合物无亚铁螯合能力。

实施例4

(1)将脆肉鲩内脏解冻后清洗并沥干水分，按重量计，取脆肉鲩内脏100份，按照内脏：水＝1:1的比例加入100份纯净水并搅拌破碎，待其混合为匀浆后(得到匀浆液)置于酶解罐中升温至中心温度达 40℃后，加入中性蛋白酶2份，混合均匀后酶解2h后冷却酶解液至常温，8000r/min，4℃离心10-20分钟，收集上层油相，即为鱼油粗品；在此条件下的鱼油提取率为65.26％，碘价为77.32±3.29g I₂/100g；酸价为13.12±0.17mg/g；过氧化值为4.55±0.29 milliequivalent/1000g；按照脱胶-中和-脱色-除臭的方式进行精制。

(2)将下层的酶解液置于60℃酶解罐中继续酶解1h后煮沸灭酶，冷却酶解液至常温，8000r/min，4℃离心10-20分钟，去除上层油相后酶解液过滤去除沉淀，调节酶解液pH＝7.0。按重量计，取酶解液100份，加入活性炭1份，静置20分钟使其由浑浊变得澄清，使用冷冻高速离心机，12000r/min，4℃离心10分钟，取离心之后的酶解液，加入2份1mol/L的氯化亚铁，35℃恒温震荡1h后置于旋转蒸发仪中真空浓缩后冷冻干燥，该混合物无亚铁螯合能力。

实施例5

(1)将脆肉鲩内脏解冻后清洗并沥干水分，按重量计，取脆肉鲩内脏100份，按照内脏：水＝1:1的比例加入100份纯净水并搅拌破碎，待其混合为匀浆后(得到匀浆液)置于酶解罐中升温至中心温度达 40℃后调节其最适的酶解pH＝8.5，，加入胰蛋白酶2份，混合均匀后酶解2h后冷却酶解液至常温，8000r/min，4℃离心10-20分钟，收集上层油相，即为鱼油粗品；在此条件下的鱼油提取率为56.50％，碘价为87.6±3.21g I₂/100g；酸价为7.11±0.31g/100g；过氧化值为3.84±0.25milliequivalent/1000g；按照脱胶-中和-脱色- 除臭的方式进行精制。

(2)将下层的酶解液置于40℃酶解罐中继续酶解1h后煮沸灭酶，冷却酶解液至常温，8000r/min，4℃离心10-20分钟，去除上层油相后酶解液过滤去除沉淀，调节酶解液pH＝7.0。按重量计，取酶解液100份，加入活性炭1份，静置20分钟使其由浑浊变得澄清，使用冷冻高速离心机，12000r/min，4℃离心10分钟，取离心之后的酶解液，加入2份1mol/L的氯化亚铁，35℃恒温震荡1h后置于旋转蒸发仪中真空浓缩后冷冻干燥，该混合物无亚铁螯合能力。

实施例6

一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法，包括以下步骤:

A、制备高油酸鱼油：

S1、将脆肉鲩内脏清洗并沥干水分，按重量计，取脆肉鲩内脏 100份，按照内脏：水＝1:1的比例加入100份纯净水并搅拌破碎，混合均匀，得匀浆液；将该匀浆液置于酶解罐中升温至中心温度达50℃后调节酶解pH值至7.8，加入蛋白酶1.5份，混合均匀后酶解1h，煮沸灭酶10min，得到氨基酸含量为3.4mg/ml的酶解液；

S2、冷却酶解液至常温，6000r/min，1℃离心10min，收集上层油相，得到的粗鱼油；粗鱼油的提取率为56.50％，碘价为 70.47gI₂/100g；酸价为7.11g/100g；过氧化值为3.84milliequivalent/1000g。

S3、对步骤S2的粗鱼油按脱胶-中和-脱色-除臭的方式进行精制备，得常温呈液态，油酸含量为44.52％的高油酸鱼油；

B、制备亚铁螯合肽：

S-1、将制备高油酸鱼油过程中步骤S2中的下层酶解液置于40 -80℃酶解罐中继续酶解0.5h后煮沸灭酶；

S-2、将步骤S-1中的酶解液冷却至常温，6000r/min，1℃离心 10min，去除上层油相后将酶解液过滤去除沉淀，调节酶解液pH值至 6.9，按重量份计，取酶解液100份，加入活性炭0.5份，静置10分钟使其由浑浊变得澄清，使用冷冻高速离心机，10000r/min，2℃，离心5-15分钟，取离心之后的酶解液，加入1份的摩尔浓度为 0.5mol/L的氯化亚铁，20℃恒温震荡20min后置于旋转蒸发仪中真空浓缩后冷冻干燥，得到亚铁螯合酶解物，其中真空浓缩的温度为 20℃，浓缩时间为2h；冷冻干燥为-50℃，冷冻时间为10h。

实施例7

一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法，其特征在于包括以下步骤:

A、制备高油酸鱼油：

S1、将脆肉鲩内脏清洗并沥干水分，按重量计，取脆肉鲩内脏 100份，按照内脏：水＝1:1的比例加入100份纯净水并搅拌破碎，混合均匀，得匀浆液；将该匀浆液置于酶解罐中升温至中心温度达60℃后调节酶解pH值至8.2，加入蛋白酶3份，混合均匀后酶解3h，煮沸灭酶30min，得到氨基酸含量为4.8mg/ml的酶解液；

S2、冷却酶解液至常温，10000r/min，6℃离心20min，收集上层油相，得到的粗鱼油；粗鱼油的提取率为67.27％，碘价为87.6 gI₂/100g；酸价为13.62g/100g；过氧化值为4.67 milliequivalent/1000g。

S3、对步骤S2的粗鱼油按脱胶-中和-脱色-除臭的方式进行精制备，得常温呈液态，油酸含量为45.92％的高油酸鱼油；

B、制备亚铁螯合肽：

S-1、将制备高油酸鱼油过程中步骤S2中的下层酶解液置于80℃酶解罐中继续酶解2h后煮沸灭酶；

S-2、将步骤S-1中的酶解液冷却至常温，10000r/min，6℃离心20min，去除上层油相后将酶解液过滤去除沉淀，调节酶解液pH 值至7.1，按重量份计，取酶解液100份，加入活性炭2份，静置30 分钟使其由浑浊变得澄清，使用冷冻高速离心机，14000r/min， 6℃，离心5分钟，取离心之后的酶解液，加入3份的摩尔浓度为1.5 mol/L的氯化亚铁，60℃恒温震荡90min后置于旋转蒸发仪中真空浓缩后冷冻干燥，得到亚铁螯合酶解物，其中真空浓缩的温度为40℃，浓缩时间为4h；冷冻干燥为-30℃，冷冻时间为18h。

实施例8

一种利用脆肉鲩内脏制备亚铁螯合肽及高油酸鱼油的生产方法，其特征在于包括以下步骤:

A、制备高油酸鱼油：

S1、将脆肉鲩内脏清洗并沥干水分，按重量计，取脆肉鲩内脏 100份，按照内脏：水＝1:1的比例加入100份纯净水并搅拌破碎，混合均匀，得匀浆液；将该匀浆液置于酶解罐中升温至中心温度达55℃后调节酶解pH值至8.0，加入蛋白酶2份，混合均匀后酶解2h，煮沸灭酶10-30min，得到氨基酸含量为4.2mg/ml的酶解液；

S2、冷却酶解液至常温，8000r/min，3℃离心15min，收集上层油相，得到的粗鱼油；粗鱼油的提取率为61.34％，碘价为76.56 gI₂/100g；酸价为10.37g/100g；过氧化值为4.26milliequivalent/1000g。

S3、对步骤S2的粗鱼油按脱胶-中和-脱色-除臭的方式进行精制备，得常温呈液态，油酸含量为44.96％的高油酸鱼油；

B、制备亚铁螯合肽：

S-1、将制备高油酸鱼油过程中步骤S2中的下层酶解液置于40 -80℃酶解罐中继续酶解0.5-2h后煮沸灭酶；

S-2、将步骤S-1中的酶解液冷却至常温，9000r/min，1-6℃离心15min，去除上层油相后将酶解液过滤去除沉淀，调节酶解液pH 值至7.0，按重量份计，取酶解液100份，加入活性炭1份，静置20 分钟使其由浑浊变得澄清，使用冷冻高速离心机，12000r/min，4℃，离心10分钟，取离心之后的酶解液，加入2份的摩尔浓度为1mol/L 的氯化亚铁，40℃恒温震荡60min后置于旋转蒸发仪中真空浓缩后冷冻干燥，得到亚铁螯合酶解物，其中真空浓缩的温度为30℃，浓缩时间为3h；冷冻干燥为-40℃，冷冻时间为14h。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。