一种针对ii类vii型流行ndv株dhn3的感染性重组克隆方法
阅读说明：本技术 一种针对ii类vii型流行ndv株dhn3的感染性重组克隆方法 (Infectious recombinant cloning method for II-type VII-type epidemic NDV strain DHN3 ) 是由 陈瑞爱 黄梅 王楠楠 李延鹏 刘定祥 叶俊贤 罗琼 杨小云 董楠 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于兽用生物制品技术领域,公开了一种针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法,包括如下步骤：步骤1：构建辅助质粒,所述辅助质粒为三种,辅助质粒上的目标片段分别为NP基因、P基因、L基因；步骤2：构建DHN3全基因组表达载体；将人工重组得到的DHN3全基因组重组入载体质粒中得到全基因组表达载体；DHN3全基因组的序列如序列表SEQ ID NO 1；步骤3：将三种辅助质粒和DHN3全基因组表达载体共转染BHK-21细胞,得到含重组病毒rDHN3的病毒液；NP基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1-1591nt；P基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1925-3109nt；L基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-15192nt。该方法可以成功的克隆出于原病毒株完全相同、无突变的重组病毒。(The invention belongs to the technical field of biological products for livestock, and discloses an infectious recombinant cloning method for a II-class VII epidemic NDV strain DHN3, which comprises the following steps: step 1: constructing three types of helper plasmids, wherein target fragments on the helper plasmids are NP gene, P gene and L gene respectively; step 2: constructing a DHN3 whole genome expression vector; the DHN3 whole genome obtained by artificial recombination is recombined into a vector plasmid to obtain a whole genome expression vector; the whole genome sequence of DHN3 is shown in a sequence table SEQ ID NO 1; and step 3: co-transfecting the three auxiliary plasmids and a DHN3 whole genome expression vector to a BHK-21 cell to obtain virus liquid containing recombinant virus rDNN 3; the NP gene is shown in a sequence table SEQ ID NO: the 1 middle position is 1-1591 nt; the P gene is shown in a sequence table SEQ ID NO: the position in the 1 is 1925 and 3109 nt; the L gene is shown in a sequence table SEQ ID NO: the 1 position is 8166 + 15192 nt. The method can successfully clone the recombinant virus which is completely the same as the original virus strain and has no mutation.)
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法。
背景技术
新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的一种主要侵害鸡、火鸡、野禽及观赏鸟类的高度接触传染性、致死性疾病，俗称鸡瘟。属高度接触性、急性、烈性传染病。人类偶会感染，表现为结膜炎。世卫组织(OIE)将其列为必须通报的传染病，我国农业部也将其列为必须通报的一类动物疫病。因其传播速度快且发病和病死率均可达100％，一旦波及将严重危害家禽业,造成不可估量的损失。
新城疫的防预除了合理饲养，疫苗免疫预防仍是关键措施。除了建立建全正确的免疫程序，提供优良广谱高效廉价疫苗是预防该病的根本。
鸡新城疫疫苗分灭活苗和活苗。活苗主要有Ⅰ系，Ⅱ系(B1株)、Ⅲ系(F系)、Ⅳ系(Lasota株)。其中Ⅳ系活疫苗(Lasota株)是目前国内外广泛应用的较优良的低毒苗, 其毒力与免疫性能高于Ⅱ系苗,安全性良好。随着克隆技术的应用新一代克隆苗正逐步上市。目前被市场青睐的新一代弱毒活苗主要有由荷兰研制的新城疫克隆活苗C/30和由美国通研制的Ⅳ系优化克隆苗。此外新城疫中等毒力克隆株活疫苗(I系克隆苗)也表现出与普通I系苗相似但毒力稍温和,安全性较强的优势。
据流行病学调查，NDV的流行基因型随时间和地理环境而变化。上世纪20-50年代主要流性I-IV型，70年代首次发现V型主要在南美和中美以致全欧洲。80年代出现VI型并盛行于中东，亚洲和欧洲。85年VII型开始蔓延，并与VIII型流行于世界多个国家并在90年代导致在亚洲，非洲和中东的大流行。V-VIII型均为强毒。IX和X型尚局限在局部散发状态。由于针对IV型的疫苗得到了广泛应用，IV型NDV已得到良好控制。但针对其它基因型的疫苗尚欠缺从而均有流行的趋势。因此利用反向遗传克隆技术迅速开发针对实时流行株的高效，广谱，安全甚至多价的弱毒苗势在必行。此外，由于疫苗的广泛使用使疫检更加困难。因为无法甄别被感染鸡携带的是疫苗株还是野生毒株。通过重组方式可引入人工标签，使其能与野毒有效鉴别。
鸡新城疫病毒(NDV)属于单股负链RNA目，副粘病毒科副粘病毒属。该病毒具有一个双脂层囊膜，内衬一层M蛋白。膜外被具有纤突的糖蛋白(HN和F)包被使之外形呈花穗状。囊内含有由壳蛋白和一条负链RNA组成的长螺旋状核衣壳。新城疫病毒有6组基因，分别用于编码6个病毒蛋白，即具血凝素和神经氨酸酶活性的(HN)糖蛋白、具融合功能的(F)糖蛋白，非糖基化内膜蛋白(M)，核壳蛋白(NP)，磷蛋白(P)和高分子量蛋白 (L)。NDV基因全长为15186nt到15198nt。
已有研究表明将NDV的cDNA克隆作人功突变，更换，或在其中***外源序列并不会阻碍该病毒的复制，装配和释放。NDV的cDNA克隆已用于基础研究和疫苗开发。NDV的cDNA克隆可作为载体表达其它病原菌的抗原蛋白从而获得抗多种病原菌的多价疫苗。如1999年Peeters等将F基因裂解点作碱基突变使Latasa株弱毒变成了强毒(ref1)；2004 年Huang等将强度和弱毒株的HN基因互换也获得了不同毒力的新毒株(ref2)。2002年， Mebatson等用肝炎病毒的S2糖蛋白抗原表位基因取代NDV的NP蛋白优势抗原表位，成功获得了既抗NDV又抗肝炎病毒的杂合病毒(ref3)；2006年，Man等将H7禽流感病毒的HA基因、插在NDV B1株的P-M基因之间也成功获得了既抗NDV又抗H7禽流感病毒的杂合病毒(ref4)。最近Abzeid等又成功将埃及当前流行的IBV S蛋白组装进重组 NDV，获得了既针对原NDV又针对相应的IBV免疫保护的杂合病毒。(ref5)我国学者也用 LaSota株为载体先后获得多个具二价功能的杂合病毒。如既抗NDV又抗IBDV5杂合病毒 (ref6)；既抗NDV又抗H5N1的杂合病毒(ref7)；既抗NDV又抗鸡支原体TM1病毒的杂合病毒(ref8)。由于NDV只有一个血清型，因此它的遗传性能相对稳定。虽然NDV 的感染性cDNA克隆在国际上早有建立但国内基本上仅限于Latasa株，且基本局限在基础和临床的研究层面，这可能与国内疫苗生产单位的研发技术能力有关。
所以，本申请所要解决的技术问题是：如何开发出针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆病毒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法，该方法可以成功的克隆出于原病毒株完全相同、无突变的重组病毒。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种针对II类VII型流行NDV株DHN3 的感染性重组克隆方法，包括如下步骤：
步骤1：构建辅助质粒，所述辅助质粒为三种，辅助质粒上的目标片段分别为NP基因、 P基因、L基因；
步骤2：构建DHN3全基因组表达载体；将人工重组得到的DHN3全基因组重组入载体质粒中得到全基因组表达载体；DHN3全基因组的序列如序列表SEQ ID NO 1；
步骤3：将三种辅助质粒和DHN3全基因组表达载体共转染BHK-21细胞，得到含重组病毒rDHN3的病毒液；
NP基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1-1591nt；P基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1925-3109nt；L基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-15192nt。
在上述针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中，所述步骤1中的辅助质粒所涉及的载体为pXJ40系列的质粒或pcDNA3；所述步骤2中的载体质粒为pBR322系列的质粒或pACYC、pBAD系列的质粒。
在上述针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中，包括如下步骤：
步骤1：构建辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L，辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L的目标片段分别为NP基因、P基因、L基因，载体为pXJ40；
步骤2：构建全基因组表达载体pBR322-DHN3；将人工重组得到的DHN3全基因组重组入pBR322质粒中得到全基因组表达载体pBR322-DHN3；所述DHN3全基因组为II类VII型鸡新城疫病毒的全基因组；
步骤3：将辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L、全基因组表达载体pBR322-DHN3共转染BHK-21细胞，得到含重组病毒rDHN3的病毒液。
在上述针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中，所述步骤2具体为：
步骤21：建立pBR322-Base载体；在pBR322质粒上引入能够与DHN3全基因组进行同源重组的片段；所述片段上具有与DHN3全基因组的3’末端和5’末端对应的同源臂；
步骤22：构建过渡载体；所述过渡载体为质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3；所述质粒pBR322-PNP的目的片段包括NP、MINI和P基因；所述质粒 pBR322-PDP的目标片段包括P，PD1和PD2,PD3基因；所述质粒pBR322-LPD3的目标片段包括L1，L2，L3,L4和PD3基因；
步骤23：构建DHN3全基因组DHN3-A；将质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3进行酶切得到基因片段PNP、LPD3和PDP，将基因片段PNP、LPD3和PDP 通过T4链接酶连接得到DHN3全基因组DHN3-A；
步骤24：构建带同源臂的质粒片段；将步骤21中的pBR322-Base载体为模板进行PCR 扩增得到带同源臂的质粒片段；
步骤25：构建全基因组表达载体pBR322-DHN3；将步骤24中的带同源臂的质粒片段和步骤23中的DHN3全基因组DHN3-A进行同源重组得到具有DHN3全基因组DHN3-A的质粒pBR322-DHN3；
MINI基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1414-1949nt；PD1基因在序列表SEQ IDNO： 1中位置为2935-4956nt；PD2基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为4838-6454nt；PD3基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为6261-8283nt；L1基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-10709nt；L2基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为10174-12299nt；L3基因在序列表SEQID NO：1中位置为12238-14433nt；L4基因在序列表SEQ ID NO：1中位置 14214-15192nt。
在上述针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中，所述步骤3具体为：
用能表达T7RNA聚合酶的质粒与辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L、全基因组表达载体pBR322-DHN3共转染BHK-21细胞；得到含重组病毒rDHN3的病毒液。
在上述针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中，所述步骤21具体为：
在pBR322质粒上分别引入1个T7启动子，1个T7终止子以及1个HDV Ribozyme； T7启动子下游引入DHN3的3’末端的部分碱基HC1；在HDV Ribozyme的上游引入DHN3的 5’末端部分碱基HC2；其中，碱基HC1在DHN3全基因组序列中的位置顺序为15192-15159nt；碱基HC2在DHN3全基因组序列中的位置顺序为141-1nt。
在上述针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中，所述步骤22具体为：
步骤221：制备pBR322质粒片段：将pBR322质粒用Hind3和Nhe1作双酶切，然后经胶回收备用；
步骤222：制备目标片段；所述目标片段为NP、MINI、P、PD1、PD2、PD3、L1、 L2,L3,L4基因；
步骤223：将pBR322质粒片段和对应的目标片段用重组酶链接得到对应的质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3。
在上述针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中，所述步骤23为：
将质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3分别用BtgZ1单酶切后回收基因片段LPD和PDP；载体pBR322-PNP用BtgZ1和Hind3双酶切回收基因片段PNP；
将基因片段LPD、基因片段PDP、基因片段PNP通过T4链接酶作体外连接，获得DHN3全基因组DHN3-A。
本发明的有益效果在于：
本发明的方法可以成功的克隆出于原病毒株完全相同、无突变的重组病毒。
DHN3全基因组共15192nt，如将全长cDNA一次性通过RT-PCR获得，一是困难，一般市场可买到的DNA聚合酶很难合成大过10k的DNA片段，二是容易在PCR过程中引入随机突变。因此将DHN3全基因组分成3个片段，将其分别克隆到pBR322载体。片段的大小是基于它所持有的BtgZ1酶切位点来确定的，以利于随后的体外DNA片段连接。
本发明采用辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L、全基因组表达载体pBR322-DHN3 进行病毒液的制备，其主要原因在于：因为转染进细胞的全基因组表达载体pBR322-DHN3 有限，在短期内不能在细胞内合成足够的结构和功能蛋白；通过共转染辅助基因可在短期内提供用于病毒复制和组装所必须的成份。
附图说明
图1为本发明的实施例一的测序结果与已发表的所有NDV序列比对图。
图2为本发明的实施例一的(NDV感染的BHK-21细胞会发生明显的细胞融合现象的显微图；
图3为本发明的实施例一的L基因与测序质粒pMD19-L1，pMD19-L2，pMD19-L3和pMD19-L4的关系图；
图4为本发明的实施例一的辅助质粒pXJ40-L的PCR产物的电泳图；
图5为本发明的实施例一的辅助质粒pXJ40-L的PCR产物的电泳图；
图6为本发明的实施例一的辅助质粒pXJ40-L的酶切电泳图；
图7为本发明的实施例一的质粒pXJ40-L的质粒示意图；
图8为本发明的实施例一的质粒pXJ40-P的质粒示意图；
图9为本发明的实施例一的质粒pXJ40-NP的质粒示意图；
图10为本发明的实施例一的pBR322-Base载体的质粒示意图；
图11为本发明的实施例一的质粒pBR322-PNP的质粒示意图；
图12为本发明的实施例一的质粒pBR322-PDP的质粒示意图；
图13为本发明的实施例一的质粒pBR322-LPD3的质粒示意图；
图14为本发明的实施例一的全长DHN3-A的结构示意图；
图15为本发明的实施例一的阳性菌落A1-A3的电泳图；
图16为本发明的实施例一的全基因组表达载体pBR322-DHN3的酶切电泳图；
图17为本发明的实施例一的全基因组表达载体pBR322-DHN3的质粒示意图；
图18为本发明的实施例一的全基因组表达载体pBR322-DHN3的质粒示意图；
图19为本发明的实施例一的DHN3病毒、rDHN病毒和空白对照样的生长特性图；
图20为本发明的实施例一的pXJ40DE3质粒的PCR的菌落电泳图；
图21为本发明的实施例一的pBR322质粒片段的的质粒示意图；
图22为本发明的实施例一的质粒pXJ40的质粒示意图；
图23为本发明的实施例一的质粒pXJ40-DE3的质粒示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式说明本发明：但是可以理解这些具体的实施方式只是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。本领域的技术人员完全可以在本发明的启示下，对本发明的的具体实施方式或者技术特征进行改进，但这些经过改进或替换的技术方案，仍属于本发明的保护范围。
实施例一
一、主要仪器及试剂
THZ-100型电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。
A17105653型洁净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司。
DK-8D型三孔电热恒温水槽购自上海一恒科学仪器有限公司。
THZ-100型恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。
BCD-579WE型海尔冰箱购自海尔。
5424R型离心机；Eppendorf PCR仪；Thermo1300 SERIES A2生物安全柜，均购自Eppendorf。
DNA/RNA共提试剂盒(AP-MN-BF-VNA-250G)购自AXYGEN，TIAN prep Mini PlasmidKit (DP103-03)均购自天根有限公司。Gel Extraction Kit(D2500-02)购自OMEGA；M-MLVRT (2641A)购自TAKARA；RRI(2313A)购自TAKARA；Random 6primer(3801)购自TAKARA；Agarose(E0301)购自TSINGK；0.25％Trypsin-EDTA(25200-056),DMEM basic(C11995500BT)购自Gibco；Lipofectamine LTX and Plus Reagent(15338-100)购自Invitrogen；FBS(10099-141C)购自Gibco；Premix-Taq(RR902A)购自TAKARA；Pen Streppenicillin Streptomycin(15140-122)购自Gibco；Primer star GXL(R050)购自TAKARA；BtgZ1(R0703S)，T4 DNA Ligase(M0202M)购自NEB；其它限制性内切酶，链接酶均购自TAKARA.ClonExpress Multis One Step Cloning Kit(C113),购自诺维赞；BL21(DE)购自Merck公司；载体pMD19购自Takara，pBR322购自NEB。
二、病毒分离，纯化，测序和分析归类
(a)为了开发一株针对目前流行的NDV重组疫苗，我们首先从养鸡场采集病料 NDV(QTCF1)，病料中添加适量生理盐水后碾磨充分，离心12000rpm 10分钟，然后取上清通过0.4μm滤器过滤，将滤液中添加1％SP双抗后不经稀释，直接接种到鸡胚绒膜尿囊腔中，添加量为100μl/枚；
后进一步在SPF鸡胚的绒膜尿囊腔接种繁殖，待鸡胚死后收集尿囊液。
(b)将此尿囊液所含病毒在BHK-21细胞上进行噬斑纯化，纯化后的病毒命名为DHN3。具体操作如下：
使用双蒸水配置3％琼脂糖溶液，高压后置4℃备用。使用前用微波炉加热2～3 分钟融化并按3％琼脂糖2ml+2％FBS DMEM 24ml配制成琼脂糖液，将其置40℃干浴待用。
配置2％FBS+DMEM+1％SP抗生素培养液备用。
将从尿囊液回收到的DHN3病毒用DMEM培养液按1：10稀释成6个梯度，制得感染液10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6备用。
将BHK-21细胞置6孔培养皿中培养，待细胞长至90％满后分别加入上述感染液200μl，另补DMEM培养液800μl，使每孔终体积为1ml。轻轻摇匀后置37℃孵育2h。弃去孵育液，再用PBS洗2遍。每孔加入琼脂糖液2.5ml.4-6天后观察噬斑。
挑选1个大小适中噬斑分别感染BHK-21细胞，待细胞病变明显(NDV感染的BHK-21细胞会发生明显的细胞融合现象时(如图2)提取细胞总RNA。
以这个总RNA为模板，用非特异性引物(Random 6primer(3801))作逆转录，获得第一条cDNA。
再分以此cDNA为模板用特异性引物和ExTaq酶作PCR(其中特异性引物如下附表 1中的各质粒对应的引物，PCR的反应条件见表2、表3和表4)；
分别将这些PCR产物纯化后克隆进pMD19载体，再用pMD19载体两端的引物 (M13-F，M13-R)分别测序。总共10个质粒覆盖DHN3全基因组，详细见附表1。
表1用于检测DHN3序列的质粒表
引物L1-F见SEQ ID NO：2；引物L1-R见SEQ ID NO：3；引物L2-F见SEQ ID NO： 4；引物L2-R见SEQ ID NO：5；引物L3-F见SEQ ID NO：6；引物L3-R见SEQ ID NO： 7；引物L4-F见SEQ ID NO：8；引物L4-R见SEQ ID NO：11；引物PD1-F见SEQ ID NO： 9；引物PD1-R见SEQ IDNO：10；引物PD2-F见SEQ ID NO：12；引物PD2-R见SEQ ID NO：13；引物PD3-F见SEQ ID NO：14；引物PD3-R见SEQ ID NO：15；引物MINI-F 见SEQ ID NO：16；引物mini-r见SEQ ID NO：17；引物P-F见SEQ ID NO：18；引物P-R见SEQ ID NO：19；引物NDV-ST-W R见SEQ ID NO：20；引物NP-LB-R见SEQ ID NO：21；引物M13-F见SEQ ID NO：22；引物M13-R见SEQ ID NO：23.
表2 PCR的反应条件
表3 PCR的反应条件中的扩增引物表
表4 PCR的反应条件中不同酶的应用配方表
备注：
1.R050PCR反应程序
2.RR902 PCR反应程序
3.本发明中所涉及到的PCR反应体系的配制及反应程序的设定均按照上述方法进行。
在PCR过程中只有退火温度和延伸时间会根据具体引物和片段不同进行调整(如上表中所述)，其他均不发生变化。下面将不再详述PCR反应的过程。
通过NCBI Blast软件将测序结果与已发表的所有NDV序列比对，其结果显示如图1。结论是此DHN3新城疫病毒全基因组全长15192nt,属II类VII型NDV。
为了保证序列准确无误，上述实验从病毒感染到测序结果分析反复重做了3次。其测序结果均相同，证实由这个噬斑获得的是一株纯化的DHN3病毒株。
DHN3序列见序列表SEQ ID NO：1。
三、构建重组病毒rDHN3
3.1建立为获得重组病毒所需的质粒
3.1.1构建辅助质粒
将NP，P和L基因，分别克隆进pXJ40载体获得辅助质粒pXJ40-NP，pXJ40-P和pXJ40-L。pXJ40质粒含CMV启动子和SV40多聚腺嘌呤A信号片段，因此外源基因可在细胞DNA聚合酶II作用下被有效转录，然后翻译成用以组装活性病毒粒子的蛋白 NP,P,和L蛋白。
具体方法阐述如下：
构建辅助质粒pXJ40-L
前述测序质粒pMD19-L1，pMD19-L2，pMD19-L3和pMD19-L4覆盖了完整的DHN3 的L基因，如下图3所示。
通过设计4对带同源重组序列的特异性引物(具体可见附表5)，分别以pMD19-L1，pMD19-L2，pMD19-L3和pMD19-L4为模板，扩增出能用于将L完整序列克隆进pXJ40 载体的片段L1，L2,L3和L4。L1的5’末端同时带有与pXJ40 BamH1端同源的同源臂，L4的3’末端则带有与pXJ40 Pst1端同源的同源臂。
将载体pXJ40用BamH1和Pst1双酶切，再通过胶纯化回收。
将上述4个片段和BamH1/Pst1双酶切后的载体pXJ40加在一起，在重组酶(ClonExpress Multis One Step Cloning Kit(C113))的作用下作同源重组，得到重组产物。
将重组产物转化进DH5α细胞，经单菌落PCR筛选。用引物PXJ40-F(pXJ40-F:GCAACGTGCTGGTTATTGTG)/P-L1-R(P-L1-R:GGACAGTTGACTCATTGCTAACATA)扩增出正确的PCR产物为2110bp；用引物P-L3-F/P-L3-R扩增出正确的PCR产物为2027bp. 图4和图5证明：检测8个菌落，8个阳性菌均产生了正确分子量的PCR产物；
引物PXJ40-F见SEQ ID NO：24；引物P-L1-R见SEQ ID NO：25；
进一步将其中一株菌培养扩增，提取质粒DNA。再经BamH1/Pst1双酶切，正确的酶切产物应为6230bp和5081bp。实验结果如下图6所示，证实该质粒含正确分子量的DNA片段，质粒pXJ40-L示意图如图7。
表5用于建立pXJ40-L的PCR引物
引物P-L1-BamH1-F见SEQ ID NO：26；引物P-L2-F见SEQ ID NO：27；引物P-L2-R 见SEQ ID NO：28；引物P-L3-F见SEQ ID NO：29；引物P-L3-R见SEQ ID NO：30；引物 P-L4-F见SEQ ID NO：31；引物P-L4-Pst1-R见SEQ ID NO：32。
表6质粒pXJ40-L构建配方表
备注：
1.对于另外两个辅助性质粒pXJ40-NP,pXJ40-P的构建使用的是普通连接酶连接转化的方法，并非使用的同源重组的方法。
2.pXJ40-NP,pXJ40-P质粒的构建
2.1使用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pXJ40质粒，将切下的片段(4288bp)作为构建 pXJ40-NP,pXJ40-P的质粒片段。
2.2使用NP-PXJ-0F2/NP-PXJ-1591R2(见表9)扩增NP片段(R050,60℃退火温度，1min30s延伸时间)。使用P-PXJ-1083F2/P-PXJ-3080R2扩增P基因(R050,退火 60℃，延伸1min15s)。扩增NP,P基因的两对引物中引物P-PXJ-0F2和引物 P-PXJ-1083F2中含有EcoRⅠ的酶切序列；引物NP-PXJ-1591F2和引物P-PXJ-3080R2 序列中含有XhoⅠ序列。这样，使用这两对引物分别扩增NP和P基因，扩增出的产物在两端便分别含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点。将使用这两对引物扩增出的产物再用 EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，这样酶切后的产物便含有EcoRⅠ和XhoⅠ的粘性末端。
2.3将含有EcoRⅠ和XhoⅠ粘性末端的线性化pXJ40片段和分别含有EcoRⅠ和 XhoⅠ的NP,P片段的酶切产物做连接转化，挑菌验证。如此便构建成了质粒 pXJ40-NP,pXJ40-P。
3.构建pXJ40-L质粒时扩增各片段时使用的是R050高保真酶，其退火温度均为60℃，延伸时间计算方法及扩增体系均按照前面R050酶的说明计算。
4.鉴定质粒pXJ40-L时，使用引物pXJ40-F和P-L1-R鉴定，使用的是RR902酶。配制反应液体系反应程序及延伸时间计算均按照前面所述，此对引物的退火温度为 57℃。
下表7为质粒pXJ40的酶切过程及NP,P基因扩增产物的酶切过程。另外表8为 NP,P基因的酶切产物与pXJ40质粒的酶切产物的连接过程。需要指出的是NP,P基因的PCR产物和酶切产物以及pXJ40质粒的酶切产物都是经过了琼脂糖电泳胶回收后再进行下一步操作。
表7质粒pXJ40的酶切过程及NP,P基因扩增产物的酶切过程参数表
表8 NP,P基因的酶切产物与pXJ40质粒的酶切产物的连接过程参数表
P基因插在pXJ40的EcoR1和Xho1之间；NP基因插在pXJ40的EcoR1和Xho1 之间。见质粒示意图8和9。
表9用于建立pXJ40-P,pXJ40-NP的引物
引物P-PXJ-1893F2见SEQ ID NO：33；引物P-PXJ-3080R2见SEQ ID NO：34；引物NP-PXJ-0F2见SEQ ID NO：35；引物NP-PXJ-1591R2见SEQ ID NO：36；
上文以及下文多处提及载体质粒pXJ40,pXJ40是一个应用非常广泛的载体质粒，其具有丰富的酶切位点，在大量的质粒构造过程中采用pXJ40。
本发明所用的载体质粒pXJ40来源于华南农业大学的群体微生物中心刘定祥教授实验室，其质粒示意图如图22，图22所示的pXJ40-NEW即为pXJ40，其序列见序列表SEQ IDNO：66；本领域普通技术人员可根据该序列表通过人工序列合成方法得到。华南农业大学的群体微生物中心刘定祥教授实验室可提供如图22所示的质粒结构图的载体质粒。
同时，载体质粒pXJ40也可以通过本领域其他商业化的质粒转换得到，具体来说，采用商品质粒pXJ40-flag可以制备得到本实施例所用的pXJ40，其改建原理为：为了避免Flag对病毒蛋白功能的影响；我们从商品化的质粒pXJ40-Flag经过改建去除 Flag获得pXJ40-New。
pXJ40-flag的来源渠道有至少以下两种；
渠道一、实验室保存；pXJ40-flag保存于华南农业大学的群体微生物中心刘定祥教授实验室，华南农业大学的群体微生物中心刘定祥教授实验室可提供pXJ40-flag 质粒；pXJ40-flag在刘定祥教授发表的文献中有记载，具体记载为“pXJ40F(with a Flag tag)”，该文献出处为：Journal of virology,Dec.2009,p.12462-12472，《Inhibition ofProtein Kinase R Activation and Upregulation of GADD34 Expression Play aSynergistic Role in Facilitating Coronavirus Replication by Maintaining DeNovo Protein Synthesis in Virus-Infected Cells》作者廖瑛、王晓星、刘定祥。
渠道二、从普如汀生物技术(北京)有限公司购买，货号为pXJ40-flag。
具体制备步骤为:
步骤1：制备质粒片段：2ug pXJ40Flag+1ul EcoR1+1ul Bsa1+5ulBuffer加水至50ul，37℃孵育2小时；胶回收2998bp片段备用；
步骤2：PCR扩增无Flag片段：以2ng pXJ40Flag为模板，用引物dFlagF: ACTATAGGGCGAATTCGGATCCAAGCTTCTCG/Bsa1R:TGAGCGTGGGTCTCGCGGT，高保真DNA聚合酶(TAKARA公司R050)通过PCR扩增1322bp片段(退火温度60度，延伸时间1 分30秒)，胶回收备用。
步骤3：通过同源重组的方法用ClonExpress Multis One Step Cloning Kit(诺维赞C113)，上述步骤1得到的2998bp片段50ng,上述步骤2得到的1322bp片段 22ng,buffer4ul,酶2ul，加水至20ul；37℃孵育30分钟。
步骤4：将上述重组产物转化进DH5α(常规方法，TAKARA)，氨苄青霉素培养筛选。常规制备质粒后用引物pXJ40R:AGCGGAAGAGTCTAGAGTCG进行测序验证。含正确序列(无Flag序列)者为pXJ40-New质粒。
3.1.2建立pBR322-Base载体
为获得重组病毒，首先需建立1个能获得全基因组单股负链RNA的基础质粒(pBR322-Base)。
为了获得较高的转录水平且保证由此转录的RNA不含任何外源核糖核酸，在pBR322 质粒上分别引入1个T7启动子，1个T7终止子以及1个HDV Ribozyme，使之最终能在外源的T7RNA聚合酶的作用下准确合成DHN3全基因组负链全长RNA。
为了方便将DHN3全基因组通过同源重组的方法整合到pBR322载体上，在T7启动子下游引入DHN3的3’末端的HC1；在HDV Ribozyme的上游引入DHN3的5’末端部分碱基 HC2；碱基HC1在DHN3全基因组序列中的位置顺序为15192-15159nt；碱基HC2在DHN3全基因组序列中的位置顺序为141-1nt。(见质粒示意图10)
含T7终止子、HDVRibozyme、HC2、HC1、T7启动子的DNA片段通过人工合成，并通过同源重组的方式组合到pBR322载体上获得pBR322-T7Pro-HDV_Ter，即基础质粒 pBR322-Base(质粒示意图10)。
3.1.3建立3个亚基因组过渡载体
DHN3全基因组共15192nt，如将全长cDNA一次性通过RT-PCR获得，一是困难， (一般市场可买到的DNA聚合酶很难合成大过10k的DNA片段)，二是容易在PCR过程中引入随机突变。因此将DHN3全基因组分成3个片段，将其分别克隆到pBR322 载体。片段的大小是基于它所持有的BtgZ1酶切位点来确定的，以利于随后的体外 DNA片段连接。
具体构建方法如下：
A.制备质粒片段：将pBR322载体(如图21)用Hind3和Nhe1作双酶切，然后经胶回收备用。
B.制备目的基因片段：分别用带同源臂的引物和相应的模板(见下表11)在高保真DNA聚合酶的作用下扩增带同源臂的DNA片段，经跑DNA胶验证后回收备用。
C.将目的基因片段和pBR322质粒片段用重组酶链接。经细菌转化，单菌落PCR 初选，扩增质粒DNA，酶切质粒DNA后跑DNA胶复选，最后测序验证。
用于构建pBR322-PNP质粒的目的片段包括NP,MINI和P。
用于构建pBR322-PDP质粒的目的片段包括P，PD1和PD2，PD3。
用于构建pBR322-LPD3质粒的目的片段包括L1，L2，L3,L4和PD3。
以上3个中间质粒分别图11-13所示，其中，图11为：pBR322-PNP质粒示意图；图 12为：pBR322-PDP质粒示意图；图13为pBR322-LPD3质粒示意图。
表11.目的片段所涉及的模板和引物表
引物C-Sac11BtNhe-ST-R见SEQ ID NO：37；引物C-NP-F见SEQ ID NO：38；引物C-Mini-R 见SEQ ID NO：39；引物C-Mini-F见SEQ ID NO：40；引物C-P-R见SEQ ID NO：41；引物C-HindBt-P-F见SEQ ID NO：42；引物C-BtNhe-P-R见SEQ ID NO：43；引物C-P-F见 SEQ IDNO：44；引物C-PD1-R见SEQ ID NO：45；引物C-PD1-F见SEQ ID NO：46；引物 C-PD2-R见SEQID NO：47；引物C-PD2-F见SEQ ID NO：48；引物C-PD3-R见SEQ ID NO： 49；引物C-HindBtg-PD3-F见SEQ ID NO：50；引物C-BtNhe-PD3-R见SEQ ID NO：51；引物C-PD3-F见SEQ ID NO：52；引物C-L1-R见SEQ ID NO：53；引物P-L2-R:见SEQ ID NO：54；引物P-L3-F见SEQ ID NO：55；引物C-HindBtNot-L4-F见SEQ ID NO：56；
表12各质粒的构建配方表
备注：
1.在分别扩增完构建PBR322-PNP质粒,PBR322-PDP质粒,PBR322-LPD3质粒所需要的目的片段后，根据上表12中的重组体系进行混合，之后按照同源重组的步骤进行操作，构建相应质粒。
2.由PBR322-DHN3质粒构建策略可知，病毒基因组中包含两个BtgZⅠ酶切位点，根据这两个酶切位点将病毒全基因组分成3个大片段，此即我们构建 PBR322-PNP,PBR322-PDP,PBR322-LPD3三个质粒中所包含的三个大片段。同时在对病毒基因组进行基础测序时有将病毒全基因组分成10个小片段 (NP,P,PD1,PD2,PD3,L1,L2,L3,L4),BtgZⅠ酶切位点刚好处于P片段和PD3片段上，故在构建PBR322-PNP,PBR322-PDP,PBR322-LPD3质粒时扩增P片段和PD3时以P左，P右，PD3 左，PD3右来代称。
3.由于L蛋白是NDV病毒的核衣壳蛋白，所以在完成质粒 PMD19-L1,PMD19-L2,PMD19-L3,PMD19-L4后首先构建了质粒PXJ40-L，用作拯救病毒的辅助性蛋白。故而在构建PBR322-LPD3质粒时使用的模板之一是PXJ40-L，此质粒已经包括了L基因的全部序列。
在构建PBR322-LPD3过程中将L基因分作2段扩增，称之为L1-2,L3-4,(其中，L1-2是指小片段L1和L2的连续序列，其由引物C-L1-R、P-L2-R，模板pXJ40-L构建得到，L3-4 是指小片段L3和L4的连续序列，其由引物P-L3-F、C-HindBtNot-L4-F，模板pXJ40-L构建得到)；并且需要指出的是在扩增L3-4的引物C-HindBtNot-L4-F中包含构建 PBR322-DHN3质粒时所需的同源区以及一个BtgZⅠ酶切序列，这样便可以通过BtgZⅠ将 PBR322-LPD3中的病毒基因组序列完整切下，并且切下的片段直接用于PBR322-DHN3质粒的构建。
4.上表13中PBR322-PNP质粒,PBR322-PDP质粒,PBR322-LPD3质粒的构建过程中所涉及到的PCR扩增反应使用到的酶全部为PrimeSTARGXLDNAPolymerase(R050,TAKARA),反应体系参考前面所述。根据此酶R050的特性，在扩增反应中预变性温度和时间均为95℃，3min,变性温度和时间为98℃，10s,退火温度和时间使用的均为60℃，15s,延伸的温度均为68℃延伸时间则根据片段大小按照1000bp延伸60s的比例适当选择。反应体系均为 30μl。
5.本发明中涉及到使用同源重组方法的实验中，使用的试剂盒均为 ClonExpressMultisOneStepCloningKit(C113，诺维赞)，将不再赘述。
3.1.4构建全基因组表达载体pBR322-DHN3
制备DHN3-A片段：从pBR322-PNP质粒、pBR322-PDP质粒、pBR322-LPD3质粒上酶切回收片段PNP、片段PDP，以及片段LPD3；并将片段PNP、片段PDP，以及片段 LPD3连接得到全长DHN3-A备用。
具体来说，参考表13，pBR322-PNP质粒用BtgZ1和Hind3双酶切后回收片段PNP；
从pBR322-PDP质粒回收片段PDP的方法为：pBR322-PDP质粒用BtgZ1单酶切后回收片段PDP；
从pBR322-LPD3质粒回收片段LPD3的方法为：pBR322-LPD3质粒用BtgZ1单酶切后回收片段LPD3；
表13各质粒片段的回收配方和工艺参数表
备注：
1.片段PNP,片段PDP,片段LPD3的制备按照上表中的酶切体系及时间操作；酶切结束后，可取少量作凝胶电泳观察酶切是否完全，如不完全，需适当多加一点酶或延长孵育时间，或二者兼备；
2.片段PNP的制备需要Hind3和BtgZⅠ两个酶的切割。需要指出的是这两个酶切反应是分别进行的，不是同时进行。即先使用Hind3酶切，琼脂糖电泳胶回收到目的产物后再使用BtgZⅠ酶切。所以上表中的pBR322-PNP’指的是Hind3酶切后的产物。
3.制备含0.03％全式金染色液的0.6％琼脂(TsingKe,TSJ001)凝胶。取0.6微克琼脂加100毫升TAE缓冲液置微波炉加热1-2分钟至琼脂完全融化，待冷却至50℃左右加全式金染色液(按1：3000倍稀释)混匀后铺胶。注意染色剂加多了可能抑制DNA 片段的链接。将上述的酶切产物全部经上述的凝胶电泳分离。将凝胶置一清洁的玻璃平板上，用一次性不锈钢刀片将正确的目的片段切下回收。用GelExtractionKit (D2500-02，OMEGA)按试剂盒提供的方法进行纯化。
所述片段PNP、片段PDP、片段LPD3通过高浓度T4链接酶作体外连接，获得全长DHN3-A。具体参数参考表14。全长DHN3-A的质粒结构如图14所示；
表14 pBR322-DHN3质粒的连接配方表
备注：
1.片段PNP,片段PNP,片段LPD3按照上表的量计算使用，并连接。
2.将连接产物直接使用试剂盒
(MiniBESTDNAfragmentpurificationkitVersion4.0，TAKARA，9761)纯化，纯化后的产物跑琼脂糖电泳胶看是否连接完全。
制备带同源臂的质粒片段：用上述pBR322-Base质粒为模板，使含同源臂配对碱基的特殊引物(A2-F:ATCGGTAGAAGGTTCCCTCAGGTTC；A2-R: GGTCCTATAGTGAGTCGTATTAATG)，用Primer star GXL试剂盒提供的材料并按照试剂盒提供的方法进行PCR扩增。引物A2-F见SEQ ID NO：57；引物A2-R见SEQ ID NO： 57；
用上述纯化试剂盒(Mini BESTDNA fragment purification kit Version4.0，TAKARA，9761)，按试剂盒提供的方法进行对本步骤的PCR扩增产物进行纯化，制得带同源臂的质粒片段。
将此质粒片段与DHN3-A进行同源重组得到全基因组表达载体pBR322-DHN3。
具体来说，通过使用购自诺维赞重组试剂盒(ClonExpressMultis One StepCloning Kit，C113)来进行。取上述带同源臂的质粒片段、上述DHN3全基因组DNA 片段(即上述体外连接产物，DHN3-A)按诺维赞重组试剂盒提供的方法进行同源重组，具体配方参数可参考表15。
表15质粒片段与DHN3-A同源重组的配方表
试剂
用量
DHN3-A
200ng
pBR322-Base
91.02ng
5×CE MultiS Buffet
4μl
Exnase MultiS
2μl
ddH<sub>2</sub>O
up to 20μl
将重组产物转化入DH5a感受态细胞。用特异性引物C-pBR322-R(C-pBR322-R：GAAATTGCATCAACGCATATAGCGC)；C-NP-F(C-NP-F：CATCTGGTTGCCCTTGCGGCTTGTTC)作单菌落PCR，获3个阳性菌落A1-A3，如图15。引物C-pBR322-R见SEQ ID NO：59；引物C-NP-F 见SEQID NO：60。
将菌落A1作扩增培养并提取质粒DNA。将A1质粒用Sac1酶切作初步鉴定，正确的酶切产物应是1个8482bp,1个7065bp,1个3132bp,1个908bp,和1个32bp的片段。结果如图16，显示该酶切产物与序列推断的结果一致。32bp片段太小无法在琼脂电泳胶中显示。命名该质粒为pBR322-DHN3。将此质粒再次测序，验证无误后扩增备用。
质粒pBR322-DHN3质粒结构图如图17；质粒pBR322-DHN3质粒结构图如图18。
3.1.5拯救病毒。
将BHK-21细胞置30mm培养皿培养过夜使其达80-90％满。用pXJ40DE3(DE3表达T7RNA 聚合酶。)与pBR322-DHN3,pXJ40-NP，pXJ40-P和pXJ40-L共转染。4天后将培养皿置 -20冰箱冻融2次后将细胞和培养液收集至无菌离心管，离心12000rpm 10分钟，收集上清。再将此上清(含rDHN3)100μl继续感染BHK-21细胞，2-3天后可见细胞融合病变。继续培养1天后将培养皿置-20冰箱冻融2次，再收集离心12000rpm 10分钟，收集上清。为加速病毒扩增，可将病毒rDHN3P1接种SFP鸡胚，搜集尿囊液获取病毒rDHN3。
上述转染步骤涉及转染液各物质用量如下：
转染液包括A液和B液
按Lipofectamine LTX and Plus Reagent(15338-100)，Invitrogen提供的方法进行转染。
新城疫病毒囊膜表面有HN，可吸附红细胞引起部分动物红细胞凝集。当新城疫病毒浓度高时，还可以进一步导致红细胞溶解。根据新城疫病毒的这个特性，可通过这个实验来检测待检溶液中是否有新城疫病毒，以及病毒的含量。我们将上述方法拯救出的第一代rDHN3在SFP鸡胚扩增后搜集尿囊液作为待检样品，通过下面红细胞凝结实验证明以上rDHN3重组病毒具备与母毒株相同的凝血功能。二者的最高凝血效价均为28。
具体测试过程如下：
1.将待检样品用生理盐水按1：10做系统稀释；
2.将96孔板中每孔加入25μl生理盐水；
3.将不同稀释度的病毒液分别加入到对应的孔中，25μl/孔(每一行为一个病毒，最后一排不添加病毒液做对照用)；
4.每孔加入25μl 1％鸡红细胞；
5. 15-20分钟后观察血凝情况。
上文涉及的pXJDE3质粒具体如下：
pXJ40DE3质粒为T7RNA聚合酶(DE3)表达质粒。DE3基因通过使用引物 BamH1-DE3-F/BamH1-DE3-R从大肠杆菌BL21(DE3)(Merck公司)获得。再经同源重组将其***到质粒pXJ40的BamH1位点中；pXJ40DE3质粒质粒结构图如图23。
pXJ40DE3质粒制备步骤
步骤1：提取大肠杆菌BL21(DE3)DNA：常规细菌DNA提取方法。
步骤2：PCR制备DE3片段：以大肠杆菌BL21(DE3)细菌DNA为模板，利用高保真 DNA聚合酶(GXL)通过引物：
BamH1-DE3-F：actcactatagggcgaattcggatccgccatgaacacgattaacatcgc；
BamH1-DE3-R：taagatctggtaccgagctcctgcagttacgcgaacgcgaagtccgactc进行扩增。
引物BamH1-DE3-F见SEQ ID NO：61；
引物BamH1-DE3-R见SEQ ID NO：65；
GXL酶(R050),退火温度60℃，延伸时间2分36秒。产物经凝胶电泳验证后纯化备用。
步骤3：制备载体：将pXJ40用PstⅠ，BamHⅠ双酶切后经胶回收备用，具体配方和工艺参考表16。
表16载体pXJ40的双酶切配方工艺表
pXJ40
1μg
Quick Cut PstⅠ
1μl
Quick Cut BamHⅠ
1μl
10×QuickCut Buffer
2μl
ddH20
up to 20μl
温度
37℃
时间
3h
步骤4：将DE3片段重组进pXJ40载体，具体工艺和配方如下表17。
表17 DE3片段重组进pXJ40载体的工艺配方表
步骤5：将重组产物转化入DH5α中，通过在含50ug/ul氨苄的平板培养。次日从平板上挑选8个菌落进行PCR验证。
验证引物为pXJ40-F:GCAACGTGCTGGTTATTGTG；DE3-R:GAAGTCCGACTCTAAGATGTCACG,使用ExTaq酶(RR902),退火温度57℃，延伸2’42”(目的片段大小为2723bp).结果如图20:8个菌有3个强阳性(L1，L5，L7)1个弱阳性(L4)。将L1扩大培养后提取质粒，测序验证无误。引物DE3-R见SEQ ID NO：62；
四、鉴定rDHN3
4.1基因稳定性
用上述拯救出的病毒rDHN3再经鸡胚传代3次后感染BHK-21细胞，待细胞病变明显时分别提取细胞总RNA。
用特异性引物作逆转录获得第一条cDNA.再以此cDNA为模板用特异性引物 (JF-F:CCTTGCAGCTGCAGGAATTG；JF-R:GCTCTATACAGTATGAGGTGTCAAG)和DNA聚合酶作PCR。将此PCR产物纯化后用引物(JF-F:CCTTGCAGCTGCAGGAATTG)测序。其结果显示与原毒株无差异。说明在病毒拯救的过程中DHN3 F基因是稳定的，无自然突变发生。引物JF-F见SEQ ID NO：63；引物JF-R见SEQ ID NO：64。
4.2重组病毒rDHN3感染BHK-21细胞出现的融合病变情况
参考图19，分为A、B、C三列，其中，A列代表DHN3病毒感染BHK-21细胞12h 后形态；B列为rDHN3感染BHK-21细胞12h后细胞的形态；C列为BHK-21细胞未感染病毒12h后的形态。
图中箭头所指出为DHN3或rDHN3感染BHK-21细胞出现的融合病变
DHN3是指病毒分离，盲传并在BHK-21细胞上进行噬斑纯化后的病毒；测序和分析归类步骤中涉及的均为此病毒。
rDHN3是指重组病毒，即文中通过重组克隆拯救出的病毒。
通过图20可看出，重组病毒rDHN3和它的母体病毒DHN3均能感染BHK-21形成细胞融合。
此外我们也比较了rDHN3和DHN3的生长特性和毒力，均未发现二者有明显差异。
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tagaaggtgt gaaccccgaa cgcgagatcg aagcttgaac ctgagggaac cttctaccga 120
tatgtcgtct gtttttgacg aatacgagca gctccttgct gcccagaccc gccctaacgg 180
agcccatgga gggggagaga aagggagcac cttaaaagtt gaggtcccag tatttaccct 240
aaacagtgat gatccagagg atagatggaa ctttgcggta ttctgtcttc ggattgccgt 300
tagtgaggat gccaacaaac cactcaggca aggtgctctt atatccctct tatgctccca 360
ttctcaggtg atgagaaacc atgttgccct tgcaggaaaa cagaacgagg ccacactagc 420
tgttcttgag atcgatggtt ttgctaataa tgtgccccag ttcaacaata ggagtggagt 480
gtccgaggag agagcacaga gattcatggt aattgcaggg tctctccctc gggcatgcag 540
caacggtact ccgtttgtca cggctggggt tgaagatgat gcaccagaag atatcactga 600
cactctggaa aggatcctat ctgtccaagt ccaagtatgg gtcacggtag caaaggccat 660
gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga ataaataagt atatgcagca 720
gggtagagtc cagaagaagt acatccttca tcctgtatgc aggagtgcaa ttcaactcat 780
aatcagacat tctctggcag tccgtatttt cctggttagt gagctcaaga ggggccgtaa 840
tacagcaggt gggagctcta catattacaa tttggtcggg gatgtagact catacatcag 900
aaataccggg cttactgcgt ttttcctaac actcaaatat ggaatcaata ccaagacgtc 960
agctctcgca ctcagcagcc tcacaggtga tatccaaaaa atgaaacagc tcatgcgttt 1020
atatcggatg aaaggtgaaa atgcaccata catgacattg ttaggtgaca gtgaccagat 1080
gagctttgcg ccagccgaat atgcacaact ttattctttt gccatgggca tggcatcagt 1140
cttagataag ggaactggca agtaccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 1200
gcgacttgga gtagagtatg ctcaggctca gggaagtagt atcaatgaag acatggctgc 1260
tgagttaaaa ctaaccccag cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aacgagtatc 1320
tgaagaaatc ggcagcatgg acattcctac tcaacaagca ggagtcctca ccgggctcag 1380
tgacgaaggc ccccgaactc cacagggtgg atcgaacaag ccgcaagggc aaccagatgc 1440
tggggatggg gagacccaat tcctggattt tatgagaaca gtggcgaaca gcatgcggga 1500
atcgcctaat cctgcacaga gcaccactca tctagagcct cccccgaccc ctggggcatc 1560
ccaagacaac gacactgact gggggtactg atcgactact cccagcctgc ctccatagga 1620
ccacaccaaa cccctccccc aaaacccccc cacacccccc gacccacaac cccgcacgac 1680
ccccccaaca aaagctcccc cccaccctct cccccacccc cagccacacg accccatcca 1740
cccgggacaa cacaggcaca gctcggccag tcaacaatcc tcccagagtc caaggtatta 1800
gaaaaaaata cgggtagaag agagacatcc agagaccagg acgggtcacc aagctctctg 1860
ttctcccttc tacccggtga gttagggtga agatggctac ctttacagat gcggagatag 1920
atgacatact tgagaccagt gggactgtca ttgatagcat aattacggcc cagggcaaat 1980
cagccgagac cgtcggaaga agtgcgatcc cgcagggcaa gaccaaagct ccaagcacag 2040
cacgggagaa gcacgggagt gcccagccac acgccagtca ggacgtcccc gaccaacaag 2100
acagaacaga aaaacagcca tccacacctg agcaggcaac cccacacaac aacccaccga 2160
ccacacccac cgaaccgccc tccacccagg ccgcaagcga gaccagcgac acacagctca 2220
aaaccggagc aagcaactcc cttctgtcca tgctcgacaa attaagcaat aaatcgtcta 2280
atgctaaaaa gggcccatgg tcgggtcccc aagaagggca tcaccaatct ccggcccaac 2340
aacacgggaa ccagtcgagc catggaagca accagggaag accacagcac caggtcaagg 2400
ccgtctctgg aaaccggggc atagacgaga acacagcata tcatggacaa cggaaggagt 2460
cacaaccatc agctggtgca acccctcatg cgccccagtc agggcagagc caagacaata 2520
ttcctgtacc tgtggatcgt gtccagctac ctgccgactt tgcgcaggcg atgatgtcta 2580
tgatggaggc attatctcag aaggtaagta aagttgatca tcagctggat ctggtcttga 2640
aacagacatc ctctattcct atgatacgat ctgaaatcca acagctcaag acatctgttg 2700
cgatcatgga agctaactta ggtatgatga aaattctgga ccctggttgt gccaacattt 2760
catctttaag tgatctccgg gcagtagccc gatcccaccc agtcctagtt tcgggccccg 2820
gagacccatc tccttacgtg acacaagagg gtgaaatgac gctcaataaa ctctcacaac 2880
cagtgcagca cccttctgaa ttgattaagt ctgccaccgc aagcgggcct gacatgggag 2940
tggagaagga cactgtccgc gcattaatca cctcacgccc gatgcatcca agctcctcgg 3000
ctaagctcct gagcaagcta gatgcagcca agtcaattga agagatcagg aagatcaagc 3060
gccttgcgct gaatggttga tggccgtcac aactcatagc aggctcctgt cgcttcagca 3120
tcacacggaa tcccccggga gccccccctt gcgaatccat gcttcaacac cccagacaac 3180
agccctctct caccatcccc aatccctcgc atgatcgcac aactgcaacc aatctagcag 3240
cattagagat taagaaaaaa cacgggtaga atcaaagtgc ctcgattgaa ccaaaatgga 3300
ctcatccagg acaatcgggc tgtactttga ttctgccctt ccttccagta gcctattagc 3360
atttccgatt atcttacaag atacaggaga cgggaagaaa caaatcactc cacaatacag 3420
gatccagcat cttgattcgt ggacagacag taaggaagac tcggtattta tcaccaccta 3480
cgggttcatc tttcaagttg ggaatgaagg agccactgtc ggtgtgatca atgacaatcc 3540
caggcatgag ctactctctt ccgcaatgct ctgcttaggg agtgtcccga acaacggaga 3600
tcttgttgag ctggcgagag cctgcctcac tatggtggta acctgcaaga agagtgcaac 3660
taacactgag agaatagtct tctcagtagt gcaggcacct cgagtgctgc aaaattgtat 3720
ggttgtgtca aatcggtact catcagtgaa tgcagtgaag catgtgaagg cgcccgaaaa 3780
gatccctggg agcggaaccc tagagtataa agtgaatttt gtctccttga ctgtggtgcc 3840
gagaagggat gtctacagga tcccaactac agtattgaaa gtgtctggct cgagcctgta 3900
caatcttgcg ctcaatgtca ctattgatgt ggacgtggat ccgaagagcc cgttagtcaa 3960
atccctttct aagtccgata gcgggtacta tgcgaatctt tttctgcata tcggacttat 4020
gtccactgta gataagagag gaaagaaagt gacatttgac aagatagagg aaaagataag 4080
gagactcaat ctatctgttg ggctcagtga tgtgctcgga ccctctgtgc ttgtgaaggc 4140
gagaggtgca cggactaagc tacttgctcc tttcttctct agcagtggga cagcctgcta 4200
tcctatagca aatgcctctc cccaggttgc caagatactc tggagccaga ccgcgcacct 4260
gcggagcgtg aaagtcatca ttcaagccgg cactcagcgt gctgttgcag tgaccgccga 4320
tcatgaggta acctccacta agatagagaa gaagcatgcc attgctaaat acaatccttt 4380
cagaaaatag gttacatccc taagactgca gttcacctgc tttcccgaat catcatgaca 4440
ccagataatg atccatctcg actgcttgta gttagttcac ctgtccagca aattagaaaa 4500
aacacgggta gaagagtctg gaccccgacc ggcacactca ggacacagca tgggctccaa 4560
accttctacc aggatcccag cacctctaat gctaatcact cgaattatgc tgatattgaa 4620
ctgcatccgt ctgacaagtt ctcttgacgg caggcccctt gcagctgcag gaattgtaat 4680
aacaggagat aaggcagtca atgtatatac ctcgtctcag acagggtcaa tcatagtcaa 4740
gttgctcccg aatatgccca gagataagga ggcatgtgca agagccccat tggaggcata 4800
taacagaaca ctgactactc tgctcactcc tcttggcgac tccattcgca agatccaagg 4860
gtctgtatcc acgtccggag gaaggagaca aaaacgcttt ataggtgctg ttattggcag 4920
tgtagctctc ggggttgcaa cagcggcaca gataacagca gctgcggccc taatacaagc 4980
caaacagaat gctgccaaca tcctccggct taaggagagc attgctgcga ccaatgaagc 5040
tgtgcatgaa gtcaccgacg gattatcaca attatcagtg gcagttggga agatgcaaca 5100
gtttgtcaat gaccagttta ataacacggc gcgagaatta gactgcataa aaatcacaca 5160
acaggtcggt gtagaactca acctatacct aactgagcta actacagtat tcgggccaca 5220
gatcacctcc cctgcattaa ctcagctaac catccaggcg ctctataatt tagctggtgg 5280
caatatggac tacttattaa ctaagttagg tataggaaac aatcaactca gctcattaat 5340
tggtagcggc ctgatcactg gttaccctat actgtatgac tcacatactc aactcttggg 5400
catacaagtt aatctgccct cagtcgggaa cttaaataat atgcgtgcca cctatctgga 5460
gaccttatct gtaagtacaa ccaaaggata tgcctcagca ctggtcccga aagtagtgac 5520
acaagtcggt tctgtgatag aagagcttga cacctcatac tgtatagagt ccgatctgga 5580
tttatattgt actagaatag tgacattccc catgtctcca ggtatttatt cctgtttaag 5640
tggcaacaca tcagcctgca tgtattcaaa gactgaaggc gcactcacta cgccgtatat 5700
ggcccttagg ggctcagtta ttgctaattg taagataaca acatgcagat gtacagaccc 5760
tcctggcatc atatcgcaaa attatggaga agctgtatcc ctgatagata gacactcgtg 5820
caatgtctta tcattagacg gcataactct gaggctcagt ggggaatttg atgcaactta 5880
tcaaaagaac atctcaatat tagattctca ggtcatcgtg acaggcaatc ttgatatatc 5940
aactgaactt ggaaacgtca ataattcgat cagcaatgcc ttggacaagt tggcagaaag 6000
caacagcaaa ctagaaaaag tcaacgtcag actaactagc acatccgctc tcattaccta 6060
tattgttcta actgtcattt ccctaatttt cggtgcactt agtctggttt tagcgtgtta 6120
cctgatgtac aagcagaagg cacaacaaaa gaccctgtta tggcttggga acaataccct 6180
cgatcagatg agagccacca tgagagcatg aatgcaaata ggaagtggac ggacacccaa 6240
cggcagcccg tgtgtcaatt ccgataacct gtcaagtagg agacttaaga aaaaattact 6300
gggaacaagc aaccaaagag caatacacgg gtagaacggt cagaggagcc acccttcaat 6360
tgaaaattag gcttcacaac atccgttcta ccacaccacc aacaacaaga gtcaatcatg 6420
gaccgcgtgg ttaacagagt catgctggag aatgaagaaa gagaagcaaa gaacacatgg 6480
cgcttagttt tccggatcgc agtcttattt ttaatggtaa tgattctagc tatctctgcg 6540
gctgccctgg catacagcat ggaggccagt acgccacacg acctcgcagg catatcgact 6600
gtgatctcca agacagaaga taaggttacg tctttactca gttcaagcca agatgtgata 6660
gataagatat acaagcaggt agctcttgaa tccccgctgg cactattaaa caccgaatct 6720
gtaattatga atgcaataac ctctctttct tatcaaatta acggggctga gaacagtagc 6780
ggatgcggtg cgcccgttca tgacccagat tatatcgggg ggataggcaa agaactcata 6840
gtggacgaca ttagtaatgt cgcatcattt tatccttctg catatcaaga acacttgaat 6900
ttcatcccgg cacctactac aggatctggt tgcactcgga taccctcatt tgacatgggc 6960
accacccatt attgttatac tcacaatgtg atactatctg gttgcagaga tcactcacac 7020
tcacatcaat acctagcact tggtgtgctt cggacatctg caacagggag ggtattcttt 7080
tctactctgc gctccatcaa tttagatgac actcaaaatc ggaagtcttg cagtgtgagt 7140
gcaacccctt taggttgtga tatgctgtgc tctaaggtca cagggactga agaggaggat 7200
tacaagtcag ttgcccccac atcaatggtg cacggaaggc taggatttga cggtcaatac 7260
catgagaaag acttagacac cacggtctta tttaaggatt gggtggcaaa ttacccgggg 7320
gtgggaggag ggtcttttat tgacggccgt gtatggttcc cagtttacgg agggctcaaa 7380
cctaattcac ccagtgacat cgcacaagaa gggaaatatg taatatacaa gcgccataat 7440
aacacatgcc ccgataaaca agattaccaa attcggatgg ctaagtcctc atataaacct 7500
gggcgatttg gtggaaagcg cgtacagcaa gctatcctat ctatcaaagt gtcaacatcc 7560
ctgggtaagg acccggtgct gactattcca cctaatacaa tcacactcat gggagccgaa 7620
ggcagaatcc tcacagtagg gacatctcac ttcttgtatc aacgagggtc ttcatatttc 7680
tcccctgcct tattgtatcc catgacagta agtaacaaaa cggctacact ccatagtcct 7740
tacatgttta atgctttcac tcggccaggt agtgtccctt gccaggcatc agcaaggtgc 7800
cccaactcat gcatcactgg ggtctatacc gatccatatc ccttaatctt ctataggaat 7860
catactctac gaggggtctt cgggacgatg cttgatgatg aacaagcgag gcttaacccc 7920
gtatctgcag tatttgacaa catatctcgc agtcgtgtca cccgggtgag ttcaagcaac 7980
accaaggcag catacacgac atcgacatgt tttaaagttg tcaagactaa taaagtttat 8040
tgtcttagta tcgcagaaat atccaatacc ctattcgggg aatttaggat cgttcccttg 8100
ctagttgaga tcctcaaaga tgatagagtt taagaagcta gacttggccg attgagccaa 8160
tcataggatg gttgggagga cgacattgcg ccaatcatct cccataatgc ttagagtcaa 8220
gctgaacatt agcataaatc aggatcccgt gttgttgggc aaccgcaatc cgacaatgct 8280
gacatgattg ttctgagtct cgctcactgt cactttatta agaaaaaaca caagaagcat 8340
tgacatataa gggaaaataa ccaacaagag agaacacggg taggacatgg cgggctccgg 8400
tcctgagagg gcagagcacc agatcatcct accagagtca catttatcct ctccattggt 8460
caagcacaaa ttgttatact actggaaatt aaccgggcta ccgcttcctg atgaatgcga 8520
ctttgatcat ctcattatca gcaggcaatg gaagagaata ctggagtcag ccactcctga 8580
cacagagaga atgataaaac ttgggcgggc ggtgcaccag actctcaacc acaattccaa 8640
gatgactgga gtgctccatc ccaggtgttt agaagaactg gctagtattg aggtccctga 8700
ttcaactaac aaattccgga agattgaaaa gaagatccag attcacaaca caagatatgg 8760
agacctgttc acaaagctgt gcgtgcaagt tgagaagaaa ttgctagggt catctctgtc 8820
taataatgtc ccacgatcag aggaattcaa cagcatccgt acagatccgg cattctggtt 8880
tcactcaaaa tggtccagag ccaagttcgc gtggctccat ataaaacaag tccaaaggca 8940
tctgattgta gcagcaagga caaggtctgc agtcaacaag ttagtaacat taaatcataa 9000
gataggccat gtctttatta ctcctgagct tgtcattgtg acacacacag acgagaacaa 9060
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catggtcaat ataatatctt ctacagcagc acatctcagg aacctatccg agaaaattga 9180
tgatattctg cggttagtag atgctctggc aaaggactta ggtaatcaag tctatgatgt 9240
tgtagcatta atggagggat ttgcatacgg tgccgttcag ctgcttgagc catcaggtac 9300
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tctccccaat aatatagcgg aagcagtaac tcacgctatt gccactgtat tctctggatt 9420
agaacagaac caagcagctg agatgttgtg cttgctgcgt ttgtggggtc atccattgct 9480
tgagtctcgt agtgcagcaa gagcagtcag gagccagatg tgcgcaccaa agatggtaga 9540
ctttgatatg atcctccagg tattatcttt ctttaaagga acaatcatca atggatacag 9600
aaaaaagaac tcaggtgtgt ggccacgcgt caaagtagat acaatatatg gaaatatcat 9660
tgggcagcta catgctgatt cagcagagat ctcacatgat gtcatgttga gggagtacaa 9720
gagtttatcc gctcttgaat ttgagccatg tatagattat gaccctgtta ccaatctaag 9780
catgttccta aaagacaagg caatcgcaca tcctagtgat aactggctcg cctcatttag 9840
gcggaaccta ctctctgagg accagaagaa acagataaag gaggcaactt caactaaccg 9900
cctcctgata gagttcttag aatcaaatga ttttgatcca tataaagaaa tggaatacct 9960
gacaaccctc gagtacctaa gagatgacag tgtggcagta tcgtactcac tcaaagagaa 10020
agaggtgaaa gtgaatggac ggatttttgc taaattaaca aagaaactaa ggaattgcca 10080
ggtaatggca gaaggaattc tagctgacca gattgcacct ttcttccagg gaaatggggt 10140
cattcaagat agcatatcct tgacaaagag tatgttagca atgagtcaac tgtcctttaa 10200
cagcaataag aaacgtatcg ctgactgcaa agagagggtt tcctcaaacc gcaatcatga 10260
tcccaagagc aagaatcgta gaagagttgc cacctttatc acgactgacc tacaaaagta 10320
ttgtcttaac tggagatatc agacagtcaa actattcgcc catgccatca atcagctgat 10380
gggcctacct catttctttg agtggattca tcttaggctg atggacacta caatgtttgt 10440
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tgatgatata tatattgtca gtgctagagg gggcattgag ggactctgtc agaagctatg 10560
gacgatgatc tcaattgctg caatccaact tgccgcagca agatctcatt gtcgagttgc 10620
ctgcatggta caaggtgaca atcaagtaat agctgtaacg agagaggtga gatcagatga 10680
ttccccggat atggtattga cgcagttgca tcaggctagt gataatttct tcaaggaatt 10740
gattcatgtc aatcatctga ttggccataa cctgaaggat cgtgaaacca ttagatcaga 10800
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ctgttactat ttgaactacc taatgagttg cgtgcagaca tattttgatt cagagttttc 11040
tattactcac agctcacagt cagattccaa ccagtcctgg attgaggata tctctttcgt 11100
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agaagcagtg gggttgttga gtcccagcat catgactaac atcttaacca ggccacctgg 11280
caatggagat tgggccagcc tatgcaacga cccatactct tttaattttg agactgttgc 11340
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ccctttatta tccggggtac atacagagga caatgaggca gaagagaaag cattggctga 11460
attcttactc aatcaagaag tgattcaccc acgtgtcgca catgctatca tggaagcaag 11520
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attagtttct tctaatatgt gctcgctgac gctagcagat tatgctcgga acagaagctg 11760
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gcagtttact tggttccatc ttccaagcaa tatagagttg actgatgaca ccagcaaaaa 11940
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gtatgcagca ctcgaagtgc tcctcgactg tgcttatcaa ctctactatc tgagggtaag 12840
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actctccaat attgcagcca cgatatccca ccccctcatt cactcaaggt tgaatgcagt 12960
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tgcgaaattg ttagtctcct gcactcgacg cgtggtctca ggtttatatg cagggagtaa 13080
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aatttcccgg ttatgctgct tgtacacagt gctctttgct acaacaagag aaatcccaaa 13200
aataaggggc ctatcagcag aagagaaatg ctcaatactc actgagtatc tattgtcgga 13260
tgctgtaaaa ccgttgctta ggtccgaaca attgagttct atcatgtctc ccaacataat 13320
cacgttccca gccaatctat actacatgtc taggaagagc cttaatttga tcagagaacg 13380
agaggacaga gatactatct tgtcgttgtt gttccctcag gagtcactgc ttgagcttcg 13440
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caccaaacag atcttggaag tcacaatatt gggtctcaga gccaaagaca tcaataaaat 14760
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attctacatg aaaactatag gtaatgctgc caagggatat tacagtaata atgactctta 15000
aaggcaatcg tacaccaatc agttatcttc ttaactgatg actccctcat tgacttgatt 15060
ataccagatt agaaaaaagt taaattctga ctctttggaa ctcgtattcg gattcagtta 15120
gttaacttta agcaaaaatg cgcaaagtcg tctctaatca cagctatgtc attcaccaaa 15180
tctctgtttg gt 15192
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ggatggttgg gaggacgac 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gcaactgcgt caacaccat 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gttagcaatg agtcaactgt cc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
cttcttcggt gaacagcctt tg 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ctacagagtg tcgccttac 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
ggtaaagggc tggataggag a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
tctccaatgg ctatgcctgt a 21
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
tgggagtgga gaaggac 17
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
gttatctgtg ccgctgt 17
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gcgcaccaaa cagagatttg gtgaatgac 29
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gactccattc gcaaga 16
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
cattctccag cacgac 16
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
ccgataacct gtcaagtag 19
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gtcagcattg tcggatt 17
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
gaacaagccg caaggg 16
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
catctgcaga cagtcccact ggtctcaagt at 32
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
catacttgag accagtggga ctgtc 25
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
caggagcctg ctatgagt 18
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
accaaacaga gaatccgtga ggta 24
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
tcagtacccc cagtcag 17
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
gtaaaacgac ggccagt 17
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
caggaaacag ctatgac 17
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
gcaacgtgct ggttattgtg 20
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
ggacagttga ctcattgcta acata 25
<210> 26
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
actcactata gggcgaattc ggatccggat ggttgggagg acgacattg 49
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
tatgttagca atgagtcaac tgtcc 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
gtgaatgtaa ggcgacactc tgtag 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
ctacagagtg tcgccttaca ttcac 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
cgaatatcag gtaacactcc atatc 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
gatatggagt gttacctgat attcg 25
<210> 32
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
taagatctgg taccgagctc ctgcaggcgc accaaacaga gatttggt 48
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
atatgaattc gccaccatgg ctacctttac agatgcggag 40
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
tatactcgag tcaaccattc agcgcaagg 29
<210> 35
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 35
accggaattc gccaccatgt cgtctgtttt tgacgaatac gagc 44
<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 36
atatctcgag tcagtacccc cagtcagtgt cg 32
<210> 37
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 37
attgcatcaa cgcatatagc gctagcgcga tgtaccgcgg atcgttacca aacagagaat 60
ccgtgaggta c 71
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 38
catctggttg cccttgcggc ttgttc 26
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 39
gaacaagccg caagggcaac cagatg 26
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 40
gacagtccca ctggtctcaa gtatg 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 41
catacttgag accagtggga ctgtc 25
<210> 42
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 42
tgtttgacag cttatcatcg ataagcttcc tccatcatag acatcatcgc ct 52
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 43
attgcatcaa cgcatatagc gctagcaggc gatgatgtct atgatggagg 50
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 44
gacagtgtcc ttctccactc ccatg 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 45
catgggagtg gagaaggaca ctgtc 25
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 46
gacccttgga tcttgcgaat ggagtc 26
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 47
gactccattc gcaagatcca agggtc 26
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 48
gtctcctact tgacaggtta tcgg 24
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 49
ccgataacct gtcaagtagg agac 24
<210> 50
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 50
tgtttgacag cttatcatcg ataagcttgt gcgatgtcac tgggtgaatt agg 53
<210> 51
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 51
attgcatcaa cgcatatagc gctagcccta attcacccag tgacatcgca c 51
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 52
cgcaatgtcg tcctcccaac catcc 25
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 53
ggatggttgg gaggacgaca ttgcg 25
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 54
gtgaatgtaa ggcgacactc tgtag 25
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 55
ctacagagtg tcgccttaca ttcac 25
<210> 56
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 56
ttgacagctt atcatcgata agcttgcgat gagcggccgc tccattaata cgactcacta 60
taggaccaaa cagagatttg gtgaatgac 89
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 57
atcggtagaa ggttccctca ggttc 25
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 58
ggtcctatag tgagtcgtat taatg 25
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 59
gaaattgcat caacgcatat agcgc 25
<210> 60
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 60
catctggttg cccttgcggc ttgttc 26
<210> 61
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 61
actcactata gggcgaattc ggatccgcca tgaacacgat taacatcgc 49
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 62
gaagtccgac tctaagatgt cacg 24
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 63
ccttgcagct gcaggaattg 20
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 64
gctctataca gtatgaggtg tcaag 25
<210> 65
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 65
taagatctgg taccgagctc ctgcagttac gcgaacgcga agtccgactc 50
<210> 66
<211> 4306
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 66
gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat 60
ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt gtatcaccat 120
ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct 180
cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga 240
atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt 300
tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt 360
ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt 420
cttattggta gaaacaacta catcctggtc atcatcctgc ctttctcttt atggttacaa 480
tgatatacac tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg cccctctgct 540
aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg 600
ctgtctcatc attttggcaa agaattgtaa tacgactcac tatagggcga attcggatcc 660
aagcttctcg aggcggccgc cccgggctgc aggagctcgg taccagatct tattaaagca 720
gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 780
aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 840
ttatcatgtc tggtcgactc tagactcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 900
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 960
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1020
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1080
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1140
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1200
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1260
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1320
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1380
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1440
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1500
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 1560
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 1620
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 1680
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 1740
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 1800
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 1860
atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 1920
tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 1980
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 2040
catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 2100
gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 2160
ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 2220
aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 2280
atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 2340
cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 2400
gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 2460
agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 2520
gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 2580
caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 2640
ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 2700
tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 2760
aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat 2820
catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg 2880
tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 2940
agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg 3000
gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg 3060
tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggaaattgt aagcgttaat 3120
attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc 3180
gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt 3240
ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa 3300
accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg 3360
tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga 3420
cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct 3480
agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat 3540
gcgccgctac agggcgcgtc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat 3600
cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tagagtccgt tacataactt acggtaaatg 3660
gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 3720
ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 3780
ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 3840
atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 3900
cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 3960
acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 4020
acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 4080
actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 4140
gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc 4200
atagaagaca ccgggaccga tccagcctcc gcggccggga acggtgcatt ggaacggacc 4260
cctaggcttt tgcaaaaagc tccggatcga tcctgagaac ttcagg 4306