阅读说明：本技术 一种表达荧光素酶的重组犬麻疹病毒 (Recombinant canine measles virus expressing luciferase ) 是由 刘拂晓 黄漪岚 王迁迁 王宁 单虎 于 2020-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明的目的是提供一种表达<Image he="67" wi="270" file="DDA0002564502030000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>荧光素酶NLuc的重组犬麻疹病毒,其中用于拯救表达NLuc的重组CMV核酸片段的结构为5′-N-P-NLuc-M-F-H-L-3′；其中,N、P、M、F、H、L为病毒的结构基因；NLuc为<Image he="59" wi="275" file="DDA0002564502030000012.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>荧光素酶的ORF,该ORF上游包含M基因起始序列和Not I酶切位点,下游包含Pme I酶切位点及P基因终止序列。本发明通过反向遗传技术拯救的rCMV-NLuc,在细胞内对于NLuc的表达水平较高,在发光底物furimazine作用下,可发出肉眼可见的淡蓝色荧光。外源基因的插入并未显著影响病毒的生长动力学,且外源基因在病毒传代过程中相对较为稳定。(It is an object of the present invention to provide an expression Recombinant canine measles virus of luciferase NLuc, wherein the recombinant CMV nucleic acid fragment for rescuing the expressed NLuc has a structure of 5 '-N-P-NLuc-M-F-H-L-3'; wherein N, P, M,F. H, L structural genes of the virus; NLuc is An ORF for luciferase comprising an M gene start sequence and a Not I cleavage site upstream of the ORF and a Pme I cleavage site and a P gene termination sequence downstream of the ORF. The rCMV-NLuc rescued by the reverse genetic technology has higher expression level to the NLuc in the cell, and can emit light blue fluorescence which can be seen by naked eyes under the action of a luminescent substrate furimazine. The insertion of the exogenous gene does not significantly affect the growth kinetics of the virus, and the exogenous gene is relatively stable in the virus passage process.)

一种表达荧光素酶的重组犬麻疹病毒

技术领域

本发明属于重组病毒构建技术领域，具体涉及一种表达

荧光素酶的重组犬麻疹病毒。

背景技术

犬麻疹病毒(canine morbillivirus,CMV)，旧称“犬瘟热病毒(canine distempervirus)”，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)成员。CMV的宿主广泛，犬科动物、鼬科动物、猫科动物等均易感染。病毒侵入机体24h内，主要在局部组织的巨噬细胞内增殖，而后扩散到扁桃体和支气管***单核细胞中，引起扁桃体和支气管***肿大；在感染后2～4d内持续复制，随后扩散到其他淋巴器官。患病动物的临床症状通常是呼吸系统、胃肠消化系统、表皮黏膜和中枢神经系统症状，伴随着双相热、全身不适和病毒血症。

CMV基因组为单股、负链、线性的RNA，全长15 690nt，编码六个结构蛋白(N、P、M、F、H、L蛋白)和两个非结构蛋白(C、V蛋白)。病毒经纯化后电镜下观察形状不定，但多呈球形或椭球形，外披脂质囊膜，囊膜外表面嵌有铆钉状纤突。囊膜内表面紧邻基质蛋白，其单体之间相互作用构成了整个病毒的外骨架，内部则含有鲱鱼骨状螺旋型核衣壳。CMV具有溶瘤活性，是一种理想的溶瘤病毒。溶瘤病毒的溶瘤活性研究可借助于小动物体内发光影像，使其溶瘤效果的观察更为直观。因此构建一种表达荧光素酶(而非荧光蛋白)的重组溶瘤病毒，将为其下游溶瘤活性的研究奠定良好的基础。

萤光素酶(

luciferase,NLuc)是一个经基因工程改造的小分子酶，分子量为19.1kD，是新型生物发光报告蛋白。NLuc可催化一种新型底物furimazine，从而产生高强度、辉光型发光现象。NLuc催化的生物发光反应不依赖ATP，自发光背景低，光信号较传统荧光素显著增强，同时抑制背景发光，可获得极高检测灵敏度。NLuc作为一种荧光示踪蛋白(Genbank登录号：MH037010)，因开放阅读框(open readingframe,ORF)较短(516bp)，因此极大方便了基因操作。但目前仍未有借助CMV高效表达NLuc的有效方法。

发明内容

本发明目的是提供一种表达荧光素酶(NLuc)的重组犬麻疹病毒(rCMV-NLuc)，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供一种用于拯救表达NLuc的重组CMV核酸片段(rCMV-NLuc cDNAclone)，所述核酸片段的结构为：5′-N-P-NLuc-M-F-H-L-3′。其中，N、P、M、F、H、L为病毒的结构基因；NLuc为

荧光素酶的ORF，该ORF上游包含M基因起始序列(M GS)和Not I酶切位点，下游包含Pme I酶切位点及P基因终止序列(P GE)。

作为实施例的一种具体记载，所述核酸片段的序列为SEQ ID NO:1；

本发明所提供的核酸片段用于在细胞内拯救能够表达NLuc的重组犬麻疹病毒；

所述的细胞为BSR-T7/5细胞和Vero-Dog-SLAM(VDS)细胞，两者分别用于重组病毒的拯救和传代；

本发明再一个方面提供一种能表达NLuc的重组犬麻疹病毒，所述的病毒是使用表达NLuc的重组CMV核酸片段的重组质粒在细胞内拯救获得的。

本发明通过反向遗传技术拯救的rCMV-NLuc，在细胞内对于NLuc的表达水平较高，在发光底物furimazine作用下，可发出肉眼可见的淡蓝色荧光。外源基因的***并未显著影响病毒的生长动力学，且外源基因在病毒传代过程中相对较为稳定。

附图说明

图1：rCMV-NLuc cDNA clone模式图。

图2：四质粒共转染72h后荧光分析。

图3：rCMV-NLuc盲传第二代诱导的合胞体病变。

图4：第五代rCMV-NLuc的RT-PCR鉴定。

图5：第五代rCMV-NLuc的试纸条检测。

图6：第五代rCMV-NLuc的荧光分析。

图7：第七代rCMV-NLuc及野生型病毒于不同感染时间诱导的细胞病变。

图8：rCMV-NLuc及野生型病毒生长曲线的比较。

图9：rCMV-NLuc各代次荧光分析。

图10：RT-PCR鉴定不同代次rCMV-NLuc。

具体实施方式

本发明构建了一种含NLuc的rCMV-NLuc cDNA clone，将其与分别表达CMV N、P、L蛋白的真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，成功拯救了rCMV-NLuc，进而对重组病毒进行鉴定及特性分析。

以下通过实施例来进一步阐明本发明，但是应理解，所述实施例只是举例说明目的，本发明的保护范围并不仅限于说明书的具体实施例的记载。

实施例1、rCMV-NLuc cDNAclone的构建

本实施例所构建的用于拯救表达NLuc的重组CMV核酸片段rCMV-NLuc cDNA clone呈“5′-N-P-NLuc-M-F-H-L-3′”分布(图1)；其中，N、P、M、F、H、L为病毒的结构基因；本实施例所选N、P、M、F、H、L基因为CMV毒株5804P(GenBank:AY386316.1)的相关基因；NLuc为荧光素酶的ORF，该ORF上游包含M GS和Not I酶切位点，下游包含Pme I酶切位点及P GE。

为获得理想的拯救效率，本发明将外源的NLuc基因***到P和M基因之间；同时，为了提高NLuc的表达量，在NLuc ORF上游***了Kozak序列。

其中一种rCMV-NLuc cDNA clone的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

将核苷酸序列为SEQ ID NO:1的rCMV-NLuc cDNA clone的全长序列进行核酸合成，亚克隆至pBR322质粒。整个cDNA clone上游受T7启动子序列调控，下游受丁肝病毒核酶及T7终止子序列调控。

实施例2、rCMV-NLuc的拯救

复苏BSR-T7/5细胞，在DMEM培养基中传代2次，DMEM培养基包含penicillin(100U/mL)、streptomycin(100μg/mL)、amphotericin B(0.25μg/mL)、G418(500μg/mL)及10％FBS(fetal bovine serum)。转染前一天，在6孔板中接种BSR-T7/5细胞，次日待细胞达到70％汇合度，将rCMV-NLuc cDNA clone质粒及分别表达CMV N、P、L蛋白的真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，四者每孔的转染量分别为4μg、2μg、1μg、1μg。按每孔加150μL Opti-MEM和16μL Lipofectamine 2000的比例配制溶液I。再按每孔加150μL Opti-MEM和8μg质粒配制溶液II。将溶液I和II轻柔混匀，室温放置15min以形成脂质体-DNA复合物。吸弃6孔板培养基，每孔加1mL Opti-MEM，逐滴加入脂质体-DNA混合液。将6孔板置于CO₂培养箱转染6h，吸弃转染液，加入DMEM，置于培养箱中培养72h。收集细胞液冻融1次，与发光底物furimazine混合(V:V＝100:1)，同时设未转染细胞作为对照，置于Viber发光成像仪内观察。结果表明，四质粒共转染BSR-T7/5细胞可拯救rCMV-NLuc，表达的荧光素酶可催化发光底物发出荧光(图2)。

实施例3、rCMV-NLuc的盲传及鉴定

将拯救的rCMV-NLuc在VDS细胞内进行盲传，第二代(P2)便可观察到合胞体细胞病变(图3)。继续盲传至第五代(P5)，病毒液冻融一次，收集上清提取总RNA，用于病毒的RT-PCR检测。上游引物序列：5′-gatcaaaagtatcacacatgcttaa-3′，下游引物序列：5′-gatcgaagtcgtacacctcagtcat-3′，扩增799bp片段。RT-PCR反应采用High Fidelity OneStep RT-PCR Kit(Takara)，反应条件设定如下，45℃10min,94℃2min,经历30个循环：98℃(10s),55℃(15s),68℃(10s)。为消除残留质粒污染，另设PCR对照。PCR反应采用2×PrimeSTAR Max Premix(Takara)，反应条件设定为30个循环：98℃(10s),55℃(5s),72℃(10s)。RT-PCR和PCR反应结束后，同时进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，仅RT-PCR扩增出了特异性条带。将该条带切下，核酸经回收后进行Sanger测序，结果与对应序列相符。

P5代病毒细胞培养液，冻融1次，离心收集上清，进行试纸条检测，同时设无病毒感染的细胞培养液作为对照。如图5所示，rCMV-NLuc检测结果为阳性，对照为阴性。P5代病毒细胞培养液，冻融1次，与发光底物furimazine混合(V:V＝100:1)，同时设野生型CMV(wt-CMV)作为对照，置于Viber发光成像仪内观察，结果显示，只有rCMV-NLuc培养液发出明亮的荧光(图6)。

实施例4、rCMV-NLuc的生长动力学

将VDS细胞接种10个35-mm细胞培养皿(2×10⁶细胞/皿)，37℃培养2h。其中5个培养皿接种rCMV-NLuc，另5个培养皿接种wt-CMV，MOI值皆为0.001，置于37℃培养。感染细胞后0、24、48、72h、96h，分别取出对应培养皿，观察细胞形态(图7)，冻融一次，离心收集上清，测定病毒滴度。将测得结果绘制生长曲线，结果如图8所示，rCMV-NLuc和wt-CMV生长动力曲线略有差异，后者稍强于前者。

实施例5、rCMV-NLuc的传代稳定性

将rCMV-NLuc在VDS细胞中连续传代(48～72h/代)，共计15代，第5至15代病毒上清液与发光底物混合。结果如图9，除wt-CMV对照，每代rCMV-NLuc感染细胞皆发出荧光。分别提取第7、9、11、13、15代病毒培养液的总RNA，进行RT-PCR分析，方法同实施例3。结果如图10所示，五个代次病毒皆扩增出亮度均一的799bp目的条带。将所有条带切下，核酸经回收后进行Sanger测序，结果与预期一致。

上述结果表明本发明方法制备的重组CMV，***的外源NLuc基因并未显著影响病毒的生长动力学，且外源基因在病毒传代过程中稳定存在。

尽管参考其示例性实施方案，对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离本发明说明书具体技术思路的情况下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种表达荧光素酶的重组犬麻疹病毒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accagacaaa gttggctaag gatagataaa ttattgaata ttttattaaa aacttagggt 60

caatgatcct accttagggg acaaggtcag ggttcagacc taccgatatg gccagccttc 120

ttaagagcct cacattgttc aagaggactc gggaccaacc cccacttgcc tcgggctccg 180

gaggagcaat aagagggata aagcatgtca ttatagtcct aatcccgggt gattcgagca 240

ttgttacaag atctcgacta ttggatagac ttgttagatt ggtcggtgat ccggaaatca 300

acggacctaa attaactggg attttaatca gtatcctctc cttgttcgtg gagtcccctg 360

gacagttgat ccagaggatc atagacgacc ctgatgtaag catcaagtta gtagaggtca 420

tcccaagcat caactctgtt tgcggtctta catttgcatc cagaggagca agtttggatt 480

ctgaggcaga tgagttcttc aaaattgtag acgaagggtc gaaagctcaa ggacaattag 540

gctggttgga gaataaggat attgtagaca tagaagttga tgatgctgag caattcaata 600

tcttgctagc ttccatcttg gctcaaactt ggatcctgct cgctaaagca gtgactgctc 660

ctgatactgc agccgactcg gagatgagaa ggtggattaa gtatacccaa cagagacgtg 720

tggtcgggga atttagaatg aacaaaatct ggcttgatat tgttagaaac aggattgctg 780

aggacttatc tttgaggcgg ttcatggtag cactcatctt ggatatcaaa cgatccccag 840

ggaacaagcc tagaattgct gaaatgattt gtgatataga taactacatt gtggaagctg 900

gattagctag tttcatctta actatcaaat ttggcattga aactatgtat ccggctcttg 960

ggttgcatga gttttctgga gagttaacaa ctattgaatc ccttatgatg ctataccaac 1020

agatgggtga aacagcaccg tacatggtta ttctggaaaa ttctgttcag aacaaattta 1080

gtgcaggatc ctacccattg ctctggagtt atgccatggg agttggtgtt gaacttgaaa 1140

actccatggg agggttaaat ttcggtagat cctactttga tccagcttat ttcaggctcg 1200

ggcaagaaat ggtcagaaga tctgccggca aagtgagctc tgcacttgcc gccgagcttg 1260

gcatcaccaa ggaagaggct cagctagtgt cagaaatagc atccaagaca acggaggacc 1320

ggacaattcg cgctgctggt cccaagcaat ctcaaatcac ttttctgcac tcagaaagat 1380

ccgaagtcac taatcaacaa cccccagcca tcaacaagag gtccgagaac caaggaggag 1440

acaaataccc catccacttc agtgatgaac ggtttccggg gtatacccca gatgtcaacg 1500

gctccgaatg gagtgaatca cgctatgata cccaaactat tcaagatgat ggaaacgacg 1560

atgacaggaa atcaatggaa gcaatcgcca agatgagaat gcttaccaag atgctcagtc 1620

aacctgggac tagcgaaggg ggttctcccg tctataatga tagagagcta ctcaattaaa 1680

tattcaagac cagtgttaca tcagtcaaca attatccttc taaattcatt ataaaaaact 1740

taggacccag gtccaacaaa cccgatcaat cattcatccg accacccgtt ctattcctaa 1800

atggcagagg agcaggccta tcatgtcagc aaagggctgg aatgcctcaa agccctcaga 1860

gagaatcctc ctgaccttga ggagattcaa gaggtcagca gcatcagaga ccaaacccgc 1920

aacccaggcc aggagaatgg aaccgcaagc atgcaggaag aggaggtctc tcaggatctc 1980

gatgaatcac acgagccagc aaaaggatca aactatgtcg gccatgtact ccaaaataat 2040

ccgggaagtg gaaagggcaa cactgcgctt gtggaggcag agcagcccgc taaagatgtc 2100

atccaaccag gacctggaat acgatgttat catgtttatg atcacagcgg tgaagaggtt 2160

aagggaaccg aagatgctga cagtctcgtg gtacctgcag gcgctgtcag taatcgagga 2220

ttcgagagag gagaaggaag ccttgatgat agcactgagg attctggcga agattattcc 2280

gagggaaatg cttcatctaa ctggggatat tctttcggcc ttaaaccaga cagagcagct 2340

gatgtgagca tgctgatgga agaggaattg agtgctctgc tcaagacaag cagaaatgta 2400

gggattcaga aaagggatgg aaagactctg cagttcccac acaatcccga aggtaagaca 2460

ggggatccgg agtgtgggtc cattaaaaag ggcacaggag agaggtcagc ctcacatgga 2520

atggagatag ttgctggatc gacaaatggt gcaacccaat ctgcactcaa gtcaactggg 2580

ggatcatcag ggccaagtgt gtctgcggag aatgtccgcc aacctgcagt gagtgcaaag 2640

atgacccaga aatgcaaacc cgagtctggt acgcaactcc ctcccaagac ctcaaatgag 2700

gctgaatctg acagtgagta cgatgatgag cttttctctg aaatacaaga gattcgatct 2760

gccattacta aactaactga agataatcaa gcaatacttt ctaaactgga taccttatta 2820

ctgcttaaag gagagactga ttcaattaag aaacaaatta gcaaacaaaa tatcgctatt 2880

tccacgattg aggggcatct atcaagcatt atgatagcta tacctggttt tgggaaggac 2940

actggagacc ctacggcaaa tgtcgacatt aacccagagc tccgccctat aatagggaga 3000

gattcaggaa gagcactggc ggaagttctc aagcaacccg catcatcccg cggtaatcgg 3060

aaggacagcg gtattgcctt gggctcaaaa ggtcaactat taagagacct ccagctgaaa 3120

cctattgaca gagagtctag ctcagcaatc ggatacaaac cgaaggatac cgcaccttcc 3180

aaagctgtgc ttgcatcatt gattagatca agcagagttg atcaaagtca caaacacaac 3240

atgctggcgc ttcttaaaaa tatcaaaggg gatgacaatc taaacgagtt ctaccagatg 3300

atcaaaagta tcacacatgc ttaagctgta gcatttacta atcttttaac aggcgcagaa 3360

ctgctttcac tatcgcttaa aagcaattat aaaaaactta ggacacaaga gcctaagtcc 3420

tctccaaaaa agcggccgca ccatggtctt cacactcgaa gatttcgttg gggactggcg 3480

acagacagcc ggctacaacc tggaccaagt ccttgaacag ggaggtgtgt ccagtttgtt 3540

tcagaatctc ggggtgtccg taactccgat ccaaaggatt gtcctgagcg gtgaaaatgg 3600

gctgaagatc gacatccatg tcatcatccc gtatgaaggt ctgagcggcg accaaatggg 3660

ccagatcgaa aaaattttta aggtggtgta ccctgtggat gatcatcact ttaaggtgat 3720

cctgcactat ggcacactgg taatcgacgg ggttacgccg aacatgatcg actatttcgg 3780

acggccgtat gaaggcatcg ccgtgttcga cggcaaaaag atcactgtaa cagggaccct 3840

gtggaacggc aacaaaatta tcgacgagcg cctgatcaac cccgacggct ccctgctgtt 3900

ccgagtaacc atcaacggag tgaccggctg gcggctgtgc gaacgcattc tggcgtaagt 3960

ttaaacgctg tagcatttac taatctttta acaggcgcag aactgctttc actatcgctt 4020

aaaagcaatt ataaaaaact taggacacaa gagcctaagt cctctccaaa aaaatgactg 4080

aggtgtacga cttcgatcag tcttcatggg acaccaaagg ctcattggcc cccattttgc 4140

ccaccaccta tcctgatggt aggttagtac ctcaggtcag agtgatagat ccaggactcg 4200

gcgatcgaaa agatgaatgc ttcatgtata tttttctact gggtataata gaagacaacg 4260

atggcctcgg acccccaatt ggaagaacat ttggatcgct gcctttaggt gttggacgca 4320

ctactgccag acctgaggaa ttattgaagg aagccaccct gttggacatt gtggtaaggc 4380

gaactgcagg tgtcaaggaa caactggtgt tttacaataa taccccattg cacatcttaa 4440

ctccgtggaa gaaggtcctt acgagtggga gtgtgttcag tgcaaaccaa gtctgtaacg 4500

cagttaattt aataccgtta gacatagcac agagatttag agtggtatat atgagcatca 4560

ctcgactatc agacgatgga agttacagaa ttcctcgagg gatgtttgaa ttccgctcta 4620

ggaatgcttt agcatttaat attttagtca ccattcaagt tgagggagat gtctgttcga 4680

accgaggtaa tttgagcatg ttcaaagatc atcaagtgac attcatggtg catatcggca 4740

acttcagccg taagaagaac caagcttact ctgctgatta ctgtaaactg aaaattgaaa 4800

agatgggatt agtgtttgct ctaggaggga tagggggaac cagtcttcac atacgatgta 4860

ctggtaagat gagcaaggct ttgaatgccc agctagggtt caagaaaatc ctgtgttacc 4920

cgctcatgga gatcaatgaa gatttgaatc gatttctatg gagattagag tgcaaaatag 4980

taagaatcca agcagtcttg caaccatcag tcccacaaga tttcaggatt tataatgatg 5040

ttatcatcag cgatgatcag ggtcttttca aaattctcta aatcattggt tcatgaacta 5100

aaaatcaaat gccttggtgg cattgtccag gatctcttaa tcccctcaga caagaattga 5160

ggctacaagt atcaactgtc tcgatgtcgc tcctgcactt taagcgtgtt ctataggttt 5220

ctaaactgct ctttcgtgcc tactactctg gtggctctgc aatatgaaga cagctgaatc 5280

aaaccaattc atgcctaaga gtaggttgat cattatcgga ccaagaaatt tatggatgct 5340

tggggttttg aacttcgcct ctaggaatct cactttaaca attatacttc cacgcacttg 5400

cccgagctca aactatcact agtagtcctg tttcacgaaa ttgtgactgt ctatctttct 5460

atcaccaatc gttaataatt aatcaaaact tagggtccag gacgtagcaa gccaacaggc 5520

caaccaagtc catcaatccg aggccgggca ggaaccccca cgagcagaca agccccatgc 5580

acaacaaaat ccccaaagga tccaaaaccc caacacccac ccaacaagac ccccccccac 5640

aacatagtat caaatccgcc gagaccaaga cctcccaagc acgatacaac ataacatcgg 5700

ctcagcaatc cacacgccat ggtcctcgaa catcggatag gccagttcac tacatcatga 5760

acaggaccag gtcttgcaag caagccagct acagatcaga taacatcccg gctcacggag 5820

accacgaggg tattatccat cacacaccag agagtgtctc ccaaggggtg agatcccggt 5880

tcaaaaggcg gcaatccaat gcaaccagct caggctctca gtgcacctgg ttagtcctgt 5940

ggtgcatcgg agtagccagt ctctttcttt gttccaaggc tcagatacat tggaataatt 6000

tgtcaactat tgggattatc gggactgaca gtgtccatta taagatcatg actaggccta 6060

gtcaccagta cttggtcata aaactaatgc ctaatgtttc acttatagat aattgtacca 6120

aagcagaatt aggtgagtat gagaaattat taagttcagt cctcgagcca atcaaccaat 6180

ctttgactct aatgaccaag aacgtgaagc ccctacagtc agtagggtca ggtaggagac 6240

aaaggcgttt tgcaggagtg gtgcttgcag gtgcagcttt aggagtggcc acagctgcac 6300

aaatcactgc agggatagct ttacatcaat ccaacctcaa tgctcaagca atccaatctc 6360

tgagaactag ccttgaacag tccaacaagg ctatagaaga aattagggag gcaacccagg 6420

aaaccatcat tgccgttcag ggagtccagg attatgttaa taatgaactt gtccctgcta 6480

tgcaacatat gtcgtgtgaa ttagttgggc agagattagg tttaaaactg cttaggtatt 6540

ataccgagtt gttgtcgata tttggcccga gtctacgtga ccctatttca gccgagatat 6600

caattcaagc actgagttat gctcttgggg gagaaattca taagatactt gagaagttgg 6660

ggtattctgg aaatgatatg attgcaattt tggagagtcg agggataaaa acaaaaataa 6720

ctcatgttga tattcccggg aaactcatca tcttaagtat ctcataccca actttatcag 6780

aagtaaaggg ggttatagtc cacagattgg aagcagtttc ttataacata gggtcacagg 6840

agtggtacac cactgtcccg aggtatgttg caactaatgg ctatttaata tctaactttg 6900

atgagtcatc ctgtgtattc gtctcagaat cagccatttg tagccagaac tccttatacc 6960

ccatgagccc gcttctacaa cagtgcatta ggggcgacac ttcatcctgt gctcggacct 7020

tggtgtctgg gactatgggc aacaagttta ttctgtcaaa aggtaatatc gtcgcaaatt 7080

gtgcttctat actatgtaag tgttatagca caagcacaat tatcaatcag agtcctgata 7140

agttactgac atttattgcc tccgatactt gcccactggt tgaaatagat ggtgtaacta 7200

tccaggttgg agggaggcaa tatcctgata tggtatatga aagcaaagtt gccttaggcc 7260

ctgctatatc acttgagagg ttagatgtag gtacaaattt agggaacgcc cttaagaaac 7320

tggatgatgc taagatattg atagactcct ctaaccagat ccttgagacg gttaggcgct 7380

cttcctttaa ttttggcagt ctcctcagcg ttcccatatt aatctgtaca gccctggctt 7440

tgttgtttct gatttactgt tgtaaaagac gctaccaaca gacactcaag cagcatatta 7500

aagtcgatcc gacatttaaa cctgatttga ctggaacttc gaaatcatat gtaagatcac 7560

tctgaagtac tctggtcaca cgtcttaccc gattgtcagg attgaaatct ataaatctcg 7620

ccctattttc tttaaaagct atcaaactgc aacaaatagt ggagaggact gactacgatt 7680

atcgaaatta aagaaaactt agggctcagg tagtccaaca atgctctcct accaagacaa 7740

ggtgggtgcc ttctataagg ataatgcaag agctaattca tccaagctgt ccttagtgac 7800

agaagagcaa gggggcagga gaccacccta tttgctgttt gtccttctca tccttctggt 7860

tggaatcatg accttgcttg ctatcactgg agttcgattt caccaagtat caactagcaa 7920

tatggaattt agcagattgc tgaaagagga tatggagaaa tcagaggccg tacatcacca 7980

agtcatagat gtcttgacac cgctcttcaa aattattgga gatgaggttg ggttacagtt 8040

gccacaaaaa ctaaacgaga tcaaacaatt tatccttcaa aagacaaact tcttcaatcc 8100

gaacagggaa ttcgacttcc gcgatctcca ctggtgcatt aatccaccta gtaagatcaa 8160

ggtgaatttt actaattact gcgatacaat tgggatcaaa aagtctattg catcggcagc 8220

aaatcccatc cttttatcag cactctccgg aggcagaggt gacatattcc caccatacag 8280

atgcagtgga gctactactt cagtgggcag agttttcccc ctatcagtat cattgtccat 8340

gtctttgatc tcaaaaacat cagagataac cagtatgcta actgctatct cagacggagt 8400

gtatggtaaa acctatttgc tagtgcctga ttacattgaa ggggagttcg acacgcaaaa 8460

gattcgagtc tttgagatag ggttcatcaa acggtggctg aataacatgc cattactcca 8520

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gggcgagttg acactggctt ccttgtgtgt agatgagagc accgtattgt tatatcatga 8640

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tatggatcaa gttgaagaag tgatacctgt cgctcaccca tcagtagaaa aaatacatat 8760

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ctctgagaaa caagaggaac aaaaaaattg tctggagtcg gcttgtcaaa gaaaaactta 8880

ccctatgtgc aaccaaacgt catgggaacc ctttggaggg ggacagttgc catcttatgg 8940

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cggtccggtt atactgaatg gagacggtat ggattattat gaaagcccac tttcggactc 9060

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tatcaaacca gatgatcatt aactgtatcg aaattgggag cattgttaat cagaccttgt 9900

tatcttatcc caaacataac catgtgatgt atccaaattg caacaaactt ttgtttcatg 9960

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