阅读说明：本技术 密码子优化的小反刍兽疫病毒f基因核酸疫苗 (Codon-optimized peste des petits ruminants virus F gene nucleic acid vaccine ) 是由 夏俊 汪萍 苗书魁 杜玮 马文戈 黄炯 金映红 沙吾尔江·阿不都力艾拉 赵洁雅 王 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及分子生物学技术领域,具体的涉及一种密码子优化的小反刍兽疫病毒F基因核酸疫苗。该密码子优化基因序列兼顾了哺乳动物细胞密码子使用偏好,序列如SEQ ID NO.2所示。所涉及的小反刍兽疫病毒F基因核酸疫苗,在剔除F基因5′端信号肽后,将剩余序列经密码子优化,在5′端连接乙型脑炎病毒信号肽序列,最后将该序列插入真核表达载体中。该核酸疫苗在免疫小鼠后有效地刺激了免疫系统,产生了中和抗体,体现了良好的免疫原性。(The invention relates to the technical field of molecular biology, in particular to a codon-optimized peste des petits ruminants virus F gene nucleic acid vaccine. The codon optimized gene sequence gives consideration to the codon usage preference of mammalian cells, and the sequence is shown as SEQ ID NO. 2. The related peste des petits ruminants virus F gene nucleic acid vaccine is characterized in that after a signal peptide at the 5 'end of an F gene is removed, the rest sequence is optimized through a codon, the 5' end is connected with a encephalitis B virus signal peptide sequence, and finally the sequence is inserted into a eukaryotic expression vector. The nucleic acid vaccine effectively stimulates an immune system after immunizing a mouse, generates a neutralizing antibody and embodies good immunogenicity.)

密码子优化的小反刍兽疫病毒F基因核酸疫苗

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体的涉及一种密码子优化的小反刍兽疫病毒F基因核酸疫苗。

背景技术

小反刍兽疫(peste-des-petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste-des-petits ruminants virus，PPRV)引起的一种严重的烈性、接触性传染病，特征为发热、口腔及舌黏膜糜烂、流泪、流鼻涕、腹泻和肺炎。PPR是世界动物卫生组织(OIE)规定必须报告的A类烈性传染病。绵羊与山羊较易感，也可感染牛、水牛、猪和野生动物等。PPRV感染可导致绵羊和山羊高达100％的发病率和显著的死亡率，严重影响粮食安全与牧民的生存，尤其是依赖小反刍动物的发展中国家。自1942年PPR首次暴发于科特迪瓦以来，主要在东非、西非、中非、***半岛和南亚等地流行。2007年7月，PPR首次于我国西藏阿里地区被发现，至2014年9月，全国共有22个省(自治区)256个县先后发生PPR疫情，导致经济损失巨大、社会影响严重。全球计划到2030年消灭小反刍兽疫。我国农业部发布了《全国小反刍兽疫消灭计划(2016-2020年)》，计划到2020年，力争全国达到小反刍兽疫非免疫无疫区标准。因此加强对PPRV应用方面的基础研究显得尤为重要。

PPRV属于副黏病毒科麻疹病毒属，为单股负链不分节段RNA病毒，基因组全长15948bp，由核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、编码基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大蛋白(L)6种结构蛋白和2种非结构蛋白(C和V)构成。F蛋白与病毒的吸附、侵入有关，是决定病毒能否成功感染宿主的关键因素之一，是诱导中和抗体形成的主要保护性免疫原。F蛋白的作用是协助病毒进入宿主细胞。一旦病毒结合到宿主细胞的靶位，F蛋白就调节病毒膜和细胞膜的融合，并允许直接释放的N蛋白进入细胞浆。在病毒感染过程中，新合成的融合蛋白分子使细胞之间发生融合，因为这样的机理，抑制F蛋白的活性，对防止副黏病毒感染是十分重要的。

核酸疫苗(nucleic vaccine)，又名基因疫苗(gene vaccine)或DNA疫苗(DNAvaccine)，是指把外源基因克隆到真核表达载体中，然后将重组质粒导入动物体内，使外源基因通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，激活机体的免疫系统，引发免疫反应。1996年，世界卫生组织将其统一命名为核酸疫苗。它具有如下优点：能够充分模拟自然感染状态，在真核细胞内合成具有相应空间构象的蛋白，不仅可以激发机体产生体液免疫反应还能够诱导产生特异性CD8+细胞毒性淋巴细胞(CTL)的免疫反应；与重组的病毒活载体疫苗除了表达目的基因外还有其自身的许多蛋白要表达相比，核酸疫苗只有载体上的抗原基因在细胞内得到表达，载体本身没有免疫原性，不会刺激机体产生抗体，能更好的保证抗原蛋白的纯度；核酸疫苗能够避免直接接触危险性较高的病原体，并且可在DNA水平对密码子进行优化、修饰，使其能够更高效地表达、更有效地刺激机体的免疫系统；而且核酸疫苗成本低廉，稳定性好，适于大规模生产、运输、保存等。但核酸疫苗也存在着诸多缺点，其中最主要的是核酸疫苗研究和应用的对象主要为真核生物，而目的基因绝大多数来自于病毒或细菌等原核生物，而原核生物与真核生物在密码子使用偏好上存在明显差异，这就导致了核酸疫苗的外源基因在真核细胞内不能高效地表达，不能有效地刺激机体的免疫系统产生应答。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种密码子优化的PPRV F基因序列。

本发明的另一目的是提供一种在优化基础上携带乙型脑炎病毒信号肽(Japaneseencephalitis virus signal peptide，JEVSP)的PPRV F基因核酸疫苗。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种密码子优化的PPRVF基因序列，序列为SEQ ID NO.2。原始PPRVF基因序列，序列为SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.2所示密码子优化的PPRV F基因序列在制备小反刍兽疫疫苗中的应用。

一种PPRV F基因核酸疫苗，由SEQ ID NO.2所示的PPRV F基因序列在剔除信号肽后，将剩余序列经密码子优化，***到真核表达载体所得。

其中，所述的真核表达载体为pcDNA3.1(+)；所述的PPRV F基因核酸疫苗，先将SEQID NO.2所示的PPRV F基因序列在剔除信号肽后，将剩余序列经密码子优化，***到真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I酶切位点之间所得；其5′端连接乙型脑炎病毒信号肽序列。

本发明提供的密码子优化的PPRV F基因序列及其核酸疫苗的构建步骤如下：

1.原始序列的PPRV F基因序列核酸疫苗的构建

以PPRV Nigeria/75/1株为参考序列(GenBank:X74443)，首先选取F基因，全长1641bp，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并装入载体pUC57，构成pUC57-F。用BamH I和XbaI双酶切pUC57-F，并用DNA凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，Cat.no.：AP-GX-250)回收纯化目的片段，用于核酸疫苗的构建。密码子优化前的PPRV F基因序列为SEQ IDNO.1。

2.密码子优化的未含信号肽的PPRV F基因序列核酸疫苗的构建

(1)密码子优化的未含信号肽的PPRV F基因序列的设计和合成

以PPRV Nigeria/75/1株为参考序列(GenBank:X74443)，首先选取F基因，全长1641bp，剔除5′端信号肽(57bp)后剩余1584bp，然后运用软件OptimumGene^TM分析其基因序列，找出其密码子使用偏好，同时找出与羊密码子使用偏好不同的密码子位点，用羊偏好的密码子替代PPRV F基因中使用偏好不同的密码子，然后设计出密码子优化的PPRV F基因序列。由生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成该基因，剔除信号肽且密码子优化的PPRV F基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列，与剔除信号肽且密码子未优化的F基因氨基酸序列保持一致。密码子优化后的F基因序列为SEQ ID NO.2。

(2)对生工生物工程(上海)股份有限公司提供的含有目标序列的重组载体pUC57-F-opt用BamH I和EcoR I双酶切，用DNA凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，Cat.no.：AP-GX-250)回收纯化目的片段，该片段为剔除F基因信号肽后密码子优化的PPRVF基因序列，两端分别连接有BamH I和EcoR I酶切位点的基因序列，以便于核酸疫苗的构建。

3.密码子优化的含信号肽的PPRV F基因序列核酸疫苗的构建

(1)密码子优化的含信号肽的PPRV F基因序列的设计和合成

利用上述2(1)中设计出的密码子优化的PPRV F基因序列，在其5′端连接乙型脑炎病毒信号肽(JEVSP)序列(全长72bp)。由生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成得到该基因。乙型脑炎病毒信号肽(JEVSP)序列为SEQ ID NO.3。

(2)对生工生物工程(上海)股份有限公司提供的含有目标序列的重组载体pUC57-JEVSP-F用BamH I和EcoR I双酶切，用DNA凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，Cat.no.：AP-GX-250)回收纯化目的片段，该片段为密码子优化的PPRV F基因序列，两端分别连接有BamH I和EcoR I酶切位点，以便于核酸疫苗的构建。

4.将步骤1得到的基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，得到重组质粒pcDNA3.1(+)-F。将步骤2得到的基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，得到重组质粒pcDNA3.1(+)-F-opt。将步骤3得到的基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，得到重组质粒pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt。经对重组质粒抽提、酶切、测序后，确定得到了与预期相符的质粒，即为本发明所述的PPRV F基因核酸疫苗。

有益效果：与野生型基因相比，密码子优化的PPRVF基因序列中羊细胞偏好的密码子出现频率增加，但是其编码的PPRVF蛋白氨基酸序列不变，从而使其更适于在羊细胞中的蛋白表达，更有利于刺激机体产生免疫应答。

由于目前对基因序列的密码子优化尚没有统一的标准或原则，因此不同的研究人员完全会设计出不同的核苷酸序列用于目标蛋白质的表达，相应地表达效率也可能存在明显差异。根据本申请优化的核苷酸编码序列，克服了上述缺陷，提高了PPRV F蛋白表达水平；将该优化后的基因用于构建核酸疫苗，在免疫小鼠后更有效地刺激了免疫系统，产生了中和抗体，体现了良好的免疫原性。同时，在密码子优化的基础上，将该序列与(JEVSP)信号肽相连接，更有效地促进蛋白的分泌和提高目的蛋白诱导抗体产生的能力。

本发明将经过密码子优化的PPRV F基因和(JEVSP)信号肽序列直接克隆入真核表达载体，构建了PPRV核酸疫苗pcDNA3.1(+)-F-opt、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt，这两种疫苗免疫动物能刺激产生中和抗体。而pcDNA3.1(+)-F-opt与pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt相比，引入JEVSP信号肽的pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt能更有效地产生中和抗体。由此可见，pcDNA3.1(+)-F-opt、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt核酸疫苗具有良好的免疫原性。

附图说明

图1所示为重组质粒pcDNA3.1(+)-F、pcDNA3.1(+)-F-opt、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt的酶切电泳图谱；其中，M泳道，GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder；B泳道，质粒pcDNA3.1(+)-F经BamH I和Xba I双酶切电泳图；C泳道，质粒pcDNA3.1(+)-F-opt经BamH I和EcoR I双酶切电泳图；D泳道，质粒pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt经BamH I和EcoR I双酶切电泳图。

具体实施方式

本发明中选用的所有试剂、原料和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其它本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：密码子未优化、优化的PPRV F基因序列的设计与合成

1、密码子未优化的PPRVF基因序列的合成

以PPRV Nigeria/75/1株为参考序列(GenBank:X74443)，首先选取F基因，全长1641bp，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并装入载体pUC57，构成重组质粒pUC57-F，经测序证实合成的序列正确。

2、密码子优化的未含信号肽的PPRV F基因序列的设计和合成

(1)以PPRV Nigeria/75/1株为参考序列(GenBank:X74443)，首先选取F基因，全长1641bp，剔除5′端信号肽(57bp)后剩余1584bp，然后运用软件OptimumGeneTM分析其基因序列，找出其密码子使用偏好，同时找出与羊密码子使用偏好不同的密码子位点，用羊偏好的密码子替代PPRVF基因中使用偏好不同的密码子，然后设计出密码子优化的PPRVF基因序列。上述剔除信号肽且密码子优化的PPRVF基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列，与剔除信号肽且密码子未优化的F基因氨基酸序列SEQ ID NO.4一致；

(2)将上述密码子优化的序列交生工生物工程(上海)股份有限公司合成，装入载体pUC57，构建成重组质粒pUC57-F-opt，经测序证实合成的序列正确。

3、密码子优化的含信号肽的PPRV F基因序列的设计和合成

(1)在上述步骤2(1)中密码子优化的PPRVF基因序列5′端连接乙型脑炎病毒信号肽(JEVSP)序列(全长72bp)；

(2)将上述密码子优化的、含JEVSP序列的序列交生工生物工程(上海)股份有限公司合成，装入载体pUC57，构建成重组质粒pUC57-JEVSP-F-opt，经测序证实合成的序列正确；分析：上述密码子优化的PPRVF基因序列与野生型序列(未经密码子优化)比较，密码子偏好性发生了改变；与野生型基因相比，密码子优化的基因中羊细胞偏好的密码子出现频率增加，但是它们所编码的氨基酸序列不变，从而使其更适于在羊细胞中的蛋白表达。

实施例二：真核表达载体pcDNA3.1(+)-F、pcDNA3.1(+)-F-opt、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt的构建

1、目的片段和载体的获得

(1)F片段、质粒pcDNA3.1(+)线性大片段的获得

用BamH I和Xba I双酶切由生工生物工程(上海)股份有限公司提供的含有目标序列的重组载体pUC57-F，获得F片段；酶切反应体系为：10×Tango Buffer 4μL，质粒pUC57-F 10μL，BamH I和Xba I各1.5μL，补水至40μL，37℃，2h；

用BamH I和Xba I双酶切载体质粒pcDNA3.1(+)，获得质粒pcDNA3.1(+)线性大片段；酶切反应体系为：10×Tango Buffer 4μL，质粒pcDNA3.1(+)10μL，BamH I和Xba I各1.5μL，补水至40μL，37℃，2h；

(2)F-opt、质粒pcDNA3.1(+)线性大片段的获得

分别用BamH I和EcoR I双酶切由生工生物工程(上海)股份有限公司提供的含有目标序列的重组载体pUC57-F-opt和载体质粒pcDNA3.1(+)，酶切反应体系同(1)；

(3)JEVSP-F-opt、质粒pcDNA3.1(+)线性大片段的获得

分别用BamH I和EcoR I双酶切由生工生物工程(上海)股份有限公司提供的含有目标序列的重组载体pUC57-JEVSP-F-opt和载体质粒pcDNA3.1(+)，酶切反应体系同(1)。

2、酶切产物纯化

上述酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，按照凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，Cat.no.：AP-GX-250)说明书进行胶回收

(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1.5mL离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)；

(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热(低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热)，间断混合(每2～3min)，直至凝胶块完全熔化(约6～8min)；

(3)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇；

(4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管(置于2mL(试剂盒内提供)离心管)中，12000×g离心1min。弃滤液；

(5)将制备管置回2mL离心管，加500μL Buffer W1，12000×g离心30s，弃滤液；

(6)将制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12000×g离心30s，弃滤液；以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次12000×g离心1min；

(7)将制备管置回2mL离心管中，12000×g离心1min；

(8)将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25～30μLEluent或去离子水，室温静置1min；12000×g离心1min洗脱DNA；

(9)测定DNA溶液的浓度，用1％琼脂糖凝胶电泳分析割胶纯化效果，洗脱液保存在-20℃冰箱中备用。

3、连接反应

用T4DNA连接酶将目的片段F、F-opt、JEVSP-F-opt和各线性化质粒pcDNA3.1(+)大片段连接，得到pcDNA3.1(+)-F、pcDNA3.1(+)-F-opt、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt重组表达质粒，即为本发明所提供的PPRV F基因的核酸疫苗；其中重组表达质粒pcDNA3.1(+)-F-opt中优化后的目标序列位于真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I酶切位点之间，重组表达质粒pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt中，优化后的目标序列位于真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I酶切位点之间，优化后的目标质粒的5′端连接有JEVSP信号肽序列。连接反应体系为：10×T4DNA Ligase Buffer 1μL，线性化的pcDNA3.1(+)1μL，纯化的目的片段7μL，T4DNA Ligase 1μL，混匀，16℃过夜；连接物转化DH5α感受态细胞。

实施例三：重组质粒pcDNA3.1(+)-F、pcDNA3.1(+)-F-opt、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt的鉴定

1、重组质粒pcDNA3.1(+)-F、pcDNA3.1(+)-F-opt、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：

(1)分别将10μL连接物加入装有100μL DH5α感受态细胞的Ep管中，轻轻拍动管壁数次，充分混匀，冰浴30min。(2)将Ep管置于42℃水浴中90s；

(3)向Ep管中缓慢加入LB培养基1mL，37℃，225rpm，振摇60min；

(4)将菌液涂布在含氨苄青霉素(0.1g/L)的LB平板上，37℃，培养过夜。

2、筛选阳性克隆

随机挑取单菌落，接种于培养试管(含0.1g/L氨苄青霉素的LB培养基)中，37℃，225rpm振摇，培养过夜。

3、小量提取重组质粒pcDNA3.1(+)-F、pcDNA3.1(+)-F-opt、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt(质粒小量提取试剂盒为(AxyPrep质粒DNA小量试剂盒，Cat.No.：AP-MN-P-250)

(1)取1～4mL在LB培养基中培养过夜的菌液(若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少)，12000×g离心1min，弃尽上清；

(2)用250μL已加入RNase A的Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；

(3)加入250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转混合4-6次均匀使菌体充***解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min；

(4)加入350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6～8次，12000×g离心10min；

(5)吸取步骤4中的离心上清并转移到DNA制备管(置于2mL离心管中)，12000×g离心1min；

(6)将制备管置回离心管，加500μL Buffer W1，12000×g离心1min，弃滤液；

(7)将制备管置回离心管，加700μL Buffer W2，12000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，弃滤液；

(8)将制备管置回2mL离心管中，12000×g离心1min；

(9)将制备管移入新的1.5mL离心管中，在DNA制备膜正中央加60～80μL水或Eluent，室温静置1min；12000×g离心1min，洗脱液即为含有质粒的溶液。

4、酶切鉴定质粒pcDNA3.1(+)-F、pcDNA3.1(+)-F-opt、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt质粒pcDNA3.1(+)-F用BamH I和Xba I双酶切。质粒pcDNA3.1(+)-F-opt用BamH I和EcoR I双酶切。质粒pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt用BamH I和EcoR I双酶切。酶切反应体系(10μL)：10×Tango Buffer 2μL，重组质粒2μL，BamH I和Xba I(或EcoR I)各1μL，补水至20μL。37℃孵育2h，加入2μL 10×Loading buffer终止酶切反应。

1％琼脂糖凝胶电泳观察结果，酶切后电泳图谱见图1。由图1可见，质粒pcDNA3.1(+)-F被切为预期大小约5366bp和1647bp的2条带，质粒pcDNA3.1(+)-F-opt被切为预期大小约5403bp和1590bp的2条带，质粒pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt被切为预期大小约5403bp和1662bp的2条带。将酶切鉴定正确的细菌送上海生工生物工程公司测序，测序正确细菌划平板，挑取单克隆细菌保存。

实施例四：质粒pcDNA3.1(+)-F、pcDNA3.1(+)-F-opt、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt大量制备(质粒大提试剂盒为AxyPrep质粒大量试剂盒，Cat.No.：AP-MX-P-25)

1、取120mL在LB培养基中培养过夜的高拷贝数质粒菌液，或250mL过夜培养的低拷贝质粒菌液，≥3000×g离心10min，弃上清；将离心管倒置于纸巾上数分钟，除尽上清；

2、用10mL已加入RNase A的Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；3、加10mL Buffer S2，温和并充分地上下翻转8～10次混合均匀使菌体充***解，直至形成透亮的溶液；此步骤不宜超过5min；

4、加入10mL4℃预冷的Buffer S3K，温和并充分地上下翻转10～12次混合均匀，直至形成紧实的凝集块；室温放置5min；

5、加入10mL4℃预冷的Buffer B，温和并充分地上下翻转10～12次混合均匀；10000×g离心(4℃)10min；

6、正确连接负压装置，将大量DNA制备管插到负压装置的插口上；

7、吸取步骤5中的混合液，转移到大量滤器中，***注射器芯，垂直向下缓慢推注至大量DNA制备管中，开启并调节负压至-25-30英寸汞柱，缓慢吸尽管中溶液；

8、保持负压，加12mL Buffer W1，吸尽管中溶液；

9、加14mL Buffer W2，吸尽管中溶液；

10、将大量DNA制备管置于50mL离心管中，加4mL Buffer W2溶液，≥6000×g离心5min；

11、将大量DNA制备管置于洁净的50mL离心管中，在DNA制备管的基质上加1.5mL水或Eluent，室温静置5min；≥6000×g离心5min收集质粒DNA；

12、可选步骤：同样方法，在DNA制备管的基质上加0.75mL水或Eluent，室温静置1min。≥6000×g离心5min收集质粒DNA；

13、紫外分光光度法测定抽提所得溶液中的质粒浓度及260/280比值。

实施例五：密码子优化的重组核酸疫苗中和抗体检测

在核酸疫苗构建和表达成功后，对实验动物进行免疫，通过中和抗体检测其免疫原性：

1、核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，实验设计如下：

试验设4组，每组10只BALB/c雌鼠，每只雌鼠约18g，对小鼠进行腿部肌肉肌内免疫，共免疫3次，每次间隔14天，每次免疫后第14d对小鼠断尾采血，进行小反刍兽疫病毒病毒含量测定(TCID₅₀)，计算中和抗体阳性率。以空载体pcDNA3.1(+)质粒为阴性对照。

表1核酸疫苗免疫BALB/c小鼠

2、病毒含量测定(TCID₅₀)

将小反刍兽疫病毒液(Nigeria/75/1)进行10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5 3个稀释度，接种96孔Vero细胞培养板，每个稀释度接种5孔，每孔0.1mL，每孔再加入浓度为2～3×10⁵个/mL的细胞悬液0.1mL；同时设立正常细胞对照，置37℃、5％CO₂中培养6d，根据出现细胞病变(CPE)的孔数，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。

3、中和试验

将被检BALB/c鼠血清及阴性对照血清(免疫前血清)56℃水浴灭活30min。在96孔细胞培养板将血清进行2倍系列稀释，向所有血清孔中加入含100TCID₅₀/0.1mL的PPRV，37℃作用1h后向所有孔中加入浓度为2～3×10⁵个/mL的Vero细胞悬液0.1mL；设立病毒回归试验，即将100TCID₅₀/0.1mL病毒工作液用无血清MEM细胞培养液10倍系列稀释成10TCID₅₀/0.1mL、1TCID₅₀/0.1mL、0.1TCID₅₀/0.1mL，取病毒工作液和3个稀释度病毒液，每个病毒液接种5孔，每孔0.1mL。置37℃、5％CO₂中培养6天，期间每日观察细胞病变(CPE)情况。

4、试验结果判定

100TCID₅₀、10TCID₅₀病毒对照及阴性对照孔均应出现CPE，1TCID₅₀病毒对照部分孔出现CPE，0.1TCID₅₀病毒对照及阳性血清对照1:160稀释度以下细胞孔和细胞对照孔应不出现CPE。记录被检血清各稀释度CPE孔数，以5个试验孔均未出现CPE的血清最高稀释度为中和抗体滴度，中和抗体滴度不小于1:10判为阳性。

5、试验结果分析

表2核酸疫苗免疫BALB/c小鼠后中和抗体检测结果

小反刍兽疫病毒F基因核酸疫苗免疫BALB/c小鼠后中和抗体检测结果如表2所示。从第一次免疫后14d开始，pcDNA3.1(+)-F、pcDNA3.1(+)-F-opt、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt免疫组中和抗体阳性率大于0％，而pcDNA3.1(+)空载体免疫组中和抗体阳性率为0％。pcDNA3.1(+)-F、pcDNA3.1(+)-F-opt、pcDNA3.1(+)-JEVSP-F-opt重组质粒免疫42天后，B组中和抗体阳性率为20％，C组中和抗体阳性率为60％，D组中和抗体阳性率为90％。且随着免疫次数的增加，中和抗体阳性率逐渐提高。和预期的一样，所有10只pcDNA3.1(+)空载体免疫BALB/c小鼠的血清中中和抗体阳性率为0％。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）

<120> 密码子优化的小反刍兽疫病毒F基因核酸疫苗

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1641

<212> DNA

<213> 密码子优化前的PPRVF基因序列

<400> 1

atgacacggg tcgcaacctt agtatttctg tttcttttcc caaacactgt cacgtgccag 60

attcactggg gcaatctatc caagatcggg attgtaggaa cggggagtgc cagctacaag 120

gtgatgacta ggccaagcca ccaaactcta gttataaagt tgatgccaaa tataacagcc 180

atcgacaatt gtacgaaatc agagatttca gagtacaaaa gattgctgat cacagtgtta 240

aagcctgtag aggatgccct gtcagtgata accaagaatg taagaccaat tcaaactcta 300

acacctgggc gcaggacccg ccgttttgtc ggagctgttc tggccggagt agcacttgga 360

gtcgcgacag ccgctcaaat aactgccgga gtcgcactcc atcagtcatt gatgaattcc 420

caagcaattg aaagtttaaa aaccagtctt gagaagtcga atcaggcaat agaagaaatc 480

agacttgcaa ataaggagac catactggcg gtacagggcg tccaagacta tatcaacaat 540

gagcttgtcc cctctgttca tagaatgtca tgtgagcttg taggtcacaa actcagtctc 600

aagctcctta ggtattatac cgagatcctg tctatattcg ggcctagcct tcgagacccg 660

atagctgctg aaatatcaat ccaggcactc agctatgcat taggcggaga catcaataaa 720

attctggaca agcttgggta tagcggcggg gatttccttg ctatcctaga aagcaagggg 780

ataaaggccc gggtcacata tgtggacaca agagattact ttataattct tagcatagcc 840

tacccaacct tatctgagat caagggggtg atagttcata agatagaagc tatatcctac 900

aatattgggg cacaggaatg gtatactact atccctagat atgtagccac tcagggatat 960

ctgatatcga atttcgatga gacgtcatgc gtcttcactc cagaggggac agtctgcagc 1020

cagaatgcgt tgtatccaat gagcccattg cttcaggaat gcttcagggg gtcgacaaaa 1080

tcgtgcgcca gaaccctagt ttcagggacc acaagtaata gatttatcct atcaaaaggg 1140

aacttgattg caaattgtgc gtcagttttg tgcaagtgtt acacaacgga gacagttatc 1200

aaccaagatc ctgataaact actaactgtt atagcctccg ataagtgtcc cgtagtcgag 1260

gtggatggag tgacaataca ggtcggcagt cgagagtacc cagattctgt atacctacat 1320

gaaatagact taggcccagc catctccctg gagaaactgg atgtaggcac caatttaggc 1380

aatgcagtca caagactgga gaatgcaaag gagctactag atgcatcaga ccagatactg 1440

aagactgtta aaggggtacc tttcagtggc aatatataca tagcactggc agcttgcatt 1500

ggggtatccc tagggcttgt cacattaata tgctgctgta aggggagatg taggaacaag 1560

gagattcctg cctccaaaat caacccaggg ctcaaacccg acctaaccgg gacttcaaag 1620

tcgtacgtga gatcactgta g 1641

<210> 2

<211> 1584

<212> DNA

<213> 剔除信号肽且密码子优化的PPRVF基因序列

<400> 2

cagatccact ggggcaacct gagcaagatc ggcatcgtgg gcaccggcag cgccagctac 60

aaagtgatga cccgccccag ccatcagacc ctcgtgatca agctgatgcc taacatcacc 120

gccatcgaca actgcaccaa gtccgaaatc agcgagtaca agaggctgct gatcaccgtg 180

ctgaagcctg tggaggatgc cctgagcgtg atcaccaaga acgtgaggcc tatccagacc 240

ctgacccccg gcaggagaac cagaagattc gtgggcgccg tgctggccgg cgtggccctg 300

ggcgtggcca ccgccgccca gatcaccgcc ggcgtggccc tgcaccagag cctgatgaac 360

tcccaggcca tcgagtccct gaagaccagc ctcgagaagt ccaaccaggc catagaagaa 420

atcagactgg ccaacaagga gaccatcctg gccgtgcagg gcgtgcagga ctacatcaac 480

aacgagctgg tgccctccgt gcacaggatg agctgcgagc tggtcggcca caagctgagc 540

ctgaagctgc tgcggtacta caccgagatc ctgagcatct ttggcccctc cctgagggac 600

cccatcgccg ccgagatctc tatccaggcc ctgagttacg ccttaggcgg cgacatcaat 660

aagatccttg acaagctggg ctactctggc ggcgacttcc tggccatcct ggagagcaag 720

ggcatcaagg ccagggtgac ctacgtggac accagagact actttatcat cctgtccatc 780

gcctacccta ccctgtccga gatcaagggc gtgatcgtgc acaagatcga ggccatcagc 840

tacaacatcg gcgcccagga gtggtacacc accatcccca gatacgtggc cacccagggc 900

tacctgatca gcaacttcga cgagactagc tgtgtgttca cccccgaggg caccgtgtgc 960

tcccagaacg ccctgtaccc catgtccccc ctgctccagg agtgcttcag aggctctacc 1020

aagtcctgcg ccagaaccct ggtgagcggc accacctcta acagattcat cctgagtaag 1080

ggcaacctga tcgccaactg cgccagcgtg ctgtgtaagt gctacaccac cgagaccgtg 1140

atcaaccagg accccgacaa gctgctgacc gtgatcgcct ctgataagtg ccctgtggtg 1200

gaagtggacg gcgtgaccat tcaggtgggc agcagggagt accccgacag cgtgtacctg 1260

cacgagatcg atctgggccc cgccatttcc ctggagaagc tggacgtggg caccaacctg 1320

ggcaacgccg tgaccagact cgagaacgcc aaggaactgc tggacgcttc tgatcaaatc 1380

ctgaaaaccg tgaaaggagt gcccttttct ggcaacatct acatcgccct ggccgcttgt 1440

atcggcgtga gcctgggcct ggtgaccctg atctgttgct gcaaaggaag atgtagaaat 1500

aaggagatcc cagcctctaa aattaaccca ggactgaaac ctgacctgac cggcacctct 1560

aagtcttacg tgagatctct gtga 1584

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> 乙型脑炎病毒信号肽（JEVSP）序列

<400> 3

gccaccatgg gcaagcggag cgccggcagc atcatgtggc tggcctccct ggccgtggtc 60

attgcctgcg cc 72

<210> 4

<211> 527

<212> PRT

<213> 剔除信号肽且密码子优化的PPRVF基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列与剔除信号肽且密码子未优化的F基因氨基酸序列一致

<400> 4

Gln Ile His Trp Gly Asn Leu Ser Lys Ile Gly Ile Val Gly Thr Gly

1 5 10 15

Ser Ala Ser Tyr Lys Val Met Thr Arg Pro Ser His Gln Thr Leu Val

20 25 30

Ile Lys Leu Met Pro Asn Ile Thr Ala Ile Asp Asn Cys Thr Lys Ser

35 40 45

Glu Ile Ser Glu Tyr Lys Arg Leu Leu Ile Thr Val Leu Lys Pro Val

50 55 60

Glu Asp Ala Leu Ser Val Ile Thr Lys Asn Val Arg Pro Ile Gln Thr

65 70 75 80

Leu Thr Pro Gly Arg Arg Thr Arg Arg Phe Val Gly Ala Val Leu Ala

85 90 95

Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val

100 105 110

Ala Leu His Gln Ser Leu Met Asn Ser Gln Ala Ile Glu Ser Leu Lys

115 120 125

Thr Ser Leu Glu Lys Ser Asn Gln Ala Ile Glu Glu Ile Arg Leu Ala

130 135 140

Asn Lys Glu Thr Ile Leu Ala Val Gln Gly Val Gln Asp Tyr Ile Asn

145 150 155 160

Asn Glu Leu Val Pro Ser Val His Arg Met Ser Cys Glu Leu Val Gly

165 170 175

His Lys Leu Ser Leu Lys Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu Ser

180 185 190

Ile Phe Gly Pro Ser Leu Arg Asp Pro Ile Ala Ala Glu Ile Ser Ile

195 200 205

Gln Ala Leu Ser Tyr Ala Leu Gly Gly Asp Ile Asn Lys Ile Leu Asp

210 215 220

Lys Leu Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Phe Leu Ala Ile Leu Glu Ser Lys

225 230 235 240

Gly Ile Lys Ala Arg Val Thr Tyr Val Asp Thr Arg Asp Tyr Phe Ile

245 250 255

Ile Leu Ser Ile Ala Tyr Pro Thr Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile

260 265 270

Val His Lys Ile Glu Ala Ile Ser Tyr Asn Ile Gly Ala Gln Glu Trp

275 280 285

Tyr Thr Thr Ile Pro Arg Tyr Val Ala Thr Gln Gly Tyr Leu Ile Ser

290 295 300

Asn Phe Asp Glu Thr Ser Cys Val Phe Thr Pro Glu Gly Thr Val Cys

305 310 315 320

Ser Gln Asn Ala Leu Tyr Pro Met Ser Pro Leu Leu Gln Glu Cys Phe

325 330 335

Arg Gly Ser Thr Lys Ser Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser Gly Thr Thr

340 345 350

Ser Asn Arg Phe Ile Leu Ser Lys Gly Asn Leu Ile Ala Asn Cys Ala

355 360 365

Ser Val Leu Cys Lys Cys Tyr Thr Thr Glu Thr Val Ile Asn Gln Asp

370 375 380

Pro Asp Lys Leu Leu Thr Val Ile Ala Ser Asp Lys Cys Pro Val Val

385 390 395 400

Glu Val Asp Gly Val Thr Ile Gln Val Gly Ser Arg Glu Tyr Pro Asp

405 410 415

Ser Val Tyr Leu His Glu Ile Asp Leu Gly Pro Ala Ile Ser Leu Glu

420 425 430

Lys Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala Val Thr Arg Leu Glu

435 440 445

Asn Ala Lys Glu Leu Leu Asp Ala Ser Asp Gln Ile Leu Lys Thr Val

450 455 460

Lys Gly Val Pro Phe Ser Gly Asn Ile Tyr Ile Ala Leu Ala Ala Cys

465 470 475 480

Ile Gly Val Ser Leu Gly Leu Val Thr Leu Ile Cys Cys Cys Lys Gly

485 490 495

Arg Cys Arg Asn Lys Glu Ile Pro Ala Ser Lys Ile Asn Pro Gly Leu

500 505 510

Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Val Arg Ser Leu .

515 520 525