阅读说明：本技术 IgM-FC片段、IgM-FC抗体及制备方法和应用 (IgM-FC fragment, IgM-FC antibody, preparation method and application ) 是由 韩玉婷 柯拓 唐佳 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种IgM-FC片段、IgM-FC抗体及制备方法和应用,涉及生物化学技术领域,本发明提供了IgM-FC片段作为免疫原在制备能够与IgM特异性结合的抗体中的应用,以IgM-FC片段为免疫原免疫动物产生的抗体能够与IgM特异性结合。(The invention provides an IgM-FC fragment, an IgM-FC antibody, a preparation method and an application thereof, relates to the technical field of biochemistry, and provides an application of the IgM-FC fragment as an immunogen in preparation of an antibody capable of being specifically combined with IgM, wherein the IgM-FC fragment is used as the immunogen to immunize an animal to generate the antibody capable of being specifically combined with IgM.)

IgM-FC片段、IgM-FC抗体及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，尤其是涉及一种IgM-FC片段、IgM-FC抗体及制备方法和应用。

背景技术

免疫球蛋白M(IgM)是人的免疫球蛋白之一，根据结构不同将免疫球蛋白分为五种，分别为IgA、IgG、IgD、IgE和IgM。IgM占血清免疫球蛋白总量的5％～10％，血清浓度约1mg/ml，是免疫球蛋白中分子量最大的Ig，一般不能通过血管壁，主要存在于血液中。它是免疫应答中首先分泌的抗体，是机体抗感染的先头部队，一经感染快速产生，经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失。母体中的IgM不能通过胎盘，如果胎儿或新生儿的血液中发现有IgM，说明已发生过宫内感染。血清中检出IgM，提示近期发生感染，可用于感染的早期诊断。

目前国内对于感染性疾病的早期诊断一般使用抗人IgM的单抗或者是多抗，当然单抗比多抗更具特异性，减少了假阳性的发生。μ链作为IgM特有的重链，抗μ链的抗体更具有特异性，μ链分为恒定区和可变区，恒定区序列相对保守并具有抗原结合位点，以恒定区作为抗原免疫动物产生的抗体可以与大多数的IgM特异性结合，因此选择恒定区的肽段序列作为全分子IgM的替代物，可得到特异性与IgM结合的抗IgMμ链的抗体。

尽管抗IgMμ链的单克隆抗体组为酶标二抗已广泛的用于感染性疾病的早期诊断及免疫学的研究等方面，但制备抗IgMμ链的单克隆抗体的过程繁琐、成本较高。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供IgM-FC片段作为免疫原在制备能够与IgM特异性结合的抗体中的应用，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供一种IgM-FC片段的制备方法，该方法工艺简单，所用的纯化工艺及酶切工艺均便于操作，普适性广，且无需依赖昂贵的实验仪器，成本较低，适合大规模的推广应用。

本发明的第三个目的在于提供应用上述制备方法制备得到的IgM-FC片段，该片段为IgM特异性片段，与全长IgM比跟其他免疫球蛋白类抗体只有弱交叉反应。

本发明的第四个目的在于提供一种IgM-FC抗体的制备方法，该方法工艺简单，操作方便，适合大规模推广应用。

本发明的第五个目的在于提供一种IgM-FC抗体，该抗体可以与IgM特异性结合。

本发明的第六个目的在于提供上述的IgM-FC抗体在胶乳增强平台作为阻断剂中的应用。

本发明提供了IgM-FC片段作为免疫原在制备能够与IgM特异性结合的抗体中的应用；

优选的IgM-FC片段是五聚体的蛋白。

本发明还提供了一种IgM-FC片段的制备方法，所述制备方法包括：

将预处理后的阴性血清依次经粗分离处理及蛋白除杂处理后，得到IgM，酶切所述IgM，得到IgM-FC片段。

进一步地，所述预处理包括去除阴性血清中的脂蛋白。

进一步地，所述粗分离处理包括沉淀法处理；

优选地，所述沉淀法包括硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、丙酮沉淀法、苦味酸沉淀法、磷钨酸盐沉淀法或三氯乙酸沉淀法。

进一步地，蛋白除杂处理包括层析处理；

优选地，所述层析处理包括亲和层析处理和离子交换层析处理；

优选地，所述亲和层析处理包括使用Protein G去除IgG；

优选地，所述离子交换层析处理包括使用羟基磷灰石去除杂蛋白；

优选地，先使用Protein G去除IgG，然后再使用羟基磷灰石去除杂蛋白。

进一步地，利用胰蛋白酶酶切所述IgM，得到IgM-FC片段；

优选的，胰蛋白酶酶切是在55℃～60℃条件下酶切1小时。

进一步地，酶切所述IgM后，还包括对得到的IgM-FC片段进行纯化的步骤；

优选地，通过层析法对IgM-FC片段进行纯化；

优选地，所述层析法包括离子交换层析法和凝胶过滤层析法；

优选地，所述离子交换层析法包括使用DEAE阴离子交换介质进行层析；

优选地，所述凝胶过滤层析法包括使用superdex200凝胶介质进行层析；

优选地，先使用DEAE阴离子交换介质对IgM-FC片段进行一次纯化，然后再使用superdex200凝胶介质对IgM-FC片段进行二次纯化。

本发明还提供了上述的制备方法制备得到的IgM-FC片段。

本发明还提供了一种IgM-FC抗体的制备方法，使用上述的IgM-FC片段免疫实验动物，得到所述IgM-FC抗体。

本发明还提供了上述的制备方法制备得到的IgM-FC抗体。

另外，本发明还提供了上述的IgM-FC抗体在生化检测试剂盒作为阻断剂中的应用和/或在免疫诊断试剂盒中的应用。

本发明提供了IgM-FC片段作为免疫原在制备能够与IgM特异性结合的抗体中的应用，IgM-FC片段属于IgMμ链的一部分，是IgM特异性片段，以IgM-FC片段为免疫原免疫动物产生的抗体能够与IgM特异性结合，避免了使用全分子IgM作为免疫原和其他Ig类抗体有严重交叉反应；IgM的μ链包含Fab成份，有可能结合一些难以去除的杂蛋白，而导致干扰IgMμ链的特异性的问题。并且，IgM-FC片段的制备工艺相对简单，且成本较低，适合大规模的推广应用。

本发明提供的IgM-FC片段的制备方法，包括将预处理后的阴性血清依次经粗分离处理及蛋白除杂处理后，得到IgM，酶切所述IgM，得到IgM-FC片段。该方法通过对纯化技术进行合理的选择和组合、并确定各纯化技术的先后顺序来对血清原料进行纯化处理，从而得到纯度大于95％的IgM，然后通过对IgM酶切制备IgM-FC片段，得到五聚体IgM-Fc蛋白。并且，该方法工艺简单，所用的纯化工艺及酶切工艺均便于操作，普适性广，且无需依赖昂贵的实验仪器，成本较低，适合大规模的推广应用。

本发明的提供的应用上述制备方法制备得到的IgM-FC片段，为IgM特异性片段，与全长IgM相比，跟其他免疫球蛋白类抗体只有弱交叉反应，抗体特异性强，免疫效果佳。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

目前国内外抗IgM抗体产品多为全分子IgM作为免疫原制备抗IgM的单克隆抗体。特异性IgM单克隆抗体的筛选过程繁琐，导致成本很高；而IgMμ链的制备需经强烈的还原反应解离IgM，这不仅破坏了IgM的天然聚体结构，而且会破坏μ链的链内-S-S-结构，严重影响其免疫效果(抗体与天然IgM亲和力比较弱)。

基于此，本发明提供了IgM-FC片段作为免疫原在制备能够与IgM特异性结合的抗体中的应用。

IgM-FC片段属于IgMμ链的一部分，是IgM特异性片段，以IgM-FC片段为免疫原免疫动物产生的抗体能够与IgM特异性结合，避免了使用全分子IgM作为免疫原和其他Ig类抗体有严重交叉反应；IgM的μ链包含Fab成份，有可能结合一些难以去除的杂蛋白，而导致干扰IgMμ链的特异性的问题。并且，IgM-FC片段的制备工艺相对简单，且成本较低，适合大规模的推广应用。

优选的IgM-FC片段是五聚体的蛋白，以五聚体的IgM-FC片段为免疫原免疫动物产生的抗体与IgM结合特异性更强。

对于IgM-FC片段，目前虽然可通过基因工程方法体外合成IgM-FC片段并在大肠杆菌中高效表达，但大多为包涵体表达，蛋白复性是个难题。且重组表达得到的IgM-FC各肽段重组蛋白较天然IgM-FC各肽段的免疫原性差。

基于此，本发明还提供了一种IgM-FC片段的制备方法，所述制备方法包括：

将预处理后的阴性血清依次经粗分离处理及蛋白除杂处理后，得到IgM，酶切所述IgM，得到IgM-FC片段。

通过粗分离处理能够从预处理后的阴性血清中初步分离出IgM，进而再通过蛋白除杂处理，能够去除初步分离出的IgM中的其他蛋白。本发明提供的IgM-FC片段的制备方法，通过合理选择粗分离处理及蛋白除杂处理作为纯化技术，并且确定粗分离处理及蛋白除杂处理的先后顺序，对血清原料进行纯化处理，从而得到纯度大于95％的IgM，然后通过对IgM酶切制备IgM-FC片段，得到五聚体IgM-Fc蛋白。并且，该方法工艺简单，所用的纯化工艺及酶切工艺均便于操作，普适性广，且无需依赖昂贵的实验仪器，成本较低，适合大规模的推广应用。

需要说明的是，在本发明中“阴性血清”指的是健康人的血清。

本发明对粗分离处理的具体方式不做限定，凡是能够起到初步分离IgM的作用的方法均可；本发明对蛋白除杂处理的具体方式也不做限定，凡是能够起到去除杂蛋白的作用的方法均可。

在一些优选的实施方式中，所述预处理包括去除阴性血清中的脂蛋白。

血清中脂蛋白是由血液中脂质与某些特异的蛋白质组成的一类不均一的复合物，脂蛋白的存在对实验影响较大，因此通过预处理去除阴性血清中的脂蛋白能够确保后续实验的准确性，保证产物纯度。

本实施方式对去除脂蛋白的方法不做限定，凡是能够有效去除阴性血清中的脂蛋白的方法均可，例如可以为，但不限于离心法、沉淀法或电泳法等。

在一些优选的实施方式中，所述粗分离处理包括沉淀法处理；

优选地，所述沉淀法包括硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、丙酮沉淀法、苦味酸沉淀法、磷钨酸盐沉淀法或三氯乙酸沉淀法。

应该理解的是，上述沉淀法均为本领域公知的沉淀方法，对上述沉淀法不做具体的限定，原则上所用的沉淀剂不与各组分发生化学反应，过量的沉淀剂不干扰测定，能够沉淀完全即可。

例如，在一些具体的实施方式中，可以使用50％饱和硫酸铵沉淀法进行粗分离处理沉淀IgM全分子；在另一些具体的实施方式中，可以使用PEG6000进行粗分离处理沉淀IgM全分子。

在一些优选的实施方式中，蛋白除杂处理包括层析处理。

可以理解的是，在本发明中，目的蛋白为IgM，因此，除IgM之外的其他蛋白均需进行蛋白除杂处理。层析是利用待分离物质中不同组分的理化性质的差异而建立起来的一种分离技术，在本实施方式中，对层析的方式不做限定，凡是能够起到蛋白除杂效果的层析方法均可。

优选地，所述层析处理包括亲和层析处理和离子交换层析处理。

亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法，例如抗体与抗原的识别结合、受体与配体的识别结合等，在本发明优选的实施方式中，所述亲和层析处理包括使用Protein G去除IgG；离子交换层析是利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的，在本发明优选的实施方式中，所述离子交换层析处理包括使用羟基磷灰石去除杂蛋白。亲和层析处理和离子交换层析处理均能够有效的实现蛋白除杂。

在本实施方式中，对亲和层析处理和离子交换层析处理的顺序不做限定，优选地，先使用Protein G去除IgG，然后再使用羟基磷灰石去除杂蛋白。去除IgG后再使用羟基磷灰石去除杂蛋白，除杂效率更高，得到的产物纯度更高。

在一些优选的实施方式中，利用胰蛋白酶酶切所述IgM，将IgM切成Fab和FC片段，取其中的FC片段，得到IgM-FC片段。

优选的，胰蛋白酶酶切是在55℃～60℃条件下酶切1小时，酶切温度例如可以为，但不限于55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃。在上述酶切条件下进行胰蛋白酶酶切，能够在保证酶切完全的基础上有效节约成本。

在一些优选的实施方式中，酶切所述IgM后，还包括对得到的IgM-FC片段进行纯化的步骤。纯化后，得到的IgM-FC片段纯度更高，抗体特异性更强。

优选地，通过层析法对IgM-FC片段进行纯化。

在本实施方式中，对层析法的种类不做限定，凡是能够起到纯化IgM-FC片段效果的层析方法均可。

优选地，所述层析法包括离子交换层析法和凝胶过滤层析法。

离子交换层析法是利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的，在本发明优选的实施方式中，所述离子交换层析法包括使用DEAE阴离子交换介质进行层析。凝胶过滤层析法是利用凝胶的多孔网状结构作为分子筛进行层析，在本发明优选的实施方式中，所述凝胶过滤层析法包括使用superdex200凝胶介质进行层析。离子交换层析法和凝胶过滤层析法均能够有效的纯化IgM-FC片段。

在本实施方式中，对离子交换层析法和凝胶过滤层析法的顺序不做限定，优选地，先使用DEAE阴离子交换介质对IgM-FC片段进行一次纯化，然后再使用superdex200凝胶介质对IgM-FC片段进行二次纯化。

DEAE阴离子交换介质能够有效去除酶切后的Fab片段，去除Fab片段后，再用superdex200精纯，能够进一步去除残留的杂蛋白，纯化效率更高、效果更好。

本发明还提供了上述的制备方法制备得到的IgM-FC片段。

全分子IgM和其他Ig类抗体有严重交叉反应；IgM的μ链包含Fab成份，有可能结合一些难以去除的杂蛋白，因此会干扰IgM-μ链的特异性，导致抗体特异性差。本发明的提供的应用上述制备方法制备得到的IgM-FC片段，为纯的五聚体IgM-Fc蛋白，IgM-FC片段属于IgMμ链的一部分，是IgM特异性片段，以IgM-FC片段为免疫原免疫动物产生的抗体与其他免疫球蛋白类抗体只有弱交叉反应，抗体特异性强，免疫效果佳。

本发明还提供了一种IgM-FC抗体的制备方法，使用上述的IgM-FC片段免疫实验动物，得到所述IgM-FC抗体。

该方法工艺简单，操作方便，成本较低，适合大规模推广应用。

本发明还提供了上述的制备方法制备得到的IgM-FC抗体。

该IgM-FC抗体特异性强，能够与IgM特异性结合。

另外，本发明还提供了上述的IgM-FC抗体在生化检测试剂盒作为阻断剂中的应用和/或在免疫诊断试剂盒中的应用。

应用本发明提供的IgM-FC抗体应用在生化检测试剂盒作为阻断剂和/或在免疫诊断试剂盒中，能够消除假阳的效果。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明实施例中用到的主要试剂及仪器信息如下：

实施例1

本实施例提供了一种IgM-FC片段的制备方法，包括如下步骤：

(a)预处理阴性血清：阴性血样品加入固体溴化钾调密度，通过超速离心机离心；运行参数25000rpm，10℃，23小时。蛋白会根据密度不同形成梯度，脂蛋白的密度相对较小会分布在最上层；收集上层的脂蛋白舍弃，得到预处理后的阴性血清。

(b)粗分离处理：使用PEG6000沉淀：向预处理后的阴性血清中缓慢加入终浓度为4～8％PEG6000(配成20％的母液，质量体积比)，混匀后，室温静置1h，离心，用1×PBS复溶沉淀。

(c)蛋白除杂处理：将复溶后的溶液过Protein G柱去除IgG，收集流穿液，之后过羟基磷灰石柱进一步去除杂蛋白，得到IgM。

(d)用胰蛋白酶酶切把IgM切成Fab和Fc片段，取Fc片段。

(e)将Fc片段通过DEAE阴离子交换柱纯化，然后再经过Superdex200精纯后，得到IgM-FC片段。

实施例2

本实施例提供了一种IgM-FC片段的制备方法，与实施例1的不同之处在于，在步骤(b)粗分离处理中，使用硫酸铵沉淀：边搅拌边缓慢加入饱和硫酸铵至硫酸铵终浓度为45～50％，混匀后，室温静置1h，离心，用1×PBS复溶沉淀。

实施例3

本实施例提供了一种IgM-FC片段的制备方法，包括如下步骤：

(a)预处理阴性血清：边搅拌边加入1/5体积的55％CaCl₂，再按0.2％原血清体积逐滴加入硫酸葡聚糖(0.3g/ml母液)，继续搅拌20min；9000rpm、20min离心，弃沉淀，得到预处理后的阴性血清。

(b)粗分离处理：使用PEG6000沉淀：向预处理后的阴性血清中缓慢加入终浓度为4～8％PEG6000(配成20％的母液，质量体积比)，混匀后，室温静置1h，离心，用1×PBS复溶沉淀。

(c)蛋白除杂处理：将复溶后的溶液过Protein A柱去除IgG，收集流穿液，之后过羟基磷灰石柱进一步去除杂蛋白，得到IgM。

(d)用胰蛋白酶酶切把IgM切成Fab和Fc片段，取Fc片段。

(e)将Fc片段通过DEAE阴离子交换柱纯化，然后再经过Superdex200精纯后，得到IgM-FC片段。

实验例1活性及特异性检测

实验目的：IgM全长，IgMμ链，本发明实施例1提供的IgM-FC抗原活性特异性检测。

编号	抗原	浓度	批号
				1	IgM-FC	2.12mg/ml	20190425
2	IgM全长	1.6mg/ml	20180730
				3	IgMμ链	1.84mg/ml	20190523-1

浓度：3批抗原从10μg/mL开始往后三倍梯度稀释；

活性：从10、5、1.66667μg/ml开始往后三倍梯度稀释。

样本处理：

活性抗体样本：

IgM羊抗(ADVY 020/0113)1:20k。

特异性抗体样本：

IgA羊抗(Capricorn 160/902)稀释5K上样；

IgG(ABMM001 179BLR/1116)稀释5K上样；

ALB羊抗(11327/71901羊抗)稀释5K上样；

ADVY-TF(ABMM007 034/1213)稀释5K上样；

ADVY-C3(ABMM004 025/1217)稀释5K上样；

CTNI-1羊抗(4.47mg/mL)稀释5K上样；

MB羊抗-IIC稀释5K上样；

OYC-CRP兔抗-705 10.2mg/ml稀释5K上样；

CYSC-DAKO兔抗稀释5K上样。

(1)IgM全长、IgMμ链和IgM-FC酶免活性检测：

稀释梯度	IgM-FC	IgM全长	IgMμ链
				10	4.0543	3.8986	3.8732
5	3.8654	3.5741	3.8331
				1.6667	3.6183	2.9686	3.4751
0.5556	2.5794	1.5632	2.2653
				0.1852	1.2309	0.5277	1.0352
0.0617	0.4522	0.1915	0.3444
				0.0206	0.1687	0.0733	0.1143
0.0069	0.1124	0.0623	0.0789

(2)IgM全长、IgMμ链和IgM-FC酶免特异性检测：

从上述结果可以看出：

1.IgM-FC及IgMμ链抗原活性比IgM全长活性稍好；

2.IgM-FC抗原对IgG、ALB、TF、C3等抗体的交叉性反应比IgM全长的交叉性反应明显偏低；

3.IgM-FC抗原对CTNI、MB、CRP、CYSC等抗体无交叉性反应，IgMμ链有轻微交叉，IgM全长的交叉性反应略明显。

实验例2 IgM-FC羊多抗作为阻断剂的阻断效果

实验目的：本发明实施例1提供的IgM-FC羊抗血清纯化后在MB、CTNI羊抗胶乳试剂盒上阻断RF效果。

(1)IgM-FC羊抗血清纯化后在MB羊抗胶乳试剂盒上阻断RF效果：

检测方法：对比MB羊抗胶乳试剂盒R1中添加阻断剂与不添加阻断剂的阻断效果。

样本处理：

样本1：RF高值2000IU/ml中含MB浓度为40ng/ml；

样本2：人血清中含MB浓度为163.58ng/ml。

样本1用生理盐水稀释成含RF 1500(IU/mL)，900(IU/mL)，300(IU/mL)，并将其稀释好的样本用样本2人血清稀释3倍，使RF的终浓度为100、300、500(IU/mL)；将样本1用样本2等倍稀释达到1000(IU/mL)的RF；按生理盐水：样本2＝1:2的比例配成含RF浓度为0(IU/mL)的样本。

其中，A试剂为MB羊抗胶乳试剂R1中不添加IgM-FC抗体作为阻断剂；B试剂为MB羊抗胶乳试剂R1中添加含1％的纯化后的IgM-FC抗体作为阻断剂。

从上述结果可以看出：

MB羊抗胶乳试剂R1中添加1％的IgM-FC羊抗血清纯化后的样本后对1000IU/mL的RF都有很好的阻断效果。

(2)本发明实施例1提供的IgM-FC羊抗血清纯化后在CTNI羊抗胶乳试剂盒上阻断RF效果：

样本处理：

样本1：RF高值2000IU/ml中含CTNI浓度为3.6ng/ml；

样本2：人血清中含CTNI浓度约为0.3ng/ml。

样本1用生理盐水稀释成含RF 1500(IU/mL)、900(IU/mL)、300(IU/mL)，并将其稀释好的样本用样本2人血清稀释3倍，使RF的终浓度为100、300、500(IU/mL)；将样本1用样本2等倍稀释达到1000(IU/mL)的RF；按生理盐水：样本2＝1:2的比例配成含RF浓度为0(IU/mL)的样本。

其中，A试剂为CTNI羊抗胶乳试剂R1中不添加IgM-FC抗体作为阻断剂；B试剂为CTNI羊抗胶乳试剂R1中添加含1％的纯化后的IgM-FC抗体作为阻断剂。

从上述结果可以看出：

CTNI羊抗胶乳试剂R1中添加1％的IgM-FC羊抗血清纯化后的样本后对1000IU/mL的RF都有很好的阻断效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。