一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法

文档序号：1609397 发布日期：2020-01-10 浏览：8次 >En<

阅读说明：本技术 一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法 (Method for constructing insecticidal beauveria bassiana engineering bacteria ) 是由李同祥孙会刚田林汤薇黄天姿董玉玮李文王春艳高兆建王陶于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法,设计引物从pUC57-AaIT载体中PCR扩增AaIT基因,经酶切、纯化和pbarGPEl构建pbarGPEl-AaIT载体；用引物扩增出GpdA-AaIT-TrpC表达盒；用Not1单酶切pGPS3Ben-bbchit1并去磷酸化,与用Not1酶切的GpdA-AaIT-TrpC连接,转化筛选获得pGPS3Ben-bbchit1-AaIT表达载体,将其导入根癌农杆菌感受态细胞中获得阳性转化子菌落；球孢白僵菌孢子悬液和含pGPS3Ben-bbchit1-AaIT载体的根癌农杆菌液混合,经固体IM培养基、CPZ选择培养基筛选获得转化球孢白僵菌工程菌株。本发明构建的球孢白僵菌工程菌株可制备高效杀虫生物防治剂,对环境无污染且防治效果良好,适合在生物防治技术领域推广。(The invention discloses a method for constructing a beauveria bassiana engineering bacterium, which comprises the steps of designing a primer to amplify an AaIT gene from a pUC57-AaIT carrier through PCR, and constructing a pbarGPEl-AaIT carrier through enzyme digestion, purification and pbarGPEl; amplifying a GpdA-AaIT-TrpC expression cassette by using a primer; singly digesting pGPS3Ben-bbchi 1 by using Not1 enzyme, dephosphorizing, connecting with GpdA-AaIT-TrpC digested by Not1 enzyme, transforming, screening and obtaining a pGPS3Ben-bbchi 1-AaIT expression vector, and introducing the vector into a root cancer agrobacterium infected cell to obtain a positive transformant colony; mixing the beauveria bassiana spore suspension and the agrobacterium tumefaciens liquid containing pGPS3Ben-bbchit1-AaIT carrier, and screening by a solid IM culture medium and a CPZ selective culture medium to obtain the transformed beauveria bassiana engineering strain. The beauveria bassiana engineering strain constructed by the invention can be used for preparing a high-efficiency insecticidal biological control agent, has no pollution to the environment and good control effect, and is suitable for popularization in the technical field of biological control.)

一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法

技术领域

本发明涉微生物虫害防治技术领域，尤其涉及一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法。

背景技术

真菌杀虫剂是以昆虫病原真菌为有效成分的生物农药，目前世界上已记载的杀虫真菌大约有100个属，800多个种，其中约50％集中于半知菌亚门(Deuteromycotina)，主要分布在白僵菌属((Beau veria)、绿僵菌属(Metarhizium)、拟青霉属(Paecilomyces)、被毛孢属(Hirsutella)、蟪霉属(Nom uraea)、轮枝霉属(Verticillium)等。在中国、巴西、俄罗斯和欧美国家，真菌杀虫剂已广泛用于农林害虫和城市昆虫的防治。目前世界上已有60多个真菌杀虫剂产品问世。同时与其它杀虫微生物相比，昆虫病原真菌具有主动致病昆虫、扩散效果好、土壤宿存能力较长、寄主不易产生抗性和容易生产等优点。因此，昆虫病原真菌在害虫防治已得到广泛的开发和应用。

昆虫病原真菌中，研究最多、应用效果最好的是白僵菌(Beauveria bassiana)。白僵菌的分布范围很广，从海拔几米至2000多米的高山均有白僵菌的存在，白僵菌可以侵入6个目15科200多种昆虫、螨类。与细菌、病毒等需要被昆虫取食到消化道后才能发挥毒杀作用机理不同，白僵菌经分生孢子对寄主的附着、萌发、直接穿透表皮，菌丝在血腔内生长，产生白僵素(大环脂类毒素)和草酸钙结晶，引起昆虫中毒，导致昆虫死亡。白僵菌主要通过昆虫体壁侵入虫体内。对咀嚼式和刺吸式口器的害虫都有效果。它与环境具有很好的相容性，对人畜安全，对有益昆虫无毒害，并且还能够在环境中存活、扩散、定殖，保持一定的种群数量，从而能够持续使害虫数量处于低水平状态，实现植物保护和环境保护的可调持续发展。因此，白僵菌在害虫综合治理方面受到了越来越多的关注，成为生物农药研究和发展的理想选择之一。

球孢白僵菌已开发成为广泛应用的微生物杀虫剂。1995年美国环保暑(EPA)允许Mycotech公司生产的球孢白僵菌制剂Mycotrol RWP用于防治蚜虫和粉虱。我国20世纪50年代开始白僵菌的研究和应用，2006年球孢白僵菌在我国获得登记。多年来，国内应用白僵菌对近40种农林害虫进行了有效防治，主要包括松毛虫、玉米螟、茶小绿叶蝉、蛴螬、蝗虫、桃小食心虫、黄地老虎、地老虎、马铃薯甲虫、松褐天牛、白蚁、水稻叶蝉、木麻黄毒蛾、樟荣叶甲、甘薯象甲、茶小绿叶蝉、大豆食心虫、三化螟、糜子地老虎、黑翅白蚁、甜菜象甲、三叶草夜蛾、白杨透翅蛾等。应用球孢白僵菌防治松毛虫、玉米螟是世界上杀虫真菌应用面积最大、最为成功的事例之一，目前仍保持50万hm²/年，应用面积最高年份达134万hm²，其中，球孢白僵菌对松毛虫的防治效果可达90％以上。

但是，球孢白僵菌也和其他生物农药一样也具有较长的侵染潜伏期，击倒害虫速度慢、防效不稳定、杀虫谱过窄等缺点，这一直是影响其应用推广的重要因素，也导致真菌杀虫剂在农药市场的占有率低。

将外源毒素基因(如北非蝎Androctones australis昆虫特异性神经毒素多肽基因，AaIT)导入昆虫病原真菌以提高真菌杀虫毒力。引入蝎毒基因(AaIT)而构建的绿僵菌工程菌株对烟草天蛾和埃及伊蚊子的致死剂量减少了至少20倍。可见，采用毒力基因或外源毒素基因超量表达等基因工程技术可极大地提高虫生真菌的杀虫效率。通过基因工程等手段对昆虫病原真菌进行改造，获得安全、高效的真菌工程菌杀虫剂，已成为真菌生物农药发展的主要方向和趋势。有目的地对生产菌株进行遗传改良，获得高效工程菌并研制高活性新剂型，最终创造出适合市场需要的真菌杀虫剂，将大大加快真菌杀虫剂产业化步伐。

在过去的10多年间，高毒力杀虫真菌工程菌选育研究取得了令人瞩日的进展，工程菌株的毒力明显提高，为杀虫真菌的应用展示了良好的前景。但是，高毒力杀虫真菌工程菌选育的进展还不够理想，至今还没有选育出致死时间缩短50％以上的工程菌株，也没有一个工程菌株用于生产。因此，迫切需要安全、高毒力杀虫真菌工程菌研究和开发。

通过根癌农杆菌介导转化球孢白僵菌，建立一个含有内源毒力基因bbchit1和外源毒素基因AaIT的虫生真菌的高毒力超表达的遗传转化方法和实验操作流程，将为开展虫生真菌遗传改良以及分子生物学提供一个实验和技术平台。为高效杀虫剂的研制提供了基础资源，克服真菌杀虫剂长久以来的弱点问题，将大大加速真菌杀虫剂的产业化步伐，达到生物治理，促进生态农业发展具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种建立一个含有内源毒力基因bbchit1和外源毒素基因AaIT的虫生真菌的高毒力工程菌转化方法和实验操作流程，对环境无污染、防治效果良好且成本低的虫害生物防治方法。为了解决上述技术问题,本发明提供了一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法，具体步骤如下：

(1)设计扩增AaIT基因引物，引物设计时分别引入BamHI和EcoR1酶切位点，利用设计的引物从pUC57-AaIT中扩增AaIT基因序列。

(2)AaIT基因的PCR扩增产物经纯化后，用BamHI和EcoRI酶进行酶切，同时用BamHI和EcoRI酶酶切pbarGPEl(BioVector NTCC Inc.)，分别进行纯化后，建立连接反应体系连接AaIT基因和pbarGPEl(摩尔比为3:1)。

(3)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞并进行验证，构建成pbarGPEl-AaIT载体。

(4)设计含Not1酶切位点的引物，从pbarGPEl-AaIT载体扩增出GpdA-AaIT-TrpC表达盒。

(5)用Not1酶酶切pGPS3Ben-bbchit1(BioVector NTCC Inc.)，并进行去磷酸化处理。

(6)将第五步得到的去磷酸化处理的pGPS3Ben-bbchit1和GpdA-AaIT-TrpC表达盒连接，获得pGPS3Ben-bbchit1-AaIT表达载体，转化大肠杆菌，提取质粒。

(7)第六步提取的质粒采用冻融法导入根癌农杆菌感受态细胞中，重悬菌体并均匀涂布在YEB平板上(含氨苄和苯菌灵浓度分别为12.0μg/m和8.0μg/mL)进行抗性筛选，获取根癌农杆菌阳性菌落。

(8)球孢白僵菌孢子悬液和含pGPS3Ben-bbchit1-AaIT载体的根癌农杆菌菌液按一定比例混合，经在固体IM培养基上共培养和CPZ选择培养基上多次筛选获得转化工程菌株。

上述方法中，球孢白僵菌可以通过常规的制备方法自制得到，也可以通过购买得到。本发明中所用球孢白僵菌和pUC57-AaIT均为自制得到。

进一步地，所述步骤(7)YEB培养基:蔗糖0.5％(w/v),细菌用酵母提取物0.1％(w/v),细菌用胰化蛋白陈1％(wlv),MgS0₄.7H₂0 0.05％(w/v).

进一步地，所述步骤(7)涂板抗性筛选中氨苄和苯菌灵浓度分别为12.0μg/m和8.0μg/mL。

进一步地，所述步骤(8)CPZ(察氏培养基):蔗糖3％(w/v),NaNO₃0.2％(w/v),KCl0.05％(w/v),MgSO₄.7H₂O 0.05％(w/v),FeSO₄ 0.0001％(w/v),K₂HPO₄0.1％(w/v),500μg/mL头孢霉素和60μg/mL PPT。

进一步地，所述步骤(8)中IM培养基的成分及配比：NaCl 0.03％(w/v)，MgS0₄.7H₂00.03％(w/v)，K₂HP0₄ 0.03％(w/v)，甘油0.5％(v/v)，MES 0.04mmo1/L。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：

1、在进行表达载体构建中，采用采用ben(苯菌灵)和Amp^r(氨苄抗性)为抗性标记，不但有效地筛选出转化子，简化了实验程序，提高工作效率，而且赋予了球孢白僵菌工程菌抗苯菌灵的新性状。

2、构建以苯菌灵(Ben)为抗性标记基因、几丁质酶(bbchit1)和北非蝎毒素(AaIT)基因为目的基因的pGPS3Ben-bbchit1-AaIT组成性双价表达载体，结合通过根癌农杆菌介导转化球孢白僵菌获得工程菌后，不仅将目的基因***工程菌基因组中，获得稳定遗传。而且在侵染害虫的过程中，可以超表达几丁质酶，使其迅速穿透昆虫体壁，也同时产生蝎毒素毒杀害虫，大大缩短击倒时间，提高杀虫毒力。

3、本发明中采用球孢白僵菌工程菌进行生物防治，一方面避免了化学药剂对人畜的危害，另一方促进了环境生态平衡，实现了农业的可持续发展，适合在种植领域推广和使用。

附图说明

图1工程菌PCR验证产物琼脂糖凝胶电泳图。泳道1：PCR产物(AaIT和ben扩增产物)，泳道M：Maker 1000bp

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

PbarGPEl和pbarGPEl-AaIT购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。

具体实施步骤：

实施例1:

重组pbarGPEl-AaIT载体的构建

[1]pUC57-AaIT中扩增AaIT基因

以pUC57-AaIT质粒为模板,合成引物，扩增出AaIT基因序列，引物序列如下：

AaIT-F(BamH I)：5'-SEQ ID NO：1-3'；

AaIT-R(EcoRI)：5'-SEQ ID NO：2-3'。

上游引物(AaIT-F)引入BamH I位点，下游引物(AaIT-R)引入EcoRI的酶切位点。5’端各引入两个酶切位点保护碱基。进行PCR扩增。反应体系(25μl):DNA(质粒)1.0μl，10×buffer(Mg²⁺)2.5μl，dNTP 1.0μl，上、下游引物各1.0μl，Taq酶0.5μl，ddH₂O 18.0μl。PCR扩增程序:94℃5min，94℃45s，64℃45s，72℃1min,共32个循环。72℃10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后,切下目的条带,用DNA Gel Extraction Kit回收。

[2]pbarGPEl质粒和AaIT基因片段的酶切反应及纯化

在微量离心管中制备酶切体系如下(20μl体系)：10×Buffer H 2μl，0.1％BufferBSA 2μl，DNA (质粒或者基因片段)4μl，EcoR I 1μl，BamH I 1μl，ddH₂O 10μl，37℃水浴3h，用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果并进行纯化。

[3]pbarGPE1质粒和AaIT基因片段连接

在微量离心管中制备连接反应体系如下(25μl体系)：10×T₄ DNA Ligase Buffer2.5μl，DNA(AaIT)片段14.5μl，载体DNA 7μl，T₄ DNA Ligase 1μl，ddH₂O 10μl，16℃过夜反应。

[4]pbarGPE1-AaIT质粒转化大肠杆菌感受态细胞

从-70℃低温冰箱中取出感受态细胞(DH-5α)并置于冰上，直至完全溶化。200μl感受态细胞(DH-5α)中加入20μl连接产物，轻弹混匀，冰上静置30min。42℃热激90s，取出，冰浴1～2min。加入800μl LB培养基，用枪混匀。置于37℃环境中复苏45min。取200μl的培养基，涂LB抗性平板，37℃倒置过夜培养。次日，用灭过菌牙签挑单菌落于装有5ml的LB培养液的试管中，37℃摇菌过夜。

[5]菌落PCR验证pbarGPE1-AaIT

以上述摇菌过夜的菌液为模板，进行PCR验证。反应体系如下(25μl体系)：DNA 1.0μl；10×buffer(Mg2+Plus)，2.5μl；dNTP，1.0μl；上游引物1.0μl；下游引物1.0μl；Taq酶0.5μl；ddH2O 18.0μl。

PCR扩增程序：94℃预变性5min，接着进行32个循环：94℃变性45s，60.5℃退火45s，72℃延伸1.5min；循环结束后72℃延伸10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

验证引物序列为：

正向引物AaITF：5’-SEQ ID NO：1-3’；反向引物AaITR：5’-SEQ ID NO：2-3’。

实施例2

pGPS3Ben-bbchit1-AaIT表达载体的构建

[1]目的基因片段GpdA-AaIT-TrpC的扩增

以含pbarGPE1-AaIT质粒为模板，以trpCR、gpdAF为引物，进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃预变性5min，接着进行32个循环：94℃变性45s，60.5℃退火45s，72℃延伸1.5min；循环结束后72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，用DNA GelExtraction Kit回收。所用引物：正向引物(NotI)：gpdAF 5'-SEQ ID NO：3-3'；反向引物(NotI)：trpCR 5'-SEQ ID NO：4-3'。

[2]pbenGPS3-Bbchit1质粒和GpdA-AaIT-TrpC基因片段的酶切

在微量离心管中制备酶切体系如下(20μl体系)：10×Buffer H 2μl，0.1％BufferBSA 2μl，DNA(质粒或者基因片段)4μl，NotI 2μl，ddH₂O 10μl，37℃水浴3h，用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

[3]pbenGPS3-Bbchit1质粒酶切后的去磷酸化反应

质粒单酶切后会发生自身环化现象，为防止线性质粒自身环化的发生，对其进行去磷酸化处理(50μl体系)：DNA Fragments 30μl，10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μl，CIAP 2μl，ddH₂O 13μl，在37℃下反应30min。

[4]pbenGPS3-Bbchit1质粒和GpdA-AaIT-TrpC基因片段的连接反应在微量离心管中制备连接反应体系如下(25μl体系)：10×T₄ DNA Ligase Buffer 2.5μl，DNA片段14.5μl，载体DNA 7μl，T₄ DNA Ligase 1μl，ddH₂O 0μl，16℃过夜反应，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。

[5]菌落PCR验证pbenGPS3-Bbchit1-AaIT

以上述摇菌过夜的菌液为模板，以trpCR、gpdAF和BenR、BenF两对引物，进行PCR验证。

验证GpdA-AaIT-TrpC引物：

正向引物(NotI)：gpdAF 5'-SEQ ID NO：3-3'；

反向引物(NotI)：trpCR 5'-SEQ ID NO：4-3'；

验证ben基因引物：

正向引物BenF：5'-SEQ ID NO：5-3'；

反向引物BenR：5'-SEQ ID NO：6-3'；

实施例3

pbenGPS3-Bbchit1-AaIT载体质粒导入根癌农杆菌

提取pbenGPS3-Bbchit1-AaIT质粒DNA，采用冻融法将该载体导入根癌农杆菌中，将载体质粒DNA加入到100μl根癌农杆菌感受态细胞中，混匀后，冰浴30min。液氮速冻5min后，37℃，温浴5min，立即冰浴2min。加入1000μ1液体YEB，200r/min，28℃培养3-5h后，10000r/min离心收集菌体，用100μl液体YEB重悬菌体并均匀涂布在YEB平板上(含氨苄和苯菌灵浓度分别为12.0μg/m和8.0μg/mL)，挑取阳性菌落。

实施例4

根癌农杆菌介导球孢白僵菌遗传转化

[1]根癌农杆菌的培养及处理

接种实施例3中获得的根癌农杆菌单菌落到3ml液体YEB中(含氨苄和苯菌灵)，200r/min、28℃摇床培养过夜。10000r/min离心收集菌体，用适量的IM液体培养基(含11mmol/L葡萄糖和350μmol/L乙酰丁香酮(acetosyritone，AS))重悬菌体，并将菌液浓度调到在660nm处的吸收值为0.16。

[2]球孢白僵菌分生孢子的培养及处理

取适量的球孢白僵菌孢子到加入SDAY培养基中，涂布均匀并培养至孢子大量产生。取适量的孢子到5ml无菌的0.05％(v/v)Tween 80液中，涡旋分散孢子后用无菌的4层擦镜纸过滤孢子悬液除去菌丝。将孢子悬液转入10ml的离心管中，8000r/min离心10min收集孢子。用5ml无菌生理盐水(0.85％(w/v)NaCl)重悬孢子，8000r/min离心10min再次收集孢子。再用适量的生理盐水重悬孢子。

[3]根癌农杆菌介导球孢白僵菌遗传转化

取上述孢子悬液和根癌农杆菌菌液各100μl到无菌的1.5ml离心管中，混匀，将上述混合物涂布在固体IM培养基上(含5mmol/L葡萄糖和400mmol/L乙酰丁香酮)，28℃共培养48h,加入2m1无菌水到上述培养皿中，仔细洗涤共培养物(防止产生培养基碎片),将洗涤下来的培养物均匀涂布在选择培养基上(CPZ培养基含500μg/mL头孢霉素和60μg/mL PPT)26℃培养8-10d至抗性菌落出现。将抗性菌落转到同样的选择培养基上，进行第二次筛选。

球孢白僵菌工程菌验证：

(1)转基因工程菌株的PCR验证

通过PCR扩增验证ben(抗苯菌灵)基因和AaIT基因来分析转化子。所用的上下游引物分别为：

验证AaIT基因引物：

引物AaIT-F(BamHI)：5'-CGGGATCCATGCGTGAACTTTCTTCGGTTCT-3'；

引物AaIT-R(EcoRI)：5'-CGGAATTCTTAGTTGATGATGGTGGTATCGCAG-3'；

验证ben基因引物：

正向引物BenF：5'-SEQ ID NO：5-3'；

反向引物BenR：5'-SEQ ID NO：6-3'；

扩增体系为:10×PCR buffer 2.5μl,25mmol/L MgCl₂ 1.5μl，2.5mmo1/L dNTPs1μl,引物(浓度均为5μmol/L)各1μl，DNA 50ng，Taq DNA聚合酶1U(Promega)，总体积为25μl。采用的TD-PCR(touch down PCR)扩增程序为94℃5min，94℃l min,55℃45sec,72℃lmin，共10个循环，每个循环退火温度下降0.5℃；94℃l min,50℃45sec,72℃l min，共25个循环；72℃延伸10min。

随机挑选5个转化子菌落，进行单引物对(AaIT基因引物或ben基因引物)或双引物对(AaIT基因引物和ben基因引物)的PCR扩增，均能得到目标产物，图1为双引物对扩增其中之一菌落结果，可以看出，这个随机挑选的转化子菌落PCR产物在600bp左右和350bp左右处各有明显的亮带，与设计的PCR引物应扩出的条带大小一致，进一步的测序结果与目的片段大小相同，说明转化子中含有苯菌灵(ben)基因片段和外源蝎毒基因(AaIT)基因片段，载体构建及遗传转化均已成功。

(2)工程菌毒力测定验证

从平板上刮取工程菌分生饱子到无菌的0.05％(v/v)Tween80液中。涡旋分散孢子后，用四层擦镜纸过滤孢子悬液除去菌丝。血球计数器计算孢子浓度，并将孢子悬液浓度调节为10⁶个孢子/mL。将3龄菜青虫在孢子悬液中浸泡10s后，转移到吸水纸上以除去虫体上多余的水分，然后放入饲养瓶中。每个菌株6个重复，每个重复8头幼虫，同时做对照实验，以无菌的0.05％(v/v)Tween80液和野生型白僵菌(原受体菌)分别作为阴性对照和阳性对照。瓶中放入15g新鲜甘蓝叶片饲喂，同时放入内装有水饱和脱脂棉的离心管保湿，每12h更换离心管。25℃培养，光照为每天15h。每天更换一次甘蓝叶片，称量剩余甘蓝叶以确定食物消耗量。每隔13h观察感染情况，统计死亡数，用机率分析法得到半致死时间LT₅₀。

根据连续观测的结果统计每个处理的试虫累积死亡数，采用几率分析法得到半致死时间和食物消耗量分析结果，从表1可以看出，JZ1(转化菌落1)、JZ2(转化菌落2)和JC-1(野生菌)的半致死时间(LT₅₀)分别为34.6h,38.3h和91.8h，与野生型菌株JC-1相比，JZ1和JZ2击倒菜青虫的时间分别缩短了62.3％和58.3％。从毒力分析结果来看，AaIT和Bbchitl在球饱白僵菌致病寄主的过程中均起重要作用，而且组成性表达的AaIT和Bbchitl能协同作用显著球孢白僵菌的毒力。以上结果显示，表明球孢白僵菌双价工程菌构建与转化获得成功。

表1转基因菌株的半致死时间和食物消耗量分析

菌株	菌株半致死时间(h)	平均每头虫的取食量(g±SEM)
			0.05％(v/v)Tween80(阴性对照)		3.4±0.12
JC-1(阳性对照)	91.8	1.6±0.11
			JZ1	34.6	0.7±0.15
JZ2	38.3	0.9±0.12

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