阅读说明：本技术 一种杜仲提取物及其在治疗骨质疏松中的应用 (Eucommia ulmoides extract and application thereof in treating osteoporosis ) 是由 陈梁 李小锋 夏淑英 胡吉忠 毛金娣 张金良 周朝忠 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种杜仲提取物及其在治疗骨质疏松中的应用,属于中药提取技术领域。所述的杜仲提取物,按重量分数计包括：杜仲石油醚提取物20-50份和杜仲乙醇提取物10-30份,通过控制杜仲石油醚提取物和杜仲乙醇提取物的重量份数之比为1-5：1可以有效地用于治疗骨质疏松,本发明还提供了所述的杜仲石油醚提取物和杜仲乙醇提取物的提取方法,由于不同的有效成分在不同的溶剂中溶解度不同,因此采用不同的溶剂进行提取可以有效的调整有效成分的含量,所用提取分离方法简单易行,治疗骨质疏松效果好。(The invention provides an eucommia ulmoides extract and application thereof in treating osteoporosis, and belongs to the technical field of traditional Chinese medicine extraction. The eucommia ulmoides extract comprises the following components in parts by weight: 20-50 parts of eucommia ulmoides petroleum ether extract and 10-30 parts of eucommia ulmoides ethanol extract, wherein the weight ratio of the eucommia ulmoides petroleum ether extract to the eucommia ulmoides ethanol extract is controlled to be 1-5: the invention also provides an extraction method of the eucommia petroleum ether extract and the eucommia ethanol extract, because different active ingredients have different solubilities in different solvents, the content of the active ingredients can be effectively adjusted by adopting different solvents for extraction, the extraction and separation method is simple and easy to implement, and the effect of treating osteoporosis is good.)

一种杜仲提取物及其在治疗骨质疏松中的应用

技术领域

本发明属于中药提取技术领域，具体涉及一种杜仲提取物及其在治疗骨质疏松中的应用。

背景技术

骨质疏松是以骨量减少，骨组织微细结构破坏，导致骨脆性增加和骨折危险性增加为特征的一种系统性、全身性骨骼疾病，其临床症状多为骨骼疼痛和骨折，是一种多因素所致的慢性疾病，其治疗周期比较长。虽然目前临床上用于治疗骨质疏松的药物，如降钙素、双膦酸盐类、甲状旁腺激素、***、选择性***受体调节剂等，都取得了较好的疗效，但是长期用药会出现负作用，经研究发现现有的药物只能使变细的骨小梁增粗，但不能使已经断裂的骨小梁再连接上，因此不能完全修复已经破坏的骨组织微结构。

中医疗法是我国传统的治疗方法，中药治疗骨质疏松症强调从整体进行防治，副作用小，在治疗骨质疏松这一慢性疾病上具有独特的优势。中医认为，骨质疏松的发生主要与肾虚、脾虚、血癖三个因素有关，其中肾虚是本病的主要病因。

杜仲(Eucommia ulmoidesOliv.)为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，我国特有的药用植物，杜仲作为名贵滋补药材，性味甘微辛，温，入肝、肾经。杜仲入药已有2000多年的历史。《神农百草经》将其列为上品，谓其“主治腰膝痛，补中，益精气，坚筋骨，除阴下痒湿，小便余沥。久服，轻身耐老”。中华人民共和国药典(2010版)记载杜仲的功能和主治为：“补肝肾，强筋骨，安胎。用于肝肾不足，腰膝酸痛，筋骨无力，头晕目眩，妊娠滴血，胎动不安。”杜仲作为传统的“补肾”良药而被广泛的用于治疗骨质疏松。

例如，中国专利申请201310027831.3中公开了一种杜仲提取物，由如下步骤制备而成：(1)以杜仲为提取原料，用醇与水的混合溶液进行提取；(2)将步骤(1)的提取液经中性氧化铝层析柱除去色素，收集洗脱液，浓缩；(3)使用有机溶剂萃取步骤(2)得到的洗脱液，得到杜仲提取物，并提供了该提取物在制备预防和治疗骨代谢异常疾病的药物组合物中的应用，但是其中治疗效果并不理想。

为了达到更好的治疗效果，中国专利申请201210250590.4中选择将杜仲与续断联合使用制备一种组合物，该组合物包含中药材续断和杜仲组合，包括包含续断和杜仲单独提取所得提取物的混合物，或者包含续断和杜仲二者共同提取得到的提取物。该组合物具有良好的治疗骨质疏松症的作用，但是混合提取物中药效成分含量比较复杂，对各种有效成分的含量不容易控制。

因此，需要开发一种疗效好、见效快的杜仲提取物，用于更好从根源上治疗骨质疏松。

发明内容

本发明的目的是提供一种杜仲提取物以及该提取物在制备用于治疗和预防骨质疏松的药物组合物中的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案为：

一方面，本发明提供了一种杜仲提取物，所述的杜仲提取物包括杜仲石油醚提取物和杜仲乙醇提取物。

所述的杜仲提取物，按重量分数计包括：杜仲石油醚提取物20-50份和杜仲乙醇提取物10-30份。

优选地，所述的杜仲提取物，按重量分数计包括：杜仲石油醚提取物25-40份和杜仲乙醇提取物13-25份。

再优选地，所述的杜仲提取物，按重量分数计包括：杜仲石油醚提取物30-48份和杜仲乙醇提取物15-20份。

进一步优选地，所述的杜仲提取物，按重量分数计包括：杜仲石油醚提取物39-46份和杜仲乙醇提取物16-20份。

在一些优选实施方案中，所述的杜仲石油醚提取物和杜仲乙醇提取物的重量份数之比为1-5：1；

再优选地，所述的杜仲石油醚提取物和杜仲乙醇提取物的重量份数之比为2-4：1；

进一步优选地，所述的杜仲石油醚提取物和杜仲乙醇提取物的重量份数之比为3：1。

所述的杜仲提取物包括杜仲皮、杜仲叶和/或杜仲全株的石油醚或乙醇提取物。

其中，所述的杜仲石油醚提取物制备方法为：

(1)、首先将杜仲皮、杜仲叶或杜仲全株进行清洗，干燥后，用8-10倍体积的石油醚超声浸泡12-24小时，过滤，收集滤液A1和滤渣a1；

(2)向步骤(1)中得到的滤渣a1中加入5-6倍体积的石油醚进行回流提取10-15小时；过滤，收集滤液A2，弃去滤渣a2；

(3)将步骤(1)中的滤液A1和步骤(2)中的滤液A2合并，进行减压蒸馏，得到杜仲石油醚提取物。

所述的石油醚的体积百分比为60-80％；优选为70-80％，再优选为80％。

所述的回流提取的温度为65-80℃；优选为75℃。

所述的杜仲乙醇提取物制备方法为：

(1)、首先将杜仲皮、杜仲叶或杜仲全株进行清洗，干燥后，用8-10倍体积的乙醇超声浸泡12-24小时，过滤，收集滤液B1和滤渣b1；

(2)向步骤(1)中得到的滤渣a1中加入5-6倍体积的乙醇进行回流提取10-15小时；过滤，收集滤液B2，弃去滤渣b2；

(3)将步骤(1)中的滤液B1和步骤(2)中的滤液B2合并，进行减压蒸馏，得到杜仲乙醇提取物。

所述的乙醇的体积百分比为80-90％；优选为90％。

所述的回流提取的温度为80-100℃；优选为90℃。

另一方面，本发明还提供了上述的杜仲提取物在制备用于治疗和预防骨质疏松的药物组合物中的应用。

所述的药物组合物，包含本发明所述的杜仲提取物以及一种或多种可药用的稀释剂或载体。

本发明所述的杜仲提取物可以单独使用或以药物组合物的形式使用。

所述的药物组合物可以制成治疗和预防骨质疏松原料及常规的药用剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂或者其它在药剂学上可接受的任何剂型；还可以作为添加剂，添加到各种饮料和食品中，制成治疗和预防骨质疏松的饮品、食品或者保健品。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明在实施过程中采用不同的提取方法进行杜仲有效成分的提取，可以使药物有效成分得到不同成分程度的提高，由于不同的有效成分在不同的溶剂中溶解度不同，因此可以有效的调整有效成分的含量，本发明所采用的提取分离方法简单易行，治疗骨质疏松效果好；

(2)本发明通过控制杜仲石油醚提取物和杜仲乙醇提取物的重量份数之比可以有效提高治疗骨质疏松的效果，有利于从根源上治疗骨质疏松；

(3)本发明提供的杜仲提取方法简单，容易操作，有利于中药组分的综合利用，减少了药物浪费。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明的范围。

本发明在实验过程中所使用的试剂均为分析纯，所使用的中药均在药店购买。

实施例1-4一种杜仲提取物

实施例	杜仲石油醚提取物	杜仲乙醇提取物
			实施例1	20份	10份
实施例2	50份	30份
			实施例3	50份	10份
实施例4	30份	30份

制备方法：

所述的杜仲石油醚提取物制备方法为：

(1)、首先将杜仲皮、杜仲叶或杜仲全株进行清洗，干燥后，用8倍体积60％的石油醚超声浸泡24小时，过滤，收集滤液A1和滤渣a1；

(2)向步骤(1)中得到的滤渣a1中加入5倍体积60％的石油醚80℃条件下进行回流提取10小时；过滤，收集滤液A2，弃去滤渣a2；

(3)将步骤(1)中的滤液A1和步骤(2)中的滤液A2合并，进行减压蒸馏，得到杜仲石油醚提取物。

所述的杜仲乙醇提取物制备方法为：

(1)、首先将杜仲皮、杜仲叶或杜仲全株进行清洗，干燥后，用8倍体积80％的乙醇超声浸泡24小时，过滤，收集滤液B1和滤渣b1；

(2)向步骤(1)中得到的滤渣a1中加入6倍体积80％的乙醇100℃条件下进行回流提取10小时；过滤，收集滤液B2，弃去滤渣b2；

(3)将步骤(1)中的滤液B1和步骤(2)中的滤液B2合并，进行减压蒸馏，得到杜仲乙醇提取物。

实施例5-8一种杜仲提取物

实施例	杜仲石油醚提取物	杜仲乙醇提取物
			实施例5	30份	10份
实施例6	39份	13份
			实施例7	45份	15份
实施例8	48份	16份

制备方法：

所述的杜仲石油醚提取物制备方法为：

(1)、首先将杜仲皮、杜仲叶或杜仲全株进行清洗，干燥后，用10倍体积80％的石油醚超声浸泡24小时，过滤，收集滤液A1和滤渣a1；

(2)向步骤(1)中得到的滤渣a1中加入6倍体积80％的石油醚75℃条件下进行回流提取10小时；过滤，收集滤液A2，弃去滤渣a2；

(3)将步骤(1)中的滤液A1和步骤(2)中的滤液A2合并，进行减压蒸馏，得到杜仲石油醚提取物。

所述的杜仲乙醇提取物制备方法为：

(1)、首先将杜仲皮、杜仲叶或杜仲全株进行清洗，干燥后，用10倍体积90％的乙醇超声浸泡24小时，过滤，收集滤液B1和滤渣b1；

(2)向步骤(1)中得到的滤渣a1中加入6倍体积90％的乙醇90℃条件下进行回流提取10小时；过滤，收集滤液B2，弃去滤渣b2；

(3)将步骤(1)中的滤液B1和步骤(2)中的滤液B2合并，进行减压蒸馏，得到杜仲乙醇提取物。

对比例1

与实施例6的区别在于：杜仲石油醚提取物和杜仲乙醇提取物的重量份数之比为9：1，即杜仲石油醚提取物36份，杜仲乙醇提取物4份，其他步骤与操作与实施例6相同。

对比例2

与实施例6的区别在于：杜仲石油醚提取物和杜仲乙醇提取物的重量份数之比为1：9，即杜仲石油醚提取物4份，杜仲乙醇提取物36份，其他步骤与操作与实施例6相同。

对比例3

与实施例8的区别在于：仅使用杜仲石油醚提取物40份，其他步骤与操作与实施例8相同。

对比例4

与实施例8的区别在于：仅使用杜仲乙醇提取物40份，其他步骤与操作与实施例8相同。

对比例5

与实施例8的区别在于：石油醚的体积百分比为50％，其他步骤与操作与实施例8相同。

对比例6

与实施例8的区别在于：石油醚的体积百分比为90％，其他步骤与操作与实施例8相同。

对比例7

与实施例8的区别在于：乙醇的体积百分比为70％，其他步骤与操作与实施例8相同。

动物实验

一、杜仲提取物对维甲酸至大鼠骨质疏松模型的影响

药品：维甲酸，购自广州卡芬生物科技有限公司。

动物：SD大鼠170只，雌雄各半，由广州中医药大学提供。

药物配制：

取实施例1-8以及对比例1-7得到的提取物分别加0.5％羧甲基纤维素钠溶液研磨制成一定浓度的混悬液；

取维甲酸原药加0.5％羧甲基纤维素钠溶液研磨制成1.5g/100mL的混悬液。

实验分组：

将大鼠进行随机分成17组，每组10只，分别为阴性对照组、模型组、实施例1-8组和对比例1-7组。

动物处理：

除阴性对照组外，其余各组大鼠孕育上午灌胃70mg/kg.d^-1维甲酸，阴性对照组灌胃等体积生理盐水，实施例1-8组和对比例1-7组分别灌胃杜仲提取物(按原生药计算10g/kg.d^-1)，每天一次，连续给药14天后，停用维甲酸，实施例1-8组和对比例1-4组继续灌胃杜仲提取物至14天，对大鼠进行眼眶取血，使用试剂盒测定血清中血磷P、血钙Ca、血清碱性磷酸酶ALP、骨钙素BGP和大鼠骨密度BMD，具体数据见下表1。

表1实施例1-8以及对比例1-7得到的杜仲提取物对大鼠股骨密度和血液生化指标的影响(平均数±标准差)

注：*P<0.05，**P<0.01

根据上表1的检测数据可以看出，与阴性对照组相比，模型组大鼠BMD明显下降，ALP明显升高，都具有统计学意义，说明大鼠骨质疏松模型造模成功。实验例1-8组和对比例1-7组与模型组相比，实验例1-8组和对比例1-7组的骨密度均出现一定程度的增加，实施例1-8组增加明显，具有统计学意义(P<0.05)，实验例1-8组和对比例1-7的血磷和血钙含量与模型组相比没有明显的统计学意义，实验例1-8组和对比例1-7的ALP相对于模型组均明显降低，其中实验例1-8组降低幅度较大，具有统计学意义(P<0.05)，实验例1-8组和对比例1-7的BGP与模型组相比，有一定的增加趋势，但是具有有统计学意义。

二、杜仲提取物对阳虚小鼠动物模型的影响

药品：氢化可的松，购自湖北九洲康达生物科技有限公司。

动物：昆明小鼠340只，雄鼠，由广州中医药大学提供。

药物配制：

取实施例1-8以及对比例1-7得到的提取物分别加2％的吐温-80溶液研磨制成一定浓度的混悬液；

实验分组：

将大鼠进行随机分成17组，每组20只(其中10只用于脏器指数考察，10只用于游泳时间测定)，分别为阴性对照组、模型组、实施例1-8组和对比例1-7组。

动物处理：

(1)杜仲提取物对阳虚小鼠免疫器官指数的影响

小鼠饲养两天后，除阴性对照组外，各组均注射氢化可的松造模，剂量为25mg/kg，连续注射8天，每次注射半小时后，各组小鼠均给予相应的药物(实施例1-8和对比例1-7组按原生药15g/kg/d^-1给药)，阴性对照组和模型组给予等体积生理盐水，第九天给药半小时后(禁食不禁水12小时)，取小鼠肾上腺、胸腺、脾脏进行称重进行脏器指数计算，结果见下表2。

(2)杜仲提取物对阳虚小鼠游泳时间的影响

小鼠饲养两天后，除阴性对照组外，各组均注射氢化可的松造模，剂量为25mg/kg，连续注射8天，每次注射半小时后，各组小鼠均给予相应的药物(实施例1-8和对比例1-7组按原生药15g/kg/d^-1给药)，阴性对照组和模型组给予等体积生理盐水，第九天给药半小时后(禁食不禁水12小时)，对小鼠进行负重游泳实验，结果见下表3。

表2杜仲提取物对阳虚小鼠肾上腺、胸腺、脾脏指数的影响(平均数±标准差)

组别	肾上腺指数	胸腺指数	脾脏指数
				阴性对照组	0.035±0.025	0.298±0.042	0.386±0.102
模型组	0.013±0.032	0.095±0.035	0.208±0.105
				实施例1组	0.025±0.030**	0.125±0.026*8	0.245±0.095**
实施例2组	0.024±0.023**	0.128±0.305**	0.236±0.036**
				实施例3组	0.026±0.045**	0.128±0.021**	0.258±0.025**
实施例4组	0.025±0.033**	0.126±0.020**	0.246±0.056**
				实施例5组	0.028±0.023**	0.152±0.014**	0.279±0.102**
实施例6组	0.029±0.052**	0.156±0.018**	0.276±0.056**
				实施例7组	0.029±0.022**	0.155±0.023**	0.275±0.045**
实施例8组	0.030±0.033**	0.158±0.024**	0.280±0.025**
				对比例1组	0.022±0.041*	0.102±0.018*	0.228±0.046*
对比例2组	0.021±0.055*	0.105±0.016*	0.230±0.048*
				对比例3组	0.018±0.034	0.098±0.021	0.220±0.056*
对比例4组	0.019±0.016	0.095±0.023	0.218±0.064*
				对比例5组	0.018±0.022	0.115±0.020	0.235±0.040
对比例6组	0.019±0.016	0.112±0.022	0.238±0.045
				对比例7组	0.022±0.020	0.105±0.016	0.232±0.048

注：*P<0.05，**P<0.01

根据上表2检测数据可以看出，与阴性对照组相比，型组的肾上腺、胸腺和脾脏指数均出现显著的变化，说明模型造模成功；实验例1-8组和对比例1-7组与模型组相比，实验例1-8组的肾上腺指数均出现一定程度的升高，实施例1-8组升高明显，具有统计学意义(P<0.01)，对比例1-7组的肾上腺指数虽有上升趋势，但不具有统计学意义；实验例1-8组的胸腺指数与模型组相比明显增加，具有统计学意义(P<0.01)，对比例1-7组的胸腺指数与模型组相比有一定的增加趋势，但是不具有统计学意义；实验例1-8组和对比例1-7组的脾脏指数与模型组均增加，有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表3杜仲提取物对阳虚小鼠游泳时间的影响(平均数±标准差)

组别	游泳时间(min)
		阴性对照组	11.25±1.02
模型组	6.45±0.95
		实施例1组	9.56±1.03*
实施例2组	9.85±0.99*
		实施例3组	9.46±0.85*
实施例4组	8.98±0.96*
		实施例5组	10.84±1.01**
实施例6组	10.69±0.95**
		实施例7组	10.85±1.05**
实施例8组	10.72±0.96**
		对比例1组	9.25±1.02*
对比例2组	9.35±0.94*
		对比例3组	8.68±1.06*
对比例4组	8.72±0.98*
		对比例5组	9.45±0.92*
对比例6组	9.52±0.88*
		对比例7组	9.43±0.89*

注：*P<0.05，**P<0.01

有上表3的检测数据可以看出，实施例5-8组的游泳时间明显高于模型组有，具有统计学意义(P<0.01)，实施例1-4组和对比例1-7组游泳时间相对于模型组虽有增加(P<0.05)，但是不如实施例5-8组有用时间长，说明本发明提供的药物组合物能不同程度的提高小鼠的负重游泳时间。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。