具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1山羊副流感病毒3型JS14-2株感染性cDNA克隆质粒的构建

1.CDV-3株全基因组克隆及序列测定

取冻存的山羊副流感病毒3型JS14-2株(公开于中国专利ZL 201810926226.2中，保藏号为CCTCC NO:V201832)细胞培养悬液200μL，根据Axygen核酸提取试剂盒操作说明，提取总RNA。根据CPIV3 JS2013株参考序列，将病毒全基因组序列划分为9个目标片段，用软件Primer Premier 5.0设计了9对特异性引物(如表1)分别扩增目标片段1-9，将引物送南京擎科生物科技有限公司合成。以提取的RNA为模板，分别以各对特异性引物用一步法RT-PCR试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)进行RT-PCR扩增。RT-PCR总体积20μL，其中2×R-Mix Buffer 10μL，上下游引物各0.5μL，E-Mix 0.4μL，RNA模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：45℃反转录30min；94℃5min；94℃30s，55-60℃30s(根据不同引物对的Tm值调整退火温度)，72℃2min，35个循环；72℃10min。对目的片段1-9进行回收纯化，产物送南京擎科生物科技有限公司进行序列测定。根据测序结果，拼接得到病毒全基因组序列，比对发现该序列与已有毒株序列同源性为99.6％-99.9％，与同源性最高的AHQJ2015-1株(MF693177.1)相比有15个核苷酸突变(表2)。

表1全基因组扩增用引物

表2JS14-2与AHQJ2015-1全基因组序列差异情况

2.CPIV3全基因组cDNA重组质粒的构建

利用软件分析JS14-2株全基因组序列的单一性酶切位点，选取适当的位置作为衔接点，将全基因组分为四个片段A、B、C、D，具体见图1。首先人工合成序列1(SEQ ID NO:1)(TAGCCTCGAGAATTCACGCGTGGTACCTCTAGGTCGACGGTACCGTTTAAACGGGTTATTAATTAAATCATTCGCGGCCGCTTCC)，插入pCI-neo质粒(购自Promega)的XhoI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pCI-neo-1，其序列中依次包含酶切位点XhoI-SalI-PmeI-PacI-NotI。

利用Primer Premier5.0设计特异性引物(如表3)分别扩增A、B、C、D四个片段，其中扩增的A片段的一端连接有锤头状核酶序列，扩增的D片段的一端连接有丁型肝炎核酶序列。

以提取的JS14-2株病毒的总RNA为模板，按照反转录试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)说明书制备山羊副流感病毒3型JS14-2株cDNA。

扩增A片段包括两次PCR扩增。第一次PCR扩增，总体积20μL，其中2×PCR Buffer10μL，上下游引物(AF1、AR)各0.5μL，cDNA模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min。以第一次PCR扩增产物为模板，以AF2、AR为引物，进行第二次PCR扩增，得到一端连接有锤头状核酶序列的A片段，PCR体系的构成同第一次PCR扩增，PCR程序同第一次PCR扩增。

扩增D片段包括两次PCR扩增。第一次PCR扩增，PCR体系总体积20μL，其中2×PCRBuffer 10μL，上下游引物(DF、DR1)各0.5μL，cDNA模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。以第一次PCR扩增产物为模板，以DF、DR2为引物，进行第二次PCR扩增，得到一端连接有丁型肝炎核酶序列的D片段，PCR体系的构成同第一次PCR扩增，PCR程序同第一次PCR扩增。

扩增B片段时，引物为BF和BR，PCR总体积20μL，其中2×PCR Buffer 10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。

扩增C片段时，引物为CF和CR，PCR总体积20μL，其中2×PCR Buffer 10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min。

将一端连接有锤头状核酶序列的片段A和pCI-neo-1分别采用XhoI和SalI酶进行双酶切，然后采用T4 DNA连接酶进行连接，将片段A插入pCI-neo-1中，得到了pCI-A。将pCI-A和片段B分别采用SalI和PmeI酶进行双酶切，然后采用T4 DNA连接酶进行连接，将片段B插入pCI-A中，得到了pCI-A-B。

将片段C、pCI-neo-1分别用PmeI和PacI酶进行双酶切，然后采用T4 DNA连接酶进行连接，将片段C插入pCI-neo-1中，得到pCI-C。将pCI-C和一端连接有丁型肝炎核酶序列的片段D分别采用PacI和NotI进行双酶切，然后采用T4 DNA连接酶进行连接，将连接有丁型肝炎核酶序列的片段D插入pCI-neo-1中，获得pCI-C-D。

以pCI-A-B为模板，用引物AB-F和AB-R，扩增片段A-B(片段A和B相连形成的片段)。PCR总体积20μL，其中2×PCR Buffer 10μL，上下游引物各0.5μL，模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min。

以pCI-C-D为模板，用引物CD-F和CD-R，扩增C-D片段(片段C和D相连形成的片段)。PCR总体积20μL，其中2×PCR Buffer 10μL，上下游引物各0.5μL，模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min。

以pYESlL质粒(购自Thermo Fisher scientific)为模板，以引物Vector-F和Vector-R进行PCR扩增，获得线性化的pYES1L载体。

将线性化的pYES1L载体、片段A-B和片段C-D混和，加入到MaV203酵母感受态(购自Thermo Fisher scientific)中，利用醋酸锂转化法转化至酵母细胞，然后接种于色氨酸(Trp)缺陷型平板(购自Thermo Fisher scientific)上，在30℃培养3天后，用引物CPIV3-F和CPIV3-R进行菌落PCR鉴定，筛选出阳性克隆(克隆策略如图2所示)。由于线性化的pYES1L载体和片段A-B、片段A-B和片段C-D、线性化的pYES1L载体和片段C-D分别存在着末端同源臂，因此，在宿主细胞酵母内，通过同源重组机制组装成携带CPIV3全长cDNA的重组质粒。

将菌落PCR筛选阳性的酵母菌落的裂解液电转化DH10B感受态细胞，通过大观霉素抗性筛选阳性重组子，增殖后通过质粒中量提取试剂盒纯化携带CPIV3全长cDNA的重组质粒，命名为pYES1L-CPIV3。大量提取重组质粒pYES1L-CPIV3，测定浓度后分装，置-20℃保存。

表3病毒cDNA克隆构建扩增引物

注：表3中下划线为核酶序列，斜体为酶切位点。

实施例2辅助质粒的构建与鉴定

针对CPIV3中N、P和L基因的开放阅读框区域，利用Primer Premier5.0设计特异性引物(包含同源臂，见表4)，以重组质粒pYES1L-CPIV3为模板，进行PCR扩增，获得N、P和L基因片段。回收纯化后的N、P和L基因片段，分别采用南京诺唯赞生物科技有限公司ClonExpress II One Step Cloningkit，通过同源重组的方法(参照试剂盒说明书操作)克隆至pCAGGS质粒的XhoI和BglII位点之间，然后将携带各基因的重组质粒分别转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经PCR酶切鉴定的阳性菌落克隆(图3)，进一步测序鉴定筛选出正确的重组质粒pCAGGS-N(携带N基因的重组质粒)，pCAGGS-P(携带P基因的重组质粒)和pCAGGS-L(携带L基因的重组质粒)。按照无内毒素质粒提取试剂盒的操作说明提取质粒，测定浓度后分装，于-20℃保存。

表4N、P、L基因扩增引物

注：表4引物中画横线的部分是酶切位点。

实施例3山羊副流感病毒3型JS14-2株重组病毒的拯救与生物学特性鉴定

1.重组病毒的拯救与扩增

于24孔板中按照5×10⁴个细胞/孔接种293T细胞，待细胞生长至90％汇合度时开始转染，每孔中的质粒用量为：感染性cDNA克隆质粒(重组质粒pYES1L-CPIV3)0.5μg，辅助质粒pCAGGS-N 0.5μg，pCAGGS-P 0.2μg和pCAGGS-L 0.1μg，转染试剂(Lipofectamine^TM2000)1.5μL，具体转染方法按照Lipofectamine^TM2000说明书进行操作。

将转染后的细胞在37℃、5％CO₂条件下培养4-5d，收获细胞悬液，冻融三次，2000rpm离心5min，取上清接种MDBK细胞，观察细胞病变。结果：接种后第二天，MDBK细胞即出现山羊副流感病毒3型典型的细胞病变：出现合胞体、融合、脱落(图4)。收获细胞培养物，得到第一代拯救病毒rCPIV3。将拯救病毒rCPIV3连续传代，每一代培养物均置-70℃保存。

2.重组病毒的鉴定

2.1间接免疫荧光检测

将收获的拯救病毒rCPIV3接种至MDBK细胞，培养72h。弃去培养液，使用免疫染色固定液固定细胞15min；再加入免疫染色封闭液37℃通透封闭30min；加入CPIV3特异单克隆抗体，37℃孵育1h；PBS洗涤3次；加入FITC标记羊抗小鼠IgG荧光二抗，37℃孵育1h，PBS洗涤3次。在荧光显微镜下观察可见感染病毒的细胞呈现特异的绿色荧光，而未接毒的对照细胞无荧光(图5)。说明重组病毒拯救成功，具有感染性。

2.2RT-PCR鉴定

分别提取重组病毒(拯救病毒rCPIV3)和亲本病毒(山羊副流感病毒3型JS14-2株)RNA，用一步法RT-PCR试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)，使用引物CF和CR进行RT-PCR扩增，RT-PCR总体积20μL，其中2×R-Mix Buffer 10μL，上下游引物各0.5μL，E-Mix 0.4μL，RNA模板2μL，无Rnase水补足至20μL。扩增程序：45℃反转录30min；94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。

1％琼脂糖凝胶电泳后回收片段，送南京擎科生物科技有限公司测序，比较序列是否与设计的一致。结果：扩增的序列与病毒cDNA质粒序列一致。

3.生物学特性鉴定

3.1TCID₅₀测定

用细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM培养基)将第三代重组病毒(拯救病毒rCPIV3)作10倍梯度稀释。然后将各稀释度的病毒液分别接种于长满单层MDBK细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度病毒液接种4个孔，每孔接种100μL。同时设定不接毒的阴性对照。37℃培养5天，观察细胞病变并按照Reed-Muench方法计算TCID₅₀。结果表明：第三代重组病毒滴度可达10⁸TCID₅₀/mL以上。

3.2生长曲线测定

在长满单层MDBK细胞的24孔细胞培养板中，按感染复数(MOI＝1)接种重组病毒(拯救病毒rCPIV3)和亲本病毒(山羊副流感病毒3型JS14-2株)，37℃培养。于感染后24h、48h、72h、96h和120h，分别取细胞培养上清，按照标题3.1中方法测定病毒的TCID₅₀，绘制病毒生长曲线。结果表明重组病毒和亲本病毒滴度在24-72h之间处于增长期，72-120h之间达到稳定，重组病毒在24-48h滴度高于亲本病毒(0.5log₁₀)，说明重组病毒增殖速度高于亲本病毒(图6)。

3.3稳定性测定

按照标题3.1中方法在MDBK细胞上分别测定不同代次(第三代、第五代、第八代、第十代)重组病毒的滴度，结果表明各代次重组病毒滴度分别为10⁸TCID₅₀/mL、10^8.5TCID₅₀/mL、10^8.15TCID₅₀/mL和10^8.25TCID₅₀/mL，病毒生长滴度均可达10⁸TCID₅₀/mL以上且保持稳定。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

扬州大学

<120> 山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用

<130> 20210917

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 85

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 序列1

<400> 1

tagcctcgag aattcacgcg tggtacctct aggtcgacgg taccgtttaa acgggttatt 60

aattaaatca ttcgcggccg cttcc 85

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

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<400> 2

aaggaattcc tatagtcacc aaacaagaga gaaaacctg 39

<210> 3

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> AF2

<400> 3

atctcgagtc tgtttggtct gatgagtccg tgaggacgaa actataggaa aggaattcct 60

atagtcac 68

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<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> AR

<400> 4

gctgtcgaca aacaatttgc tatgacc 27

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> BF

<400> 5

gcaaattgtt tgtcgacaac atgtacatgc 30

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> BR

<400> 6

gggcgtttaa actcttatga tttatttcta tg 32

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> CF

<400> 7

agagtttaaa caccctccaa cct 23

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> CR

<400> 8

cgatttaatt aataaccctg atacct 26

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<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DF

<400> 9

gttattaatt aaatcattcc cctcgac 27

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DR1

<400> 10

accgcgagga ggtggagatg ccatgccgac ccaccaaaca agagaagaac tct 53

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<211> 81

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DR2

<400> 11

tatgcggccg cctcccttag ccatccgagt ggacgtgcgt cctccttcgg atgcccaggt 60

cggaccgcga ggaggtggag a 81

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> AB-F

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cttgagctct aataggtctg tttggtctga tga 33

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<212> DNA

<213> artificial

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<223> AB-R

<400> 13

cataggttgg agggtgttta aactcttatg atttatttct atg 43

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> CD-F

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cataagagtt taaacaccct ccaacc 26

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> CD-R

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aactagaagg cacagctccc ttagccatcc ga 32

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Vector-F

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ggatggctaa gggagctgtg ccttctagtt gc 32

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Vector-R

<400> 17

tcagaccaaa cagacctatt agagctcaag ctctg 35

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<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> CPIV3-F

<400> 18

ggatgtataa caggagtc 18

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<211> 17

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> CPIV3-R

<400> 19

aggagaattc aaatggc 17