阅读说明：本技术 一种基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法 (Three-phase distribution method based on integration of extraction and separation of active substances of eucommia ulmoides leaves ) 是由 王润平 杨再波 吕文志 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法,包括如下步骤：1)取杜仲叶粉末,加入胆碱色氨酸离子液体水溶液,浸提,然后离心去除不溶性物质；2)将K<Sub>3</Sub>PO<Sub>4</Sub>水溶液加入步骤1)的溶液中,搅拌均匀后,静置至形成三相；3)将步骤2)分相的溶液进行分层分离,其中下层为无机盐K<Sub>3</Sub>PO<Sub>4</Sub>富集相,通过向其中加入乙醇沉淀多糖,再通过旋蒸将乙醇回收后即得多糖；中层为蛋白富集相,直接分离回收；上层为胆碱色氨酸离子液体富集相,通过加入抗溶剂后将其中的绿原酸和黄铜进行沉淀,然后旋蒸回收抗溶剂,即得绿原酸和黄铜。本发明能够对杜仲叶中的蛋白、黄铜和绿原酸一体提取和分离,工艺简单,条件温和,分离时间短,效率高。(The invention discloses a three-phase distribution method based on the integration of extraction and separation of active substances from eucommia leaves, which comprises the following steps: 1) adding the eucommia ulmoides leaf powder into a choline tryptophan ionic liquid aqueous solution, leaching, and centrifuging to remove insoluble substances; 2) will K 3 PO 4 Adding the aqueous solution into the solution obtained in the step 1), uniformly stirring, and standing until three phases are formed; 3) carrying out layered separation on the solution subjected to phase separation in the step 2), wherein the lower layer is inorganic salt K 3 PO 4 Enriching the phase, precipitating polysaccharide by adding ethanol, and recovering ethanol by rotary evaporation to obtain polysaccharide; the middle layer is a protein enrichment phase and is directly separated and recovered; the upper layer is choline tryptophan ionic liquid enrichment phase, chlorogenic acid and brass in the choline tryptophan ionic liquid enrichment phase are precipitated after the anti-solvent is added, and then the anti-solvent is recovered through rotary evaporation, so that the chlorogenic acid and the brass are obtained. The invention can treat protein, brass and chlorogenic acid in eucommia leavesThe method has the advantages of integrated extraction and separation, simple process, mild conditions, short separation time and high efficiency.)

一种基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法

技术领域

本发明涉及一种杜仲叶活性物提取与分离方法，特别是一种基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法。

背景技术

杜仲是一种传统中药药材，自古以树皮入药，具有补肝肾，强筋骨，降血压，安胎等功效，对高血压具有独特的疗效，被认为是最理想的天然降压药物之一。现代研究也表明，杜仲具有降血压、免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等作用。杜仲叶产量大，其采集不影响杜仲树木的生长，因此其研究和应用具有较大的潜在价值。同时现代分析手段研究证明，杜仲叶的药用有效成分与皮基本相同、药用功能基本一致。目前在杜仲叶中已有70多种有机物质被分离鉴定，除此之外还存在多种矿物质，根据其结构特点大致可分为木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、多糖类、杜仲胶、氨基酸类、挥发油、微量元素与维生素等。因此，对杜仲叶活性物质提取分离的研究具有重要应用意义。

离子液体双水相（ILATPS）具有能耗低、工艺耗时短、可靠的放大性和生物相容性的环境等优点，因此它被看作为一种经济高效的下游处理方法。此外，相对于其他双水相体系（基于聚合物-聚合物，聚合物-盐或盐-盐体系），ILATPS呈现较低的粘度，不会形成不透明的水溶液，且溶液有较宽的极性范围；因此这种新颖的技术已被应用于萃取不同类型的生物分子，如抗生素，氨基酸，蛋白质，激素和生物碱。尽管如此，很少研究涉及目标生物分子分离可能需要的反萃取步骤，这可能是以后必须克服的一种主要挑战。

针对离子液体双水相（ILATPS）存在的局限性，基于离子液体的三相分配（ILTPP）作为一种很有前途的用于回收蛋白质的技术开始出现。在ILTPP技术中，固体相的蛋白质积聚在离子液体富集相和盐富相的液-液界面之间。这种技术结合了离子液体双水相体系（ILATPS）和三相分配（TPP）的优点，能在相应的离子液体/盐双水相体系两相界面处获得目标化合物，这是TPP具有的特征。 ILTPP已成功应用于回收具有重要营养特性的牛乳清蛋白如乳铁蛋白，其中由1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲烷磺酸和磷酸盐组成的离子液体/盐体系被视为最适合用于三相分配。

基于离子液体的三相分配涉及的经济和环境形势高度依赖于所使用试剂的消耗，尤其是离子液体，由于其相对的高价格和环境影响，其影响有时可能会高于一些挥发性有机溶剂。从以前的研究结果中可以得出， 0.8％-5％的离子液体在ILTPP使用过程中不能重复使用，具体值取决于当时的实验条件。尽管这些损失离子液体的价值很低，但它们可能导致显著的经济和环境影响，因为离子液体是主要组成成分之一，占ILTPP体系的20％以上；并且这些常使用的传统咪唑类离子液体的生物降解性和生物适宜性较差。因此，该过程中应采取相应的措施以增强离子液体的回收。

目前报道的离子液体三相分配（ILTPP）的相关文献都是基于传统的咪唑类离子液体，且一般都涉及一些模式蛋白分子的分离，对于具有更好的生物适宜性和生物降解性的胆碱氨基酸离子液体和复杂的植物基质中蛋白质的分离目前还没有涉及。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法。本发明能够对杜仲叶中的蛋白、黄铜和绿原酸一体提取和分离，工艺简单，条件温和，分离时间短，效率高。

本发明的技术方案：一种基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法，包括如下步骤：

1）取胆碱色氨酸离子液体([Ch][Trp])和无机盐K₃PO₄，备用；

2）分别用浊点法和重量法测定胆碱色氨酸离子液体和无机盐K₃PO₄构成的离子液体双水相在25℃的相图和系线；

3）取杜仲叶粉末，加入胆碱色氨酸离子液体水溶液，浸提40-80min，然后离心去除不溶性物质；

4）根据步骤2）的相图和系线数据，将无机盐K₃PO₄水溶液加入步骤3）的溶液中，搅拌均匀后，静置至溶液相分离平衡，并形成三相；

5）将步骤4）分相的溶液进行分层分离，其中下层为无机盐K₃PO₄富集相，通过向其中加入乙醇沉淀多糖，再通过旋蒸将乙醇回收后即得多糖；中层为蛋白富集相，直接分离回收；上层为胆碱色氨酸离子液体富集相，通过加入抗溶剂后将其中的绿原酸和黄铜进行沉淀，然后旋蒸回收抗溶剂，即得绿原酸和黄铜。

前述的基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法，所述杜仲叶粉末是用自来水洗净后自然晾干，粉碎成0.1-1cm²的小块后置于30-50℃烘箱干燥1-3h制得。

前述的基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法，步骤3）所述胆碱色氨酸离子液体水溶液的浓度为35-50%。

前述的基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法，所述步骤3）中，杜仲叶粉末与胆碱色氨酸离子液体水溶液的固液比为1:5-25。

前述的基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法，所述步骤3）中，浸提时温度为20-70℃。

前述的基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法，所述步骤4）中，加入的无机盐K₃PO₄水溶液与杜仲叶粉末的质量比为10-32:1-3，无机盐K₃PO₄水溶液的浓度为45%。

本发明的有益效果

本发明通过上述工艺，能够对杜仲叶中的蛋白、黄铜和绿原酸进行一体化的提取和分离，整个过程具有工艺简单，条件温和，分离时间短，效率高的优点。

附图说明

图1是[Ch][Trp]+K₃PO₄+ H₂O 离子液体双水相体系的相图与系线；

图2是本发明的流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

本发明的实施例

实施例1：

（1）准确称量1.3g的杜仲叶粉末样品（粒径0.5cm²左右）样品放入10ml离心管中，加入浓度为35%的胆碱色氨酸离子液体水溶液8g，20℃浸提80min，然后离心除去不溶性样品组织；

（2）将8g浓度为45%的无机盐K₃PO₄水溶液加入到上述离心后的上清液中，搅拌均匀后静置2h；混合溶液相分离达到平衡后，整个体系分为三相；

（3）分别记录上述三相即上相（离子液体富集相）、中相（叶蛋白沉淀相）和下相（K₃PO₄富集相）的体积，上相体积为2.7ml，中相体积为0.3ml，下相体积为6.3ml；并且用注射器分别吸出下相和上相，将三相分离开；

（4）中间固体相即蛋白富集相直接分离回收，蛋白提取物的产率为0.25ml/g杜仲叶，其蛋白含量为1.6mg/ml；

（5）上相中的绿原酸、黄酮等通过抗溶剂沉淀分离,其绿原酸和总黄酮的含量分别为5mg/ml,20mg/ml，用旋蒸回收抗溶剂，同时胆碱色氨酸离子液体溶液可以回收重复使用；

（6）下相即无机盐富集相中的多糖通过乙醇沉淀分离,多糖产率为20mg/ml，用旋蒸回收乙醇，同时K₃PO₄溶液可以回收重复使用。

实施例2：

（1）准确称量0.3g的杜仲叶粉末样品（粒径0.1cm²左右）样品放入10ml离心管中，加入浓度为38%的胆碱色氨酸离子液体水溶液8g，50^oC浸提60min，然后离心除去不溶性样品组织；

（2）将8g浓度为45%的无机盐K₃PO₄水溶液加入到上述离心后的上清液中，搅拌均匀后静置2h；混合溶液相分离达到平衡后，整个体系分为三相；

（3）分别记录上述三相即上相（离子液体富集相）、中相（叶蛋白沉淀相）和下相（K₃PO₄富集相）的体积，上相体积为2.8ml，中相体积为0.6ml，下相体积为7.8ml；并且用注射器分别吸出下相和上相，将三相分离开；

（4）中间固体相即蛋白富集相直接分离回收，蛋白提取物的产率为2ml/g杜仲叶，其蛋白含量为1.5mg/ml；

（5）上相中的绿原酸、黄酮等通过抗溶剂沉淀分离,其绿原酸和总黄酮的含量分别为2mg/ml,10mg/ml，用旋蒸回收抗溶剂，同时胆碱色氨酸离子液体溶液可以回收重复使用；

（6）下相即无机盐富集相中的多糖通过乙醇沉淀分离,多糖产率为12mg/ml，用旋蒸回收乙醇，同时K₃PO₄溶液可以回收重复使用。

实施例3:

（1）准确称量0.3g的杜仲叶粉末样品（粒径1cm²左右）样品放入10ml离心管中，加入浓度为50%的胆碱色氨酸离子液体水溶液8g，60^oC浸提40min，然后离心除去不溶性样品组织；

（2）将8g浓度为45%的无机盐K₃PO₄水溶液加入到上述离心后的上清液中，搅拌均匀后静置2h；混合溶液相分离达到平衡后，整个体系分为三相；

（3）分别记录上述三相即上相（离子液体富集相）、中相（叶蛋白沉淀相）和下相（K₃PO₄富集相）的体积，上相体积为3.0ml，中相体积为1.4ml，下相体积为6.6ml；并且用注射器分别吸出下相和上相，将三相分离开；

（4）中间固体相即蛋白富集相直接分离回收，蛋白提取物的产率为4.5ml/g杜仲叶，其蛋白含量为1.5mg/ml；

（5）上相中的绿原酸、黄酮等通过抗溶剂沉淀分离,其绿原酸和总黄酮的含量分别为2.5mg/ml,12mg/ml，用旋蒸回收抗溶剂，同时胆碱色氨酸离子液体溶液可以回收重复使用；

（6）下相即无机盐富集相中的多糖通过乙醇沉淀分离,多糖产率为15mg/ml，用旋蒸回收乙醇，同时K₃PO₄溶液可以回收重复使用。

实施例4：一种基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法，:步骤如下：

1）取胆碱色氨酸离子液体和无机盐K₃PO₄，备用；

2）分别用浊点法和重量法测定胆碱色氨酸离子液体和无机盐K₃PO₄构成的离子液体双水相在25℃的相图和系线；

3）杜仲叶用自来水洗净后自然晾干，粉碎成0.1-1cm²的小块后置于30-50℃烘箱干燥1-3h制得杜仲叶粉末，加入浓度为35-50%的胆碱色氨酸离子液体水溶液（仲叶粉末与胆碱色氨酸离子液体水溶液的固液比为1:5-25），浸提40-80min，温度为20-70℃，然后离心去除不溶性物质；

4）根据步骤2）的相图和系线数据，将无机盐K₃PO₄水溶液加入步骤3）的溶液中，无机盐K₃PO₄水溶液与杜仲叶粉末的质量比为10-32:1-3，无机盐K₃PO₄水溶液的浓度为45%，搅拌均匀后，静置至溶液相分离平衡，并形成三相；

5）将步骤4）分相的溶液进行分层分离，其中下层为无机盐K₃PO₄富集相，通过向其中加入乙醇沉淀多糖，再通过旋蒸将乙醇回收后即得多糖；中层为蛋白富集相，直接分离回收；上层为胆碱色氨酸离子液体富集相，通过加入抗溶剂后将其中的绿原酸和黄铜进行沉淀，然后旋蒸回收抗溶剂，即得绿原酸和黄铜。

实施例4：一种基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法，步骤如下：

1）取胆碱色氨酸离子液体和无机盐K₃PO₄，备用；

2）分别用浊点法和重量法测定胆碱色氨酸离子液体和无机盐K₃PO₄构成的离子液体双水相在25℃的相图和系线；

3）杜仲叶用自来水洗净后自然晾干，粉碎成0.1cm²的小块后置于30℃烘箱干燥1h制得杜仲叶粉末，加入浓度为35%的胆碱色氨酸离子液体水溶液（仲叶粉末与胆碱色氨酸离子液体水溶液的固液比为1:5），浸提40min，温度为20℃，然后离心去除不溶性物质；

4）根据步骤2）的相图和系线数据，将无机盐K₃PO₄水溶液加入步骤3）的溶液中，无机盐K₃PO₄水溶液与杜仲叶粉末的质量比为10:1，无机盐K₃PO₄水溶液的浓度为45%，搅拌均匀后，静置至溶液相分离平衡，并形成三相；

5）将步骤4）分相的溶液进行分层分离，其中下层为无机盐K₃PO₄富集相，通过向其中加入乙醇沉淀多糖，再通过旋蒸将乙醇回收后即得多糖；中层为蛋白富集相，直接分离回收；上层为胆碱色氨酸离子液体富集相，通过加入抗溶剂后将其中的绿原酸和黄铜进行沉淀，然后旋蒸回收抗溶剂，即得绿原酸和黄铜。

实施例5：一种基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法，:步骤如下：

1）取胆碱色氨酸离子液体和无机盐K₃PO₄，备用；

2）分别用浊点法和重量法测定胆碱色氨酸离子液体和无机盐K₃PO₄构成的离子液体双水相在25℃的相图和系线；

3）杜仲叶用自来水洗净后自然晾干，粉碎成1cm²的小块后置于50℃烘箱干燥3h制得杜仲叶粉末，加入浓度为50%的胆碱色氨酸离子液体水溶液（仲叶粉末与胆碱色氨酸离子液体水溶液的固液比为1:25），浸提80min，温度为70℃，然后离心去除不溶性物质；

4）根据步骤2）的相图和系线数据，将无机盐K₃PO₄水溶液加入步骤3）的溶液中，无机盐K₃PO₄水溶液与杜仲叶粉末的质量比为32: 3，无机盐K₃PO₄水溶液的浓度为45%，搅拌均匀后，静置至溶液相分离平衡，并形成三相；

5）将步骤4）分相的溶液进行分层分离，其中下层为无机盐K₃PO₄富集相，通过向其中加入乙醇沉淀多糖，再通过旋蒸将乙醇回收后即得多糖；中层为蛋白富集相，直接分离回收；上层为胆碱色氨酸离子液体富集相，通过加入抗溶剂后将其中的绿原酸和黄铜进行沉淀，然后旋蒸回收抗溶剂，即得绿原酸和黄铜。

以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造揭露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。