利用尾静脉注射进行基因免疫开发小鼠单克隆抗体的方法
阅读说明：本技术 利用尾静脉注射进行基因免疫开发小鼠单克隆抗体的方法 (Method for developing mouse monoclonal antibody by gene immunization through tail vein injection ) 是由 雷坤 代腾飞 秦伏波 万定一 张永霞 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了利用尾静脉注射进行基因免疫开发小鼠单克隆抗体的方法,本发明具体包括以下步骤：S1、表达载体的构建和佐剂质粒的扩增和纯化,S2、小鼠尾静脉注射免疫,S3、在第四次免疫之后进行血清免疫效果检测,S4、亚克隆及筛选,S5、抗体生产及抗体应用验证,本发明涉及抗体开发技术领域。该利用尾静脉注射进行基因免疫开发小鼠单克隆抗体的方法,不需要制备大量的重组蛋白,节约了实验材料,相对于基因枪和电穿孔技术进行基因免疫,不需要复杂的仪器设备,实验材料容易获取,只需要少量的重组蛋白进行检测,节约抗原,能够缩短免疫周期,节省时间,免疫时间缩短为1个月,针对难以重组表达的多次跨膜蛋白。(The invention discloses a method for developing a mouse monoclonal antibody by gene immunization through tail vein injection, which specifically comprises the following steps: s1, construction of an expression vector, amplification and purification of an adjuvant plasmid, S2, tail vein injection immunization of a mouse, S3, detection of serum immune effect after fourth immunization, S4, subcloning and screening, S5, antibody production and antibody application verification, and the invention relates to the technical field of antibody development. According to the method for developing the mouse monoclonal antibody by utilizing the tail vein injection for gene immunization, a large amount of recombinant protein does not need to be prepared, experimental materials are saved, and compared with gene immunization by a gene gun and an electroporation technology, the method does not need complex instruments and equipment, the experimental materials are easy to obtain, only a small amount of recombinant protein is needed for detection, the antigen is saved, the immunization period can be shortened, the time is saved, the immunization time is shortened to 1 month, and the method is specific to multiple transmembrane proteins which are difficult to recombine and express.)
技术领域
本发明涉及抗体开发技术领域，具体为利用尾静脉注射进行基因免疫开发小鼠单克隆抗体的方法。
背景技术
上个世纪90年代，人们就已经开始利用DNA免疫技术开发新型疫苗，DNA疫苗的基本原理：肌肉注射人工合成的包含有病毒DNA的质粒载体，质粒在体内进行基因表达并合成对应的蛋白抗原，从而引起机体的免疫反应，人们对DNA疫苗的研究改进主要在以下2个方面：(1)采用更加高效的免疫途径，利用基因枪和电穿孔技术将DNA质粒导入到机体细胞内，免疫效果得到显著提升；(2)混合免疫冲击，首先用DNA质粒进行免疫，然后利用重组蛋白、灭活的病毒或者减毒活疫苗冲击，总体而言，在小型动物进行基因免疫的效果要优于大型动物，这一特点也预示着可以采用此方法开发高质量的小鼠单克隆抗体。
经典的利用小鼠骨髓瘤细胞进行抗体开发流程，往往需要表达重组蛋白，针对某些蛋白，特别是多次跨膜的GPCR蛋白和离子通道蛋白，全长表达非常困难，蛋白序列和结构的完整性对开发功能性抗体是非常关键的，无论是天然蛋白提取纯化还是重组蛋白的表达纯化，在操作处理过程中，蛋白的空间结构极有可能会发生改变，通过基因免疫产生的抗体能识别蛋白构象表位的概率要大很多，主要原因在于外源基因可以在体内直接表达合成具有天然构象的全长蛋白，从而引起对应的免疫应答。
本发明采用尾静脉注射的方法进行基因免疫，对注射体积，免疫剂量，质粒载体和表达启动子进行了优化，相对于重组蛋白免疫小鼠开发抗体的方法，不需要制备大量的重组蛋白，节约了实验材料，同时免疫时间缩短为1个月，缩短了实验周期，相对于基因枪和电穿孔技术进行基因免疫，不需要昂贵的仪器和复杂的操作，从而使得该技术有着广泛的应用前景。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对背景技术中所提到的现有技术不足，本发明提供了利用尾静脉注射进行基因免疫开发小鼠单克隆抗体的方法，对注射体积，免疫剂量，质粒载体和表达启动子进行了优化，相对于重组蛋白免疫小鼠开发抗体的方法，不需要制备大量的重组蛋白，节约了实验材料，同时免疫时间缩短为1个月，缩短了实验周期，相对于基因枪和电穿孔技术进行基因免疫，不需要昂贵的仪器和复杂的操作，从而使得该技术有着广泛的应用前景。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：利用尾静脉注射进行基因免疫开发小鼠单克隆抗体的方法，具体包括以下步骤：
S1、表达载体的构建和佐剂质粒的扩增和纯化：首先通过采用启动子和抗原基因序列来构建表达载体，然后构建含有GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)基因序列的质粒，来完成免疫佐剂的制备，其中任意一种作为免疫佐剂以提高免疫效率；
S2、小鼠尾静脉注射免疫：将步骤S1中的表达质粒和免疫佐剂加入到乳酸林格氏缓冲液中，终浓度分别为100-500μg/ml和2.5-5μg/ml，然后对小鼠进行尾静脉注射，每次注射体积为1.5-2ml，每周免疫一次；
S3、在第四次免疫之后进行血清免疫效果检测：挑取步骤S2中效价最好的小鼠进行免疫冲击，冲击后第三天，将小鼠处死，进行脾脏融合，取脾脏后与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；
S4、亚克隆及筛选：将步骤S3融合后的细胞通过特定的筛选方法检测克隆上清，将筛选到的阳性克隆用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆三次后建株；
S5、抗体生产及抗体应用验证：将步骤S4建株后的细胞株转移到杂交瘤专用的无血清培养基进行培养，然后待细胞生长密度达到80％后，离心收集上清，将上清用proteinA柱进行纯化，将纯化好的抗体进行内源验证。
优选的，所述步骤S1中表达载体为PTT3、pATX3或pATX4其中的任意一种。
优选的，所述步骤S1中启动子为CMV、CAG或human ubiquitin C其中的任意一种。
优选的，所述步骤S1中抗原基因序列为抗原的全长或者片段基因序列。
优选的，所述步骤S2在免疫之前对小鼠进行眼静脉采血，作为空白对照，共免疫6只小鼠，其中5只小鼠尾静脉注射1.5-2ml质粒，第6只小鼠注射同体积的乳酸林格氏作为阴性对照，每间隔一周免疫一次，融合前3天进行免疫冲击。
优选的，所述步骤S3中免疫冲击可采用基因质粒冲击、纯化的重组蛋白或者含有天然蛋白的提取物进行冲击。
优选的，所述步骤S4中筛选方法为间接elisa、细胞免疫荧光或流式细胞术其中的任意一种。
优选的，所述步骤S5中对建株后的细胞株进行培养的培养条件为：培养温度为37℃，以及5％CO2培养箱。
(三)有益效果
本发明提供了利用尾静脉注射进行基因免疫开发小鼠单克隆抗体的方法。与现有技术相比具备以下有益效果：
(1)、该利用尾静脉注射进行基因免疫开发小鼠单克隆抗体的方法，具体包括以下步骤：S1、表达载体的构建和佐剂质粒的扩增和纯化：首先通过采用启动子和抗原基因序列来构建表达载体，然后构建含有GM-CSF基因序列的质粒，来完成免疫佐剂的制备，其中任意一种作为免疫佐剂以提高免疫效率，S2、小鼠尾静脉注射免疫：将步骤S1中的表达质粒和免疫佐剂加入到乳酸林格氏缓冲液中，终浓度分别为100-500μg/ml和2.5-5μg/ml，然后对小鼠进行尾静脉注射，每次注射体积为1.5-2ml，每周免疫一次，S3、在第四次免疫之后进行血清免疫效果检测：挑取步骤S2中效价最好的小鼠进行免疫冲击，冲击后第三天，将小鼠处死，进行脾脏融合，取脾脏后与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，S4、亚克隆及筛选：将步骤S3融合后的细胞通过特定的筛选方法检测克隆上清，将筛选到的阳性克隆用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆三次后建株，S5、抗体生产及抗体应用验证：将步骤S4建株后的细胞株转移到杂交瘤专用的无血清培养基进行培养，然后待细胞生长密度达到80％后，离心收集上清，将上清用protein A柱进行纯化，将纯化好的抗体进行内源验证，可实现通过采用尾静脉注射的方法进行基因免疫，对注射体积，免疫剂量，质粒载体和表达启动子进行了优化，相对于重组蛋白免疫小鼠开发抗体的方法，不需要制备大量的重组蛋白，节约了实验材料，相对于基因枪和电穿孔技术进行基因免疫，不需要复杂的仪器设备，实验材料容易获取，只需要少量的重组蛋白进行检测，节约抗原。
(2)、该利用尾静脉注射进行基因免疫开发小鼠单克隆抗体的方法，能够缩短免疫周期，节省时间，免疫时间缩短为1个月，针对难以重组表达的多次跨膜蛋白，也能起到免疫效果，从而使得该技术有着广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为本发明小鼠免疫血清western-blot检测的曝光结果图；
图3为本发明对21H11进行了内源western blot检测的曝光结果图；
图4为本发明对21H11进行病理组织检测的IHC-nonsmall-celllung cancer曝光结果图；
图5为本发明对21H11进行病理组织检测的IHC-squamous cell carcinoma oflung曝光结果图；
图6为本发明对2C2和18H5进行流式细胞数检测的数据统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-6，本发明实施例提供一种技术方案：利用尾静脉注射进行基因免疫开发小鼠单克隆抗体的方法，具体包括以下步骤：
S1、人PD-L1载体质粒和mouse GM-CSF佐剂质粒的制备；
S2、小鼠尾静脉注射免疫；
S3、细胞融合和筛选；
S4、亚克隆；
S5、抗体生产及验证。
第一步、人PD-L1载体质粒和mouse GM-CSF佐剂质粒的制备
PDL1基因序列:
>PDL1cDNA with Kozak and RS-764bp
GCCGCCACCATGAGGATCTTCGCCGTGTTTATCTTTATGACCTACTGGCACCTGCTGAATGCCTTCACCGTGACAGTGCCCAAGGACCTGTACGTGGTGGAGTACGGCTCCAATATGACCATCGAGTGTAAGTTCCCTGTGGAGAAGCAGCTGGACCTGGCCGCCCTGATCGTGTACTGGGAGATGGAGGATAAGAATATCATCCAGTTTGTGCACGGCGAGGAGGACCTGAAGGTGCAGCACAGCAGCTACAGACAGAGAGCCAGGCTGCTGAAGGACCAGCTGTCCCTGGGCAATGCCGCCCTGCAGATCACCGACGTGAAGCTGCAGGACGCCGGCGTGTACAGATGCATGATCTCCTACGGCGGCGCCGATTACAAGAGGATCACCGTGAAGGTGAATGCCCCTTACAACAAGATCAACCAGAGGATCCTGGTGGTGGACCCCGTGACCAGCGAGCACGAGCTGACATGTCAGGCCGAGGGCTACCCCAAGGCCGAGGTCATTTGGACAAGCTCCGATCACCAGGTGCTGAGCGGCAAGACAACCACAACAAACTCCAAGAGAGAGGAGAAGCTGTTCAATGTGACAAGCACACTGAGGATCAATACCACAACAAATGAGATCTTTTACTGCACCTTCAGAAGACTGGACCCCGAGGAGAACCACACCGCCGAGCTGGTCATTCCTGAGCTGCCCCTGGCCCACCCTCCCAATGAGAGGGGCAGCCACCACCACCACCATCACTGA
Cloning vector:pcDNA3.4
Cloning strategy:EcoRI/NotI
mGM-CSF基因序列:
>GM-CSF
gctagcgccgccaccATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGGTCTACAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCACgTTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAAGCCAAAAATGAtctaga
Cloning vector:pcDNA3.1(+)
Cloning strategy:NheI/XbaI.
第二步、小鼠免疫：
预实验(1)：优化注射体积
将表达质粒和免疫佐剂加入到乳酸林格氏缓冲液中，表达质粒的浓度分别为100-500μg/ml，免疫佐剂质粒的浓度为2.5-5μg/ml，对小鼠进行尾静脉注射，我们对每次小鼠的尾静脉注射体积进行了优化，注射体积分别为：0.5ml、1ml和2ml，每周免疫一次，第四次免疫之后采集小鼠血清检测效价。
第三步，小鼠免疫血清ELISA效价检测：
第三次免疫后，间接Elisa检测小鼠血清效价。
间接elisa检测免疫小鼠血清效价实验步骤：
3.1包被
将稀释好的PD-L1蛋白按照浓度2ug/ml用pH＝9.6的碳酸盐缓冲液，以每孔100μL的量加入酶标板孔中，贴上封膜放入37℃温箱孵育2h。
3.2封闭
取出包被好的酶标板，在草纸上拍干，以每孔300μl加入脱脂牛奶封闭液，盖上盖放入37℃温箱温育1.5-2小时。
3.3加样
免疫血清用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液进行梯度稀释：1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000和1:64000，每孔最终体积100μL，然后盖上盖放入37℃温箱温育一小时。
3.4洗涤
取出酶标板，将一抗甩出，用PBST洗3次，草纸上拍干。
3.5二抗稀释
将Goat Anti-Mouse(H+L)-HRP稀释至合适的浓度，将稀释好的二抗用以每孔100μL的量依次加入酶标板孔中，37℃温箱，温育30min。
3.6洗涤
取出酶标板，将二抗甩出，用PBST洗3次，草纸上拍干。
3.7显色
将准备好的TMB显色液，倒入一个套有PE手套的干净加样槽中，用排枪以每孔100μL的量依次加入酶标板孔中，盖上盖子放入温箱5-10min。
3.8终止
打开酶标仪，预热1分钟，从温箱取出酶标板，将2M硫酸以每孔50μL的量依次加入酶标板孔中，立即读数。
3.9读数
设置450-620nm波长，将酶标板底部用吸水毛巾擦净后放进酶标仪卡槽内，点击读数，保存检测数据。
表1：小鼠第三次免疫后血清检测效价数据
表2：小鼠免疫前空白血清检测效价数据
第四步，小鼠免疫血清western-blot检测
4.1 SDS-PAGE凝胶电泳
将PD-L1重组蛋白样品置于凝胶加样缓冲液中，在98℃加热5分钟以使蛋白质变性，每个电泳道加入重组蛋白0.5μg，把电泳装置与电源连接好，将电压调至100V，电流应流向阳极，待溴酚蓝迁移过浓缩胶，加大电压至200V；待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处，关闭电源。
4.2转膜
从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净，准备进行免疫印操作，将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡15-20min，带上手套，裁剪好滤纸和NC膜，尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡，打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的滤纸，小心将凝胶放置于滤纸上，避免气泡(用转移缓冲液润湿并戴手套以转移缓冲液润湿胶面，小心将NC膜放在胶面上，从凝胶的一边开始轻轻放下可避免气泡，注意一定要戴手套或镊子接触膜)，用去离子水清洗缓冲液槽，在缓冲液槽中放入搅拌子，将另一块海绵用转移缓冲液浸透后放在凝胶-膜“三明治”上，关上转移盒并***转移槽，将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转移缓冲液。将整个装置放在冰水浴，连接好转移电极，恒流200mA转移1h。
4.3封闭
电转完毕后，将NC膜置于5％的脱脂奶粉(PBS配制)中封闭，37℃1小时或4℃过夜将第三次免疫的小鼠血清western-blot检测重组蛋白。
4.4免疫检测
封闭的膜用PBST漂洗2-3次，将加样槽洗涤干净，用蒸馏水润洗，晾干，将膜用一次性手套覆盖好，按标记和实验设计切下膜条(一般为3mm宽左右)按顺序置于加样槽中，分别取3组小鼠免疫血清效价最高的小鼠血清，用脱脂牛奶1:1000倍稀释之后，加入到样品槽中，保证膜的所有部分同溶液接触，室温下于摇床孵育1h，弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加5-10mlPBST，上摇床洗涤3min，换液，反复5次，根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度，每个加样槽中加入羊抗鼠IgG(H+L)-HRP二抗3ml左右，室温下于摇床孵育45min，注意保证膜的所有部分同溶液接触，弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加5-10mlPBST，上摇床洗涤洗涤3min，换液，反复5次。
4.5曝光
将A、B发光液按比例稀释混合，NC膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带(5min左右)后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描，曝光结果如图2所示，泳道1：2ml-#2小鼠，脱脂牛奶1:1000倍稀释，泳道2：1ml--#3小鼠，脱脂牛奶1:1000倍稀释，泳道3：0.5ml-#3小鼠，脱脂牛奶1:1000倍稀释，结论：当免疫体积(剂量)为1ml以上时，尾静脉注射均可达到理想效果。
第五步：细胞融合
5.1动物处理
将已进行加强免疫的Balb/c小鼠固定，摘除眼球取血。然后颈椎脱臼处死小鼠，置于75％的酒精中消毒至少30秒。
5.2免疫血清收集与保存
小鼠全血于室温下静置1小时，然后4℃过夜保存。次日将小鼠全血3000rpm离心15min，小心吸取上层血清做为杂交瘤筛选阳性对照，-20℃冰箱分装保存。
5.3小鼠脾脏处理
用大头针固定小鼠四肢，使其仰面朝上，用第一套镊子和剪刀剪开表皮，用第二套镊子和剪刀剪开腹壁肌肉层，第三套镊子和剪刀分离并取出脾脏。
5.4脾细胞获取
分别取3个直径10cm的培养皿，加入10ml 1640基本培养基。在第一个培养皿中漂洗脾脏一次；在第二个培养皿中，用镊子去除脾脏表面残留***(注意不要撕破脾脏被膜)；在第三个培养皿中，用两个载玻片磨砂面轻轻碾磨，碾破脾脏被膜后，即可得到脾细胞。
用10ml移液管吸取碾磨充分的脾细胞悬液经细胞筛过滤，转移到50ml的无菌离心管中。
5.5脾细胞清洗
再次吸取10ml 1640基本培养基反复冲洗培养皿2-3次后经细胞筛过滤，转移到上述50ml无菌离心管，经1500rpm离心6min，弃去上清，用10ml 1640基本培养基反复吹打10-15次，充分悬浮脾细胞沉淀，再添加30ml 1640基本培养基反复吹打5次，混匀，经1500rpm离心6min。重复上述步骤一次，弃去上清，用5ml 1640基本培养基反复吹打10-15次，重悬脾细胞沉淀，取出约0.2ml细胞悬液，经20-40倍稀释后进行脾细胞计数，融合之前室温放置。
5.6小鼠骨髓瘤细胞处理
将sp2/0细胞收集在50ml无菌离心管中，经1000rpm离心5min，弃去上清，用10ml1640基本培养基反复吹打10-15次，悬浮骨髓瘤细胞沉淀，再添加30ml 1640基本培养基反复吹打5次，混匀，经1000rpm离心5min，重复上述步骤一次，弃去上清，用5ml 1640基本培养基反复吹打10-15次重悬骨髓瘤细胞沉淀。取出约0.2ml细胞悬液，经10-20倍稀释后进行细胞计数，融合前室温放置。
5.7脾细胞-骨髓瘤细胞融合
融合开始前，打开恒温水浴锅，将温度调到37℃，将PEG和1640基本培养基放在水浴锅中预热，根据细胞计数结果，将所需的脾细胞和骨髓瘤细胞分别混匀后按5：1比例在50ml离心管中混合，1000rpm离心5min，弃去上清，轻弹离心管壁，松动细胞沉淀，将离心管置于37℃水浴中，向细胞沉淀内匀速加入已预热的PEG(1min内加入1ml)，加入PEG过程中，一边转动离心管一边用枪头的尖端温柔地搅拌，静止90s，匀速加入已预热的1640基本培养基(第一次)：1min内加入1ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基(第二次)：1min内加入2ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基(第三次)：3min内加入9ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基，边加边温柔地搅拌直至40ml，将离心管置于37℃水浴中静置3min，已融合的细胞悬液经800rpm离心5min，去上清，松动细胞沉淀。
5.8融合终止
加5ml HAT培养基，温柔地吹打10次悬浮细胞沉淀，根据脾细胞数加入适量的HAT培养基，吹打混匀，接种到96孔细胞培养板。
第六步：克隆上清筛选
6.1细胞悬液制备
将间接elisa筛选得到的阳性克隆进行细胞悬液制备，按细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数，一般在10个/毫升左右。
6.2有限稀释
取一新24孔培养板置于超净工作台，分别在A1、A2、A3孔中加入900ul的15％HT选择培养基，将做有限稀释的24孔培养板中的杂交瘤细胞混匀并取出100微升的细胞悬液，加入至新24孔培养板的A1孔，用1ml的移液管反复吹打10次左右，然后从A1孔单道移液器(20-100ul)取出100微升至A2孔，以此类推，直至稀释到A3孔，从A3孔取120个细胞放入V型槽中，用10ml移液管分两次吸取15％HT选择培养基于V型槽中，使V型槽中培养基的总体积为16ml，反复吹打8次左右。在接种96孔培养板时，200μl/孔加1-6六列为每孔1.5个细胞，余下6.4ml细胞悬液再补加6.4ml 15％HT选择培养基，反复吹打8次左右，200μl/孔加7-12六列，为每孔0.75个细胞。
6.3细胞克隆培养
置37℃8％CO2培养箱，培养5天后，第七天在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，有单细胞克隆团的在板盖上打上标记“1”，有两个以及两个以上细胞克隆团的在板盖上打上标记“√”，做好记录并统计结果。
6.4约第8-9天可以收获培养液上清用于检测抗体
选择单克隆生长孔生长良好阳性强者，转移到24孔板再做克隆经培养或扩大培养。
第七步：纯化抗体及抗体应用验证
我们通过上述方法最终得到了10株抗体，分别对这10株抗体进行了亚型和效价鉴定，鉴定结果如下表3。
表3 10株抗体亚型和效价鉴定数据表
其中对21H11进行了内源western blot检测，检测结果如图3所示，第一泳道：非小细胞肺癌组织裂解液，上样量30μg，第二泳道：乳腺癌组织裂解液，上样量30μg，第三泳道：人***细胞裂解液(HeLa celline)，上样量30μg，第四泳道：视网膜上皮细胞(ARPE-19celline)，上样量30μg。
其中对21H11进行了病理组织检测，检测图像如图4和图5所示。
其中对2C2和18H5进行了流式细胞数检测，检测结果如图6所示。
上述10株单克隆检测列表如下表4所示：
表4 10株单克隆检测列表
pCDNA3.1(+)载体序列：
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC。
综上所述
本发明可实现通过采用尾静脉注射的方法进行基因免疫，对注射体积，免疫剂量，质粒载体和表达启动子进行了优化，相对于重组蛋白免疫小鼠开发抗体的方法，不需要制备大量的重组蛋白，节约了实验材料，相对于基因枪和电穿孔技术进行基因免疫，不需要复杂的仪器设备，实验材料容易获取，只需要少量的重组蛋白进行检测，节约抗原，能够缩短免疫周期，节省时间，免疫时间缩短为1个月，针对难以重组表达的多次跨膜蛋白，也能起到免疫效果，从而使得该技术有着广泛的应用前景。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。