阅读说明：本技术 组合物在将造血祖细胞重编程为造血干细胞中的用途 (Use of compositions for reprogramming hematopoietic progenitor cells to hematopoietic stem cells ) 是由 肖雄 刘洪蛟 刘德芳 刘英全 严小娥 齐海龙 李迎霞 孙忠杰 陈立功 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明提出了组合物在将造血祖细胞重编程为造血干细胞中的用途,所述组合物包括：JNK-IN-8、丙戊酸和Y27632；以及任选的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。利用本发明的组合物可以将造血祖细胞重编程为造血干细胞,并且,获得的造血干细胞具有长期移植重建能力,能够稳定分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、血红细胞等多个血细胞系,科学研究、临床研究和应用价值高。(The present invention proposes the use of a composition for reprogramming hematopoietic progenitor cells into hematopoietic stem cells, the composition comprising: JNK-IN-8, valproic acid and Y27632; and optionally nicotinamide adenine dinucleotide. The composition can reprogram hematopoietic progenitor cells into hematopoietic stem cells, and the obtained hematopoietic stem cells have long-term transplantation reconstruction capability, can be stably differentiated into a plurality of blood cell lines such as T lymphocytes, B lymphocytes, myeloid cells, red blood cells and the like, and have high scientific research, clinical research and application values.)

组合物在将造血祖细胞重编程为造血干细胞中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及组合物在将造血祖细胞重编程为造血干细胞中的用途。

背景技术

造血干细胞(HSCs)是最早应用于临床治疗的干细胞类型，具有极强的自我更新能力和多谱系分化能力。自从1968年被成功应用于治疗免疫缺陷症之后，经过长达40多年的临床改进，通过造血干细胞移植治疗白血病和其他血液病症已经是比较成熟的治疗手段(Barriga et al.,2012；Park et al.,2015)。造血干细胞主要来源于人体骨髓(bonemarrow，BM)、动员的外周血(peripheral blood，PB)、脐带血(umbilical cord blood，UCB)等组织，临床上主要使用BM和PB来源的HSCs。近些年，随着脐带血的储存数量与日俱增，脐带血来源的HSCs的临床应用也不断普及。但是，由于一份脐带血中所提取的HSCs数量有限，两份HLA配型成功的概率较低，限制了脐带血HSCs的临床应用，大概有50％的病人因此失去获得造血干细胞移植治疗的机会(Boitano et al.,2010)。因此，体外扩增造血干细胞成了该领域的研究热点。

2016年，John Dick实验室发现microRNA(micRNA-125a)能扩增人和鼠的造血干细胞，同时能够将造血祖细胞重编程为造血干细胞，首次实现了血细胞的逆生长，为体外获得造血干细胞提供了新的思路(Wojtowicz et al.,2016)。但是，由于该研究工作使用了病毒载体，会有片段随机***到细胞基因组中，对细胞造成了潜在的癌变风险，因此极大地限制了其临床应用空间。随着化学小分子技术的不断发展，其安全性和对细胞的重编程作用受到广泛关注。采用化学小分子对血细胞进行扩增和重编程研究具有安全性保障，但是截止目前为止，相关研究成果尚未见报道。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明通过高通量筛选平台，找到一类化学小分子组合物，其可以将造血祖细胞重编程为造血干细胞，并且，获得的造血干细胞具有长期移植重建能力，能够稳定分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、血红细胞等多个血细胞系，科学研究、临床研究和应用价值高。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种用于将造血祖细胞重编程为造血干细胞的组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：JNK-IN-8、丙戊酸和Y27632；以及任选的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

JNK-IN-8为JNK信号通路抑制剂，通过抑制c-Jun磷酸化和基因转录来实现调控JNK信号通路的作用；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)可以调控基础代谢，是细胞生长的基础反应底物；丙戊酸(Valproic acid，简称VPA)为HDAC信号通路抑制剂；Y27632为ROCK1抑制剂，可用于抗衰老，对维持干细胞的活力有明显提升作用。

发明人采用高通量筛选以便获得可以将造血祖细胞重编程为造血干细胞的小分子化合物，发现某些化学小分子看似能够重建造血干细胞，但是获得的细胞不一定具有造血干细胞的功能，例如出现移植重建能力低、无法分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、血红细胞(T/B/M/E细胞)等血细胞系等问题。JNK-IN-8、VPA和Y27632三者之间或者JNK-IN-8、NAD、VPA和Y27632四者之间具有相互配合、增效的作用，可以将造血祖细胞重编程为造血干细胞，并且，获得的造血干细胞具有长期移植重建能力，重建时间大于6个月，能够稳定分化为T/B/M/E等多个血细胞系，科学、临床研究和应用价值高。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种用于将造血祖细胞重编程为造血干细胞的培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括：基础培养基；以及前面所述的组合物。由此，根据本发明实施例的培养基可以有效地将造血祖细胞重编程为造血干细胞，获得的造血干细胞具有长期移植重建能力，能够稳定分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、血红细胞等多个血细胞系，科学研究、临床研究和应用价值高。

根据本发明的实施例，上述用于将造血祖细胞重编程为造血干细胞的培养基还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述JNK-IN-8的浓度为0.1～5μM，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0.5～5μM，所述丙戊酸的浓度为1～20nM，所述Y27632的浓度为1～20μM。根据本发明的具体实施例，JNK-IN-8、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、丙戊酸和Y27632的浓度分别为2μM、1μM、10nM、10μM或3.5μM、0.8μM、15nM、7μM或1.5μM、3μM、8nM、15μM。根据本发明的具体实施例，所述JNK-IN-8的浓度为1～3μM，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0.5～2μM，所述丙戊酸的浓度为6～15nM，所述Y27632的浓度为5～15μM。发明人经过大量实验获得上述较优浓度，由此，获得的造血干细胞具有较高的长期移植重建能力，能够稳定分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、血红细胞等多个血细胞系。

根据本发明的实施例，所述基础培养基选自含有Flt3配体、血小板生成素(TPO)、干细胞生长因子(SCF)以及低密度脂蛋白(LDL)至少之一的stemspan培养基。发明人经过大量实验获得上述较优组成，由此，获得的造血干细胞具有较高的长期移植重建能力，能够稳定分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、血红细胞等多个血细胞系。

根据本发明的实施例，所述Flt3配体的浓度为60～100ng/mL，所述血小板生成素的浓度为20～50ng/mL，所述干细胞因子的浓度为60～100ng/mL，所述低密度脂蛋白的浓度为5～20μg/mL。根据本发明的具体实施例，Flt3配体、血小板生成素、干细胞因子和低密度脂蛋白的浓度分别为100ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、10μg/ml或者80ng/ml、30ng/ml、80ng/ml、15μg/ml或者90ng/ml、40ng/ml、90ng/ml、6μg/ml。根据本发明的具体实施例，所述Flt3配体的浓度为80～100ng/mL，所述血小板生成素的浓度为40～50ng/mL，所述干细胞因子的浓度为80～100ng/mL，所述低密度脂蛋白的浓度为5～15μg/mL。发明人经过大量实验获得上述较优浓度，由此，获得的造血干细胞具有较高的长期移植重建能力，能够稳定分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、血红细胞等多个血细胞系。

需要说明的是，本发明对于stemspan培养基的类型不作严格限定，可以根据实际情况灵活选择。根据本发明的具体实施例，stemspan培养基选自StemSpan SFEM培养基。由此，效果较佳。

根据本发明的实施例，本发明提出了JNK-IN-8、丙戊酸和Y27632；以及任选的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在制备组合物或培养基中的用途，所述组合物或培养基用于将造血祖细胞重编程为造血干细胞。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种获得造血干细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：抑制造血祖细胞的下列至少之一的代谢通路：JNK信号通路、HDAC信号通路和ROCK信号通路。发明人发现，通过抑制JNK信号通路、HDAC信号通路和/或ROCK信号通路有效地使造血祖细胞重编程为造血干细胞，并且，获得的造血干细胞具有长期移植重建能力，能够稳定分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、血红细胞等多个血细胞系，应用前景广泛。

需要说明的是，本发明对于能够抑制JNK信号通路、HDAC信号通路和ROCK信号通路的物质或者抑制方式不作严格限制，只要能够起到抑制上述三个通路的至少之一，获得造血干细胞即可，具体可以根据实际需要灵活选择。根据本发明的实施例，采用上述的组合物以便抑制JNK信号通路、HDAC信号通路和ROCK信号通路。发明人分别对能够抑制JNK信号通路、HDAC信号通路和ROCK信号通路的众多小分子物质进行高通量筛选分析，发现JNK-IN-8(JNK信号通路抑制剂)、丙戊酸(HDAC信号通路抑制剂)和Y27632(ROCK信号通路抑制剂)3因子或者加上烟酰胺腺嘌呤二核苷酸联合使用均可以获得造血干细胞，并且，获得的造血干细胞具有长期移植重建能力。

根据本发明的实施例，所述方法包括：将造血祖细胞培养于上述所述的培养基中。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种造血干细胞。根据本发明的实施例，所述造血干细胞是利用前面所述获得造血干细胞的方法获得的。由此，根据本发明实施例的造血干细胞具有长期移植重建能力，能够稳定分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、血红细胞等多个血细胞系，应用前景广泛。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于将造血祖细胞重编程为造血干细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述的用于将造血祖细胞重编程为造血干细胞的组合物或前面所述的培养基。由此，根据本发明实施例的试剂盒可以有效地将造血祖细胞重编程为造血干细胞，获得的造血干细胞具有长期移植重建能力，能够稳定分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、血红细胞等多个血细胞系，科学研究、临床研究和应用价值高。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述的组合物在制备抑制剂中的用途。根据本发明的实施例，所述抑制剂用于将造血祖细胞重编程为造血干细胞，抑制造血干细胞的下列至少之一的代谢通路：JNK信号通路、HDAC信号通路和ROCK信号通路。如前所述，JNK-IN-8、丙戊酸和Y27632或者加上NAD可以有效地抑制JNK信号通路、HDAC信号通路和/或ROCK信号通路，将造血祖细胞重编程为造血干细胞，并且，获得的造血干细胞具有长期移植重建能力，重建时间大于6个月，能够稳定分化为T/B/M/E等多个血细胞系，科学、临床研究和应用价值高。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前面所述的组合物、前面所述的培养基或者前面所述的造血干细胞。如前所述，根据本发明实施例的组合物可以将造血祖细胞重编程为造血干细胞，直接或者间接将该组合物或者该培养基作为药物组合物给药至机体内(动物或细胞)，起到获得造血干细胞的目的，也可以将利用前面所述获得造血干细胞的方法所获得的造血干细胞施加于机体内，其具有较好的体内重建功能和重建效率，可以广泛地用于血液系统疾病以及自身免疫疾病的治疗中，具有重大的科学研究、临床研究和应用价值。

根据本发明的实施例，本发明的药物组合物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的药物组合物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。

在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的间充质干细胞可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将候选药物与造血祖细胞进行培养；测定培养前后细胞内JNK信号通路、HDAC信号通路和ROCK信号通路的至少之一是否被抑制以及是否获得造血干细胞；当培养后所述JNK信号通路、HDAC信号通路和ROCK信号通路的至少之一被抑制以及获得造血干细胞，是所述候选药物为目标药物的指示，所述目标药物为前面所述的组合物或者前面所述的培养基或者前面所述的药物组合物。如前所述，根据本发明实施例的组合物能够抑制上述三条代谢通路的至少之一，从而起到将造血祖细胞重编程为造血干细胞的效果。同时，获得的造血干细胞具有长期移植重建能力。因此，通过采用根据本发明实施例的筛选药物的方法，可以有效地筛选出本发明的组合物或者含有其的培养基或者药物，具有重大的科学研究、临床研究和应用价值。

在本发明的又一方面，本发明提出了JNK-IN-8、丙戊酸、Y27632以及任选的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在将造血祖细胞重编程为造血干细胞中的用途。如前所述，JNK-IN-8、丙戊酸和Y27632或者JNK-IN-8、丙戊酸、Y27632和NAD可以将造血祖细胞重编程为造血干细胞，并且，获得的造血干细胞具有长期移植重建能力，能够稳定分化为T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、血红细胞等多个血细胞系，应用前景广泛。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的将造血祖细胞重编程为造血干细胞的工艺流程示意图；

图2显示了根据本发明实施例的造血干细胞在含有不同小分子化合物的培养基中培养后的流式细胞分析结果示意图；

图3显示了根据本发明实施例的CD34⁺CD38⁺细胞培养第7天的重编程细胞体外表型鉴定分析示意图；

图4显示了根据本发明实施例的造血干细胞移植重建20周后造血干细胞的流式细胞分析示意图；

图5显示了根据本发明实施例的造血干细胞的基因表达谱分析示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在该实施例中，按照下列方法获得造血干细胞：

操作流程参见图1，具体步骤如下：

1、脐带血分离CD34⁺细胞

1)脐带血的采集

在手术室无菌环境中采集胎儿脐带中血液，保存于加有抗凝剂的血袋，暂时存放于4℃微环境中，于24小时内送达实验室使用。

2)分离脐带血中的单核细胞

a)在无菌实验台中，将脐带血转移到提前准备好的无菌培养瓶里，按照血液：磷酸盐缓冲溶液＝1.2的体积加入磷酸盐缓冲液，混匀；

b)将稀释的脐带血贴壁缓慢加入盛有15ml人淋巴分离液的50ml离心管中，注意缓慢加入，保持两液面界面清晰，不能打破血液和淋巴分离液之间的液面平衡；

c)在室温下，1500转/分钟离心20分钟；

d)离心结束后，液面分为三层，最上层是血浆/组织匀浆层，最下面是红细胞，中间层是分离液，在血浆层与分离液层之间是一层薄而致密的白膜，即单核细胞层(包括了淋巴细胞和单核细胞)。小心吸取白膜层细胞到另一个50ml离心管中；

e)用PBS等比稀释到50ml体积，颠倒混匀；

f)在室温下，以1600转/分钟离心10分钟；

g)弃上清，用PBS重悬备用。

3)磁珠分选法分离CD34⁺细胞

a)按照一定比例，将人CD34磁珠与脐带血中分离的单核细胞混合，吹匀，放到4℃冰箱中静置30分钟，同时将磁珠分选所需要的设备放到超净台中，用紫外光照射除菌；

b)加入10ml PBS混匀，1600转/分钟离心5分钟；

c)弃上清，用含有0.5％BSA的PBS重悬，准备过吸附柱；

d)用含有0.5％BSA的PBS润洗吸附柱，然后加入单核细胞悬液，等待其完全通过吸附柱；

e)用1ml含有0.5％BSA的PBS清洗吸附柱，重复3遍；

f)将吸附柱转移到15ml离心管中，再往吸附柱滤膜上加入1ml含有0.5％BSA的PBS，将吸附在滤膜上的携带有CD34磁珠的细胞冲洗到离心管中；

g)离心，弃上清，加入培养基重悬CD34⁺细胞。

4)流式分析所得单核细胞中CD34⁺所占比例

a)将所得携带有CD34磁珠的细胞取出一小部分到1.5ml离心管中；

b)加入相应的表面蛋白抗体，静置于4℃冰箱中；

c)30分钟后取出，加入1ml PBS；

d)1600转/分钟，离心3分钟；

e)弃上清，用200μl预冷的PBS重悬，即可用流式细胞分析仪检测分析所得细胞的表型。

2、细胞培养方法

1)用含有SCF(100ng/ml)、Flt-3L(100ng/ml)、TPO(50ng/ml)、LDL(10μg/ml)的StemSpan SFEM培养基(Stemcell品牌)重悬CD34⁺CD38⁺细胞，加入6孔低贴附板中，每孔中细胞数为10000个；

其中，实验组为在上述培养基中加入2μM JNK-IN-8、1μM NAD、10nM VPA、10μMY27632后培养所得的造血干细胞(简称4F组)，对照组为用等体积的DMSO代替实验组中的4个因子后培养所得的细胞(简称DMSO组)；

2)将培养基放到37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养；

3)每2天，进行半量更换培养基，保证细胞密度为1×10⁶颗/ml以下；

4)培养一段时间后，检测细胞表型变化，并计算细胞数量。

以1000个造血干细胞领域公开采用的化合物作为研究对象，加入步骤2中1)的培养基中，培养7天后，利用流式细胞仪对细胞进行分析。图2中罗列了部分获得造血干细胞量的实验数据。其中，其中，J8为JNK-IN-8，RA为Rapamycin，JN为同时添加JNK-IN-8和NAD，JY为同时添加JNK-IN-8和Y27632，NY为同时添加NAD和Y27632，JNY为同时添加JNK-IN-8、Y27632和NAD，JRY为同时添加JNK-IN-8、Rapamycin和Y27632，JYVN为同时添加JNK-IN-8、NAD、VPA和Y27632(4F组)，JVY为同时添加JNK-IN-8、VPA和Y27632。

最初，发明人发现，相比于单独添加JNK-IN-8、Y27632、NAD和VPA或者是其他因子而言，同时添加JNK-IN-8、Y27632和VPA这3个因子或者同时添加JNK-IN-8、NAD、Y27632和VPA这4个因子，造血干细胞的扩增效率较高，其中，4因子的效果最佳。进一步地，发明人发现，3因子组合或者4因子组合不仅可以提高造血干细胞的扩增能力，而且具有使造血祖细胞重编程为造血干细胞的效果，并且，获得的造血干细胞具有长期移植重建能力。

研究表明，CD34⁺CD38⁺细胞这类细胞不具备长期移植重建能力(<3个月)，将其作为起始细胞，可以准确地判断出经培养后的细胞是否具备移植重建能力。结果如图3所示，培养7天后，实验组4F的CD34⁺CD45RA^-和CD34⁺CD90⁺细胞群明显超越DMSO对照组，说明JNK-IN-8、NAD、VPA和Y27632可以有效地将CD34⁺CD38⁺表型的造血祖细胞重编程为具有CD34⁺CD90⁺或CD34⁺CD45RA^-表型的造血干细胞。

将培养后细胞通过尾静脉注射到NPG重度免疫缺陷鼠体内，移植重建20周，流式检测NPG小鼠外周血中人源细胞重建比例，以判定造血干细胞的重建功能。结果如图4所示，可以看出，采用JNK-IN-8、NAD、VPA和Y27632可以有效地提高造血干细胞的体内重建功能和重建效率。

对培养所得到的造血干细胞的基因表达谱进行比对分析，所挑选基因是根据历史报道文献总结而成的，均是与造血干细胞自我更新和增殖密切相关的基因。结果如图5所示，培养2天后，利用4因子培养基培养后的细胞基因表达谱更接近于原代造血干细胞，培养7天后，利用4因子培养基培养后细胞的基因表达谱与4F培养条件培养两天的细胞表达谱几乎保持一致，但DMSO对照组细胞在培养2天(D2)后其自我更新和增殖的关键基因表达量已经下降，培养到第7天(D7)已经发生彻底改变，丢失干性基因表达。由此，可以从基因表达层面证明采用JNK-IN-8、NAD、VPA和Y27632培养后的CD34⁺CD38⁺的造血祖细胞具备了与CD34⁺的原代造血干细胞可比的基因表达谱。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。