阅读说明：本技术 萃取与酶催化组合处理微藻制备生物柴油的方法 (Method for preparing biodiesel by processing microalgae through combination of extraction and enzyme catalysis ) 是由 于道永 成磊 郭俊枢 张文祺 吴文晋 葛保胜 黄方 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种富油湿微藻油脂萃取与酶催化组合制备生物柴油的方法,直接以富含油脂的鲜湿微藻为原料,无需湿藻干燥脱水、细胞破壁及油脂提取等前处理过程,以固定化脂肪酶为生物催化剂,加水活化后与萃取反应剂悬浮的富油湿微藻混合,转化获得生物柴油。本发明的方法具有工艺路线简单、微藻油脂提取效率高、催化剂活性及稳定性好、可以多次循环使用、成本较为低廉、生物柴油得率高等优点,具有良好的经济、生态和社会效益。(The invention discloses a method for preparing biodiesel by combining oil extraction and enzyme catalysis of oil-rich wet microalgae, which directly takes fresh wet microalgae rich in oil as a raw material, does not need pretreatment processes such as drying and dehydration of the wet microalgae, cell wall breaking, oil extraction and the like, takes immobilized lipase as a biocatalyst, is added with water for activation, and then is mixed with the oil-rich wet microalgae suspended by an extraction reactant for conversion to obtain the biodiesel. The method has the advantages of simple process route, high microalgae oil extraction efficiency, good catalyst activity and stability, repeated recycling, low cost, high biodiesel yield and the like, and has good economic, ecological and social benefits.)

萃取与酶催化组合处理微藻制备生物柴油的方法

技术领域

本发明属于生物化工与能源领域，具体涉及一种富油湿微藻萃取酶催化组合制备生物柴油的技术方法。

背景技术

初期以大豆油、菜籽油等食用油为原料生产生物柴油(第一代生物柴油)，然后转变到以地沟油等为原料的第二代生物柴油，最后发展为以微藻为原料的第三代生物柴油。第一代生物柴油原料以食用油为主，易导致食品短缺的安全问题，而第二代生物柴油虽然用废弃油脂等非食用油为原料，但由于原料来源不足以及生物柴油的品质欠佳等缺点而不能被大量采用。其次，第一代和第二代生物柴油还有一个潜在的问题是都直接或间接地使用大量的耕地。因此，需要开发新的原料，而微藻以其独特的优越性被认为是第三代生物柴油的理想原料。

微藻种类繁多，生长速度快、生长周期短、不占耕地、产油量高等优点，相对于第一代和第二代生物柴油，微藻可以在短期内得到大量的生物质，且含有大量的脂质可用于生物柴油的生产，比如布朗葡萄球藻的脂质含量可达到占细胞干重的75％，裂壶藻的脂质可达到细胞干重的77％。微藻培养的土地需求量低，避免了与农地竞争。根据统计结果，单位面积微藻产油量是玉米的780倍，是大豆的300多倍以及油菜的110多倍，可生产生物柴油15-80吨/公顷/年。微藻生产过程中可以吸收大量的二氧化碳，还可以利用工业污染废水中的营养物质如氮、磷等，在能量转化和碳循环中起到了重要的协调作用，具有很好的经济和环境效益。同时，还可以开发各类高附加值的副产品，从而提高微藻生物柴油生产的综合经济效益。

目前，生物柴油主要是通过酯交换法来生产的，以强酸或强碱为催化剂，催化剂难以回收且污染环境等问题得不到很好的解决，而以微藻为原料生产生物柴油的工艺还涉及湿藻的脱水干燥、油脂提取溶剂的回收等高耗能过程(CN10260512A、CN103642579A、CN108690665A)，经济性有待进一步提高。

发明内容

针对现有技术中微藻制备生物柴油的缺陷，本发明提出以固定化脂肪酶为催化剂，直接以鲜湿微藻为原料，无需湿藻干燥脱水、细胞破碎及油脂提取等前处理过程，减少能量输入，通过油脂萃取与油脂转酯化相互反馈调节，实现萃取与酶催化组合法制备生物柴油，提高微藻生物柴油产业化的经济性以及环保性。

本发明公开了一种富油湿微藻油脂萃取与酶催化组合制备生物柴油的方法。直接以富含油脂的鲜湿微藻为原料，无需湿藻干燥脱水、细胞破壁及油脂提取等前处理过程，以固定化洋葱假单胞菌脂肪酶为生物催化剂，加水活化后与萃取反应剂悬浮的富油湿微藻混合，转化一定时间后静置或离心分离，上层蒸馏回收溶剂后获得生物柴油，中层催化剂回收利用，下层醇水相及藻渣综合利用。

本发明采用的具体的技术方案如下：

一种微藻制备生物柴油的方法，具体步骤如下：

(1)富油湿微藻与萃取反应剂在反应器中搅拌混匀；

(2)固定化脂肪酶加水活化，然后加入反应器，恒温搅拌反应12-60小时；

(3)反应完成后，静置或离心分离；

(4)上层有机相蒸馏回收溶剂，剩余的液体即为生物柴油；

(5)中层为固定化脂肪酶催化剂，回收重复利用；

(6)下层醇水相富含磷脂、色素、甘油等可以综合利用，藻渣作为动物饲料或农业肥料。

作为本发明优选的技术方案：萃取反应剂为正己烷/甲醇混合液，体积比2:1。

作为本发明优选的技术方案：微藻与固定化脂肪酶的质量比为1:0.01-0.6，优选1:0.15-0.6。

作为本发明优选的技术方案：催化剂为固定化洋葱假单胞菌脂肪酶(≥900U/g)，载体Immobead 150。

作为本发明优选的技术方案：水活化剂与萃取反应剂的体积比为0.5:3-2:3，优选1:3。

作为本发明优选的技术方案：反应温度30-50℃，反应时间12-60h。进一步优选反应温度41℃，反应时间36-48h。

与现有技术先比，本发明的优点及有益效果为：

(1)本发明中的微藻原料可以是无细胞壁的微藻(例如：莱茵衣藻CC-503)，也可以是有细胞壁的微藻(例如：莱茵衣藻CC-125、布朗葡萄藻、小球藻等)，且不需要细胞破壁处理。

(2)本发明方法以固定化脂肪酶为催化剂，直接以鲜湿微藻为原料，无需湿藻干燥脱水及油脂提取等前处理过程，工艺路线简单且节能降耗，通过油脂萃取与油脂转酯化相互反馈调节，可以实现萃取与酶催化组合法高转化率制备生物柴油，提高微藻生物柴油产业化的经济性以及环保性。

(3)本发明方法通过调控脂肪酶活化剂与萃取反应剂的组成及其比例，实现微藻油脂的有效萃取以及高效率和高选择性的生物催化转化。可以使原料微藻中的中性油脂100％提取，并保持固定化脂肪酶的活性和稳定性，选择性地把中性油脂转化为脂肪酸甲酯类生物柴油，而极性磷脂基本不转化。

(4)转化完成后，通过静置或离心分离一步实现产物、催化剂、副产物等多组分的分离，下层醇水相中富含的磷脂、色素、甘油等可以进一步综合开发利用，藻渣作为动物饲料或农业肥料，从而提高微藻生物柴油的总体经济效益。

(5)本发明方法具有工艺路线简单、微藻油脂提取效率高、催化剂活性及稳定性好、可以多次循环使用、成本较为低廉、生物柴油得率高等优点，具有良好的经济、生态和社会效益。

附图说明

图1为实施例1所得固定化脂肪酶用量对微藻油脂转化的影响。

图2为实施例2所得水活化剂用量对微藻油脂转化的影响。

图3为实施例3所得反应时间对微藻油脂转化的影响。

图4为实施例4所得反应温度对微藻油脂转化的影响。

图5为实施例5所得固定化脂肪酶重复利用次数对微藻油脂转化的影响。

图6为本发明的工艺流程示意图。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步描述，但不能作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，本领域技术人员依据本发明内容对本发明的一些非本质调整或改进仍属于本发明的保护范围。

如图6所示，本发明为种富油湿微藻油脂萃取与酶催化组合制备生物柴油的方法，具体步骤如下：

富油湿微藻与萃取反应剂在反应器中搅拌混匀，萃取反应剂为正己烷/甲醇混合液(v/v＝2:1)；微藻原料可以是无细胞壁的微藻(例如：莱茵衣藻CC-503)，也可以是有细胞壁的微藻(例如：莱茵衣藻CC-125、布朗葡萄藻、小球藻等)，且不需要细胞破壁处理；

固定化脂肪酶以体积比为1:3加水活化，然后加入反应器，反应温度12-60℃，恒温搅拌反应12-60小时，下述实施例所用固定化脂肪酶为固定化洋葱假单胞菌脂肪酶(≥900U/g)，载体Immobead150；微藻与固定化脂肪酶的质量比为1:0.01-0.6；

反应完成后，静置或离心分离；

上层有机相蒸馏回收溶剂作为萃取反应剂重复利用，剩余的液体即为生物柴油；

中层为固定化脂肪酶催化剂，回收重复利用；

下层醇水相富含磷脂、色素、甘油等可以综合利用，藻渣作为动物饲料或农业肥料。

实施例1

固定化脂肪酶用量对微藻油脂转化的影响。称取0.6g湿微藻，加入3mL正己烷/甲醇(v/v＝2:1)的混合液，充分搅拌混匀，加入到含有不同固定化脂肪酶量(10mg、30mg、60mg、90mg、180mg、270mg、360mg)且已用1.25mL水活化后的反应管中，将反应管放入恒温水浴摇床中35℃恒温反应48h，反应结束后离心分离，加入内标十九烷酸甲酯，气相色谱检测分析微藻油脂的转化率。

实施例2

水活化剂用量对微藻油脂转化的影响。称取0.6g湿微藻，加入3mL正己烷/甲醇(v/v＝2:1)的混合液，充分搅拌混匀，加入到含有270mg固定化脂肪酶且已用不同水量(0.75mL、1mL、1.25mL、1.5mL、1.75mL)活化后的反应管中，将反应管放入恒温水浴摇床中35℃恒温反应48h，反应结束后离心分离，加入内标十九烷酸甲酯，气相色谱检测分析微藻油脂的转化率。

实施例3

反应时间对微藻油脂转化的影响。称取0.6g湿微藻，加入3mL正己烷/甲醇(v/v＝2:1)的混合液，充分搅拌混匀，加入到含有270mg固定化脂肪酶且已用1mL水活化后的反应管中，将反应管放入恒温水浴摇床中35℃恒温反应12h、24h、36h、48h、60h，反应结束后离心分离，加入内标十九烷酸甲酯，气相色谱检测分析微藻油脂的转化率。

实施例4

反应温度对微藻油脂转化的影响。称取0.6g湿微藻，加入3mL正己烷/甲醇(v/v＝2:1)的混合液，充分搅拌混匀，加入到含有270mg固定化脂肪酶且已用1mL水活化后的反应管中，将反应管放入恒温水浴摇床中分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃反应36h，反应结束后离心分离，加入内标十九烷酸甲酯，气相色谱检测分析微藻油脂的转化率。

实施例5

固定化脂肪酶回收重复利用。称取0.6g湿微藻，加入3mL正己烷/甲醇(v/v＝2:1)的混合液，充分搅拌混匀，加入到含有360mg固定化脂肪酶且已用1mL水活化后的反应管中，将反应管放入恒温水浴摇床中41℃恒温反应36h，反应结束后离心分离，加入内标十九烷酸甲酯溶液，气相色谱检测分析微藻油脂的转化率。回收固定化脂肪酶，重复上述实验。图5为固定化脂肪酶重复利用次数对微藻油脂转化的影响，由图可见回收固定化脂肪酶10次转化率仍能达到50％，回收固定化脂肪酶5次转化率几乎能保持100％。

实施例6

响应面法筛选最优工艺参数。在单因素考察研究的基础上，选取酶用量(A)、反应时间(B)、反应温度(C)三个因素，并根据单因素实验结果选取各因素的水平，利用DesignExpert软件，采用Box-Behnken设计方案，设计响应面实验。按照实施例1-5所示方法步骤进行实验，并分析微藻油脂的转化率，获得最优工艺参数。

表1响应面法实验因素与水平表