具体实施方式

本发明设计了一种表达鸽源新城疫病毒F和HN基因重组弱毒疫苗rLa-VI-QH17的构建方法，在建立基因II型新城疫病毒LaSota株的反向遗传操作平台基础上，将中国主要流行的鸽源新城疫病毒基因VI.2.1.2.2亚型分离株QH1344/2017的囊膜糖蛋白F蛋白基因和HN蛋白基因片段与LaSota株基因组的对应部分基因进行替换，同时将F蛋白的强毒裂解位点(112R-R-Q-K-R-F117)突变为弱毒株LaSota的F蛋白裂解位点(112G-R-Q-G-R-L117)，并将HN蛋白的长度从571aa延长至577aa，构建出致弱的表达鸽源新城疫病毒基因VI.2.1.2.2亚型F和HN基因的全长cDNA克隆质粒pOK-rLa-VI-QH17，与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后拯救出重组鸽源新城疫病毒弱毒疫苗株rLa-VI-QH17。

本发明还提供了一种所述的鸽源新城疫病毒重组弱毒疫苗株rLa-VI-QH17的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建基因II型新城疫病毒LaSota株基因组全长cDNA质粒pOK-rLaSota；

(2)构建重组质粒pOK-rLa-VI-QH17，在pOK-rLaSota基础上，用Bgl II和Hind III限制性内切酶切割B片段与C片段，结合同源重组的方法，将鸽源新城疫病毒QH1344/2017株的F基因和HN基因片段与LaSota株基因组的对应部分基因进行替换，同时将F蛋白的强毒裂解位点(112R-R-Q-K-R-F117)突变为弱毒株LaSota的F蛋白裂解位点(112G-R-Q-G-R-L117)，并将HN蛋白的长度从571aa延长至577aa，获得重组质粒pOK-rLa-VI-QH17；

(3)重组致弱毒株rLa-VI-QH17的拯救，将全长质粒pOK-rLa-VI-QH17与表达NDVLaSota毒株NP、P和L基因的pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒共转染表达T7聚合酶的BSR-T7/5细胞，转染6h后添加TPCK胰酶，孵育72h，将转染样品反复冻融后接种9～11日龄SPF鸡胚，即获得表达基因VI型F和HN蛋白的重组新城疫病毒弱毒疫苗株rLa-VI-QH17。

上述方法中，步骤(1)的pOK-rLaSota通过以下方法构建得到：根据LaSota株的全长cDNA序列特点，将全长基因组分为a、b、c、d、e共5个片段。根据克隆需要设计引物对部分片段进行相应的突变修饰，以保证克隆所使用的酶切位点的单一性，突变的碱基序列可以作为拯救病毒的分子标签，并在a片段的5’上游引入T7启动子序列，在T7启动子的后面引入三个连续的G碱基来加强其转录活性，在e片段的3’端引入丁肝核酶(HdvRz)序列和T7终止子序列。随后将各个片段依次克隆到pOK12载体中，构建完成基因组全长质粒命名为pOK-rLaSota。

本发明的再一个目的是提供所述的鸽源新城疫病毒重组疫苗株rLa-VI-QH17的应用。

含有上述表达鸽源新城疫病毒F和延长的HN蛋白基因重组弱毒疫苗株rLa-VI-QH17的生物制品属于本发明的保护范围。

对重组疫苗株rLa-VI-QH17遗传稳定性进行分析，结果表明rLa-VI-QH17株在9～11日龄SPF鸡胚中连续传代至第15代，其第1代(F1)、第5代(F5)和第10代(F10)和第15代(F15)病毒经序列测定均含有鸽源新城疫病毒的F(突变裂解位点)和HN序列，并含有构建时引入的分子标签，病毒遗传稳定性好。

本发明设计的鸽源新城疫病毒重组疫苗株rLa-VI-QH17，是将鸽源新城疫病毒F蛋白的强毒裂解位点112R-R-Q-K-R-F117突变为弱毒株LaSota的F蛋白裂解位点112G-R-Q-G-R-L117，并将HN蛋白的长度从571aa延长至577aa，该突变后序列能够使其毒力降低，毒株的安全性更好。

本发明设计的鸽源新城疫病毒重组疫苗株rLa-VI-QH17使用鸡新城疫基因II型经典疫苗株LaSota株的NP、P、M和L基因作为骨架，其保留了LaSota毒株高繁殖滴度的特性，该重组疫苗株在鸡胚上表现出了优异的生长特性。

所述的疫苗为灭活疫苗，是通过甲醛对弱毒株进行灭活。

免疫保护实验结果表明，重组疫苗株rLa-VI-QH17制备的灭活疫苗对鸽只安全且无副反应；免疫4周龄雏鸽5周后可诱导高水平的保护性抗体。免疫5周后用鸽新城疫病毒QH1344/2017强毒株进行攻毒，免疫rLa-VI-QH17鸽只未出现任何发病症状或者死亡，免疫保护率达到100％。免疫攻毒后第3、5、7、10天，免疫rLa-VI-QH17组鸽只的口咽及泄殖腔拭子均未检测出排毒，而免疫LaSota组与攻毒对照组则出现不同程度的发病率、死亡率以及拭子病毒排毒检出率。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例中所记载的具体实验方法，若未特别指明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。

实施例1：LaSota株的拯救

1、病毒纯化

病毒的纯化是为了获得单一的病毒克隆，采用有限稀释法对LaSota株进行了纯化，详细步骤如下：对病毒液进行10倍倍比稀释，稀释后分别取各滴度病毒液接种9～11日龄SPF鸡胚(100μL/枚)，每个稀释度接种5枚。4d后收获鸡胚尿囊液测定HA活性。选取具有HA活性的最高稀释倍数的尿囊液作为下一代纯化的病毒液。用同样的方法进行倍比稀释和鸡胚接种，对病毒连续纯化5代，分装保存第5代病毒液，将其作为原始种毒用于下一步试验。

2、病毒序列测定

以纯化后的病毒反转录基因组cDNA为模板，利用设计的扩增LaSota株全长序列的13对引物(表1)，对LaSota基因组进行PCR扩增，同时使用3′-RACE和5′-RACE试剂盒测定了病毒基因组两个末端序列。通过DNA Star生物学软件对所测得的序列进行拼接。结果表明，NDV LaSota株基因组全长为15186bp。

表1：LaSota株NDV全基因组测序用引物表

3、LaSota全长cDNA克隆质粒的构建

根据LaSota基因组的序列特点，通过酶切位点的筛选，将全长基因组分为5个片段(片段a-e)。设计引物扩增这5个片段(表2)，并对P基因、M基因和L基因上的三个酶切位点进行突变，以保证Bgl II和Hind III酶切位点的单一性，突变的碱基序列可以作为拯救病毒的分子标签。在a片段的5’上游引入T7启动子序列，在T7启动子的后面引入三个连续的G碱基来加强其转录活性，在e片段的3’端引入丁肝核酶(HdvRz)序列和T7终止子序列。随后将各个片段依次连接到pOK12克隆载体中，构建策略如图1。在完成全长基因组克隆后进行序列测定，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5；将构建完成且测序正确的病毒基因组质粒命名为pOK-rLaSota。

表2：LaSota毒株基因组全长cDNA克隆构建所用引物表

4、辅助质粒的构建

根据测定的LaSota株基因组序列，设计引物分别扩增其编码核衣壳蛋白NP、磷蛋白P和聚合酶蛋白L的开放阅读框(表3)，并将3个ORF分别克隆至真核表达载体pCI-neo的CMA启动子下游，构建3个辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L，经测序验证无基因突变产生。

表3：LaSota辅助质粒构建所用引物表

5、病毒的拯救

将已构建好的全长质粒(pOK-rLaSota)和3个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P和pCI-L)共同转染BSR-T7/5细胞。转染6h后，更换成含2％血清、1％抗生素、5μg/mL的TPCK-Trypsin的DMEM培养基。转染72h后收获培养液及细胞，接种9～11日龄SPF鸡胚(200μL/枚)，37℃孵育，3～4d后收获鸡胚尿囊液，并进行血凝(HA)试验。结果显示为HA阳性，初步表明病毒拯救成功。

6、拯救病毒rLaSota的鉴定及生物学特性分析

提取HA阳性的病毒液RNA，对拯救病毒进行全基因组序列测定。序列比对结果显示拯救病毒基因组中含有构建时引入的分子标签(突变的酶切位点，图2)，表明LaSota株基因组cDNA克隆成功拯救，将拯救的病毒命名为rLaSota。将其继续在9～11日龄SPF鸡胚中连续传至5代。检测每代的血凝效价其可达2¹⁰～2¹¹之间。对F5代病毒液进行序列测定，结果显示，分子标签未发生回复突变，表明拯救的rLaSota具有较好的稳定性。测定拯救病毒与亲本毒的鸡胚半数感染量(EID₅₀)、鸡胚平均致死时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)，表4显示了拯救病毒与亲本病毒具有相同的生物学特性和致病性。

表4：拯救病毒与亲本毒株的生物学特性表

综上所述，本发明的新城疫病毒LaSota株的反向遗传操作平台构建成功，其可作为良好的疫苗载体使用。

实施例2重组鸽用疫苗候选种毒的拯救

1、病毒的筛选及纯化

选取实验室分离保存的当前中国鸽群主要流行的基因VI.2.1.2.2亚型鸽源新城疫病毒进行繁殖复壮，进而采用有限稀释法对5株毒株进行纯化，各毒株不同代次的血凝效价见表5。最终选取纯化5代后的QH1344/2017毒株，作为原始种毒用于全长cDNA克隆的构建。

表5：鸽源新城疫病毒不同毒株各代次血凝效价表

2、QH1344/2017株全长基因组序列的测定和分析

以纯化后的QH1344/2017病毒反转录基因组cDNA为模板，利用设计的扩增VI型NDV全长序列的13对引物(表6)，对QH1344/2017基因组进行PCR扩增，同时使用3’RACE和5’RACE试剂盒测定了病毒基因组两个末端序列。通过DNA Star生物学软件对所测得的序列进行拼接。结果表明，QH1344/2017株基因组全长为15192bp。

表6：VI型NDV全基因组测序用引物表

3、疫苗候选株基因组全长cDNA构建

以pOK-LaSota全长质粒为平台，设计合成该全长序列中从Bgl II酶切位点到HindIII酶切位点中间的新基因序列QH17-571HN-bc，共6539bp，其包含将鸽源新城疫病毒QH1344/2017株的囊膜糖蛋白F蛋白基因和HN蛋白基因片段与LaSota株基因组的对应部分基因进行替换，同时将F蛋白(SEQ ID NO:1)的强毒裂解位点(112R-R-Q-K-R-F117)突变为弱毒株LaSota的F蛋白裂解位(112G-R-Q-G-R-L117)，其他序列保持不变，设计重组病毒rLa-VI-571-QH17株。

在上述突变基础上，并同时设计合成包含将HN蛋白的长度从571aa(SEQ ID NO:2)延长至577aa(SEQ ID NO:3)的另一个新基因序列QH17-577HN-bc(SEQ ID NO:4)，共6539bp，设计重组病毒rLa-VI-QH17株。

使用Bgl II和Hind III两个限制性内切酶对pOK-rLaSota全长质粒进行双酶切，剪切掉原来的b、c两个片段。设计引物扩增合成的目的基因QH17-571HN-bc和QH17-577HN-bc片段(表7)，将胶回收的目的片段QH17-571HN-bc和QH17-577HN-bc片段分别与酶切后的载体进行连接，构建策略如图3。在完成全长基因组克隆后进行序列测定，将构建完成且测序正确的病毒基因组质粒分别命名为pOK-rLa-VI-571-QH17和pOK-rLa-VI-QH17。

表7:用于扩增QH17-571HN-bc和QH17-577HN-bc片段的引物表

4、疫苗候选株的拯救

将已构建好的两个全长重组质粒(pOK-rLa-VI-571-QH17和pOK-rLa-VI-QH17)分别和LaSota病毒的3个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P和pCI-L)共同转染BSR-T7/5细胞。转染6h后，更换成含2％血清、1％抗生素、5μg/mL的TPCK-Trypsin的DMEM培养基。转染后72h收获培养液及细胞，接种9～11日龄SPF鸡胚(200μL/枚)，37℃孵育，3～4d后收获鸡胚尿囊液，并进行血凝(HA)试验。结果都显示为HA阳性，初步表明病毒拯救成功。

5、疫苗候选株的序列鉴定和遗传稳定性

选取HA阳性的病毒液提取RNA并进行反转录后，进行全基因组序列测定。序列比对结果显示拯救病毒rLa-VI-571-QH17基因组为以LaSota株为骨架，嵌合QH1344/2017株的F和HN基因，并且F基因裂解位点已突变；拯救病毒rLa-VI-QH17基因组为以LaSota株为骨架，嵌合QH1344/2017株的F和HN基因，并且F基因裂解位点已突变，HN蛋白的长度从571aa延长至577aa，表明两株病毒均获得成功拯救。

将拯救病毒继续在9～11日龄SPF鸡胚中连续传代15次。每代病毒的血凝效价均在2¹⁰～2¹¹之间。选取第1代、第5代、第10代和第15代重组病毒的F和HN基因进行序列测定。测序结果表明，第1代、第5代、第10代和第15代重组病毒的F和HN基因均与插入的序列一致，F蛋白裂解位点也未发生回复突变(图4)，表明两株重组病毒传代过程中遗传稳定。

6、疫苗候选株的生物学特性

选取第15代rLa-VI-QH17和rLa-VI-571-QH17疫苗候选株测定其EID₅₀、MDT和ICPI，并以病毒Lasota株和QH1344/2017株作为对照，比较病毒的毒力变化情况。表8的试验数据表明，本发明拯救的rLa-VI-QH17和rLa-VI-571-QH17疫苗候选株毒力都明显降低，具有HN蛋白长度延长的rLa-VI-QH17疫苗候选株相较于rLa-VI-571-QH17疫苗候选株在鸡胚中具有更高生长滴度以及对1日龄雏鸡有更低致病力的生物学特性。因此，本发明构建的rLa-VI-QH17疫苗候选株可作为优选疫苗株用于疫苗生产。

表8：拯救病毒与亲本毒株的生物学特性表

实施例3 rLa-VI-QH17疫苗株对非免疫鸽安全性试验和免疫效果试验

1、灭活疫苗的制备

rLa-VI-QH17疫苗株用灭菌生理盐水稀释10 000倍，接种9～11日龄SPF鸡胚，每胚接0.1mL，置37℃继续孵育。将接种后24h内死胚弃去，24h～120h死胚及时放4℃，收混合样，测定制苗毒的HA为2^10.5，病毒滴度为10^9.48EID₅₀/0.1mL。将测定好效价的新城疫病毒液导入灭活罐内，加入终浓度为0.1％的甲醛溶液使其充分混合，4℃灭活48h，期间每隔2h摇晃一次。灭活后的病毒原液按常规方法制备油佐剂灭活疫苗。按同样的方法同时制备相同剂量的LaSota灭活疫苗。

2、灭活疫苗的安全性试验

为测定本发明实施例2拯救的rLa-VI-QH17疫苗株对非免疫鸽的安全性，将制备的rLa-VI-QH17灭活疫苗免疫4周龄非免疫鸽10只，每只肌肉注射疫苗0.2mL，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸽采食、饮水及临床情况。结果显示，鸽只免疫后疫苗吸收效果良好，免疫鸽没有出现任何局部和全身的不良反应，鸽的状态完全正常。

3、灭活疫苗的抗体监测

为测定本发明实施例2拯救的rLa-VI-QH17疫苗株在非免疫鸽体内产生的抗体消长规律，将饲养于隔离器内的非免疫鸽随机分成两组，每组5只，一组为实施例3步骤1所制备的rLa-VI-QH17灭活疫苗免疫组，一组为实施例3步骤1所制备的LaSota灭活疫苗免疫组。每只鸽子肌肉注射疫苗0.2mL，分别于免疫后第1、3、5、7、9、11、13周对鸽子进行翅静脉采血分离血清，测定抗体。结果显示，两组免疫组在免疫后至13周监测期结束均可产生一定效价的抗体，rLa-VI-QH17灭活疫苗免疫组的抗体效价明显高于LaSota灭活疫苗免疫组，并且差异显著(图5)。rLa-VI-QH17灭活疫苗免疫组在免疫后第9周免疫鸽的抗体水平达到最高，HI抗体滴度平均值为8.5log₂，且其在免疫后第3周至13周均产生较高的抗体水平，说明其免疫抗体保护期至少可达3个多月。

4、灭活疫苗的免疫保护性试验

为测定本发明实施例2拯救的rLa-VI-QH17疫苗株对非免疫鸽的免疫保护效果，将饲养于隔离器内的非免疫鸽随机分成三组，每组10只，一组为实施例3步骤1所制备的rLa-VI-QH17灭活疫苗免疫组，一组为实施例3步骤1所制备的LaSota灭活疫苗免疫组，一组为对照组。免疫组每只鸽子肌肉注射疫苗0.2mL，对照组注射相同剂量的PBS。分别于免疫后28天、35天翅静脉采血分离血清，测定抗体。35天采血后，用临床分离的基因VI型野毒株强毒QH1344/2017株攻毒，每只鸽以10⁶EID₅₀剂量经肌肉注射途径进行攻毒，隔离器饲养，观察14天，每天记录鸽的发病和死亡情况，攻毒后第3、5、7、10天，采集鸽子的口咽拭子和泄殖腔拭子接种鸡胚进行病毒分离，检测排毒情况。

结果显示，免疫组免疫28天后均可产生一定效价的抗体，免疫35天后，抗体效价明显的提高，rLa-VI-QH17灭活疫苗免疫组的抗体效价明显高于LaSota灭活疫苗免疫组，并且差异显著(图6)。

免疫35天攻毒后，rLa-VI-QH17灭活疫苗免疫组所有鸽子未出现任何发病或死亡，免疫保护率达到100％；LaSota灭活疫苗免疫组有两只鸽子表现出歪脖、垂翅等新城疫感染症状，未有鸽子死亡；PBS组所有鸽子均发病，有一只鸽子死亡(表9)。

表9：疫苗株的攻毒保护性试验结果表

排毒情况显示，免疫rLa-VI-QH17灭活疫苗组的鸽子在攻毒后第3、5、7、10天均未出现排毒现象，而免疫LaSota灭活疫苗组的鸽子仍有部分排毒现象，空白攻毒对照组排毒率为100％(表10)。

表10：攻毒后各组试验鸽排毒检测结果表

综上所述，本发明所制备的灭活的鸽源新城疫病毒重组疫苗株rLa-VI-QH17，对免疫鸽只具有良好的安全性和保护效果，具有广阔的应用前景。

上述内容仅为本发明创造的优选实施例，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是未脱离本发明技术方案的内容，依本发明创造权利要求及发明创造说明内容对以上实施例所做出的简单变化、等效变化与修饰，均仍属于本发明技术方案涵盖的范围。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种鸽源新城疫病毒重组疫苗株及其构建方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 553

<212> PRT

<213> 鸽I型副黏病毒(Pigeon paramyxovirus 1)

<400> 1

Met Asp Ser Lys Pro His Ile Arg Ile Pro Ala Ser Pro Thr Leu Ile

1 5 10 15

Thr Arg Ile Thr Leu Val Leu Ser Tyr Ile Cys Ser Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys

35 40 45

Ala Ile Asn Ile Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys

50 55 60

Leu Leu Pro Asn Met Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro

65 70 75 80

Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly

85 90 95

Asp Ser Ile Arg Arg Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly Arg

100 105 110

Arg Gln Lys Arg Phe Ile Gly Ala Ile Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly

115 120 125

Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala

130 135 140

Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala

145 150 155 160

Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala

165 170 175

Val Ala Ile Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Asn

180 185 190

Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Ser Gln Gln Val Gly Ile

195 200 205

Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln

210 215 220

Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn

225 230 235 240

Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ile Gly

245 250 255

Asn Asn His Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Asn

260 265 270

Pro Ile Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Asn

275 280 285

Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu

290 295 300

Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Phe Ala Ser Ala Leu Val Pro

305 310 315 320

Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser

325 330 335

Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr

340 345 350

Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser

355 360 365

Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Tyr Met

370 375 380

Ala Leu Lys Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr Thr Cys Arg

385 390 395 400

Cys Ala Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val

405 410 415

Ser Leu Ile Asp Arg His Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile

420 425 430

Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile

435 440 445

Ser Ile Leu Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser

450 455 460

Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Arg

465 470 475 480

Leu Ala Glu Ser Asn Ser Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr

485 490 495

Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Ile Leu Thr Ile Ile Ser Leu

500 505 510

Val Phe Gly Ala Leu Ser Leu Val Leu Ala Cys Tyr Leu Met Tyr Lys

515 520 525

Gln Arg Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu

530 535 540

Asp Gln Met Arg Ala Thr Thr Arg Thr

545 550

<210> 2

<211> 571

<212> PRT

<213> 鸽I型副黏病毒(Pigeon paramyxovirus 1)

<400> 2

Met Asp His Ala Val Ser Arg Val Ala Leu Glu Asn Glu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Ala Lys Ser Thr Trp Arg Leu Val Phe Arg Ile Ala Val Leu Leu Leu

20 25 30

Thr Val Val Thr Leu Ala Ile Ser Val Ala Ala Leu Val Tyr Ser Met

35 40 45

Gly Ala Ser Thr Pro Arg Asp Leu Val Gly Val Ser Thr Met Val Ser

50 55 60

Lys Val Glu Asp Lys Ile Thr Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gln Asp Val

65 70 75 80

Val Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu

85 90 95

Leu Asn Thr Glu Ser Ile Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser His

100 105 110

Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Arg Cys Gly Ala Pro Ile His

115 120 125

Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp

130 135 140

Ile Ser Gly Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Tyr Gln Glu His Leu

145 150 155 160

Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro

165 170 175

Ser Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile

180 185 190

Leu Ser Gly Cys Ile Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Leu Ala Leu

195 200 205

Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu

210 215 220

Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Asn Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val

225 230 235 240

Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Ile Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu

245 250 255

Ala Glu Glu Glu Asp Tyr Lys Ser Val Ala Pro Thr Ser Met Val His

260 265 270

Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Thr

275 280 285

Thr Val Leu Phe Lys Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Ser

290 295 300

Gly Ser Phe Ile Asp Asp Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu

305 310 315 320

Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ala Gln Glu Gly Lys Tyr Ile Ile

325 330 335

Tyr Lys Arg Tyr Asn Asn Thr Cys Pro Asp Gly Gln Glu Tyr Gln Ile

340 345 350

Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Ser Gly Lys Arg

355 360 365

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370 375 380

Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Asn Thr Ile Thr Leu Met Gly Ala

385 390 395 400

Glu Gly Arg Val Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg

405 410 415

Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val His

420 425 430

Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Asn Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr

435 440 445

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450 455 460

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Val Tyr Cys Leu Ser

530 535 540

Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro

545 550 555 560

Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Asp Glu Arg Ala

565 570

<210> 3

<211> 577

<212> PRT

<213> 鸽I型副黏病毒(Pigeon paramyxovirus 1)

<400> 3

Met Asp His Ala Val Ser Arg Val Ala Leu Glu Asn Glu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Ala Lys Ser Thr Trp Arg Leu Val Phe Arg Ile Ala Val Leu Leu Leu

20 25 30

Thr Val Val Thr Leu Ala Ile Ser Val Ala Ala Leu Val Tyr Ser Met

35 40 45

Gly Ala Ser Thr Pro Arg Asp Leu Val Gly Val Ser Thr Met Val Ser

50 55 60

Lys Val Glu Asp Lys Ile Thr Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gln Asp Val

65 70 75 80

Val Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu

85 90 95

Leu Asn Thr Glu Ser Ile Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser His

100 105 110

Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Arg Cys Gly Ala Pro Ile His

115 120 125

Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp

130 135 140

Ile Ser Gly Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Tyr Gln Glu His Leu

145 150 155 160

Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro

165 170 175

Ser Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile

180 185 190

Leu Ser Gly Cys Ile Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Leu Ala Leu

195 200 205

Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu

210 215 220

Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Asn Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val

225 230 235 240

Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Ile Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu

245 250 255

Ala Glu Glu Glu Asp Tyr Lys Ser Val Ala Pro Thr Ser Met Val His

260 265 270

Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Thr

275 280 285

Thr Val Leu Phe Lys Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Ser

290 295 300

Gly Ser Phe Ile Asp Asp Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu

305 310 315 320

Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ala Gln Glu Gly Lys Tyr Ile Ile

325 330 335

Tyr Lys Arg Tyr Asn Asn Thr Cys Pro Asp Gly Gln Glu Tyr Gln Ile

340 345 350

Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Ser Gly Lys Arg

355 360 365

Val Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu

370 375 380

Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Asn Thr Ile Thr Leu Met Gly Ala

385 390 395 400

Glu Gly Arg Val Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg

405 410 415

Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val His

420 425 430

Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Asn Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr

435 440 445

Arg Pro Gly Ser Val Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Pro

450 455 460

Cys Ile Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Val Phe Tyr Arg

465 470 475 480

Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Asp Glu Gln

485 490 495

Thr Arg Leu Asn Pro Val Ser Ala Val Phe Asp Asn Ile Ser Arg Ser

500 505 510

Arg Val Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr

515 520 525

Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Val Tyr Cys Leu Ser

530 535 540

Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro

545 550 555 560

Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Asp Glu Arg Ala Arg Glu Ala Arg Ser

565 570 575

Gly

<210> 4

<211> 6539

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agatcttgtc ttgaaacaga catcctccat ccctatgatg cggaccgaaa tccaacagct 60

gaaaacatct gttgcagtca tggaagccaa cttgggaatg atgaagattc tggatcccgg 120

ttgtgccaac atttcatctc tgagtgatct acgggcagtt gcccgatctc acccggtttt 180

agtttcaggc cctggagacc cctctcccta tgtgacacaa ggaggcgaaa tggcacttaa 240

taaactttcg caaccagtgc cacatccatc tgaattgatt aaacccgcca ctgcatgcgg 300

gcctgatata ggagtggaaa aggacactgt ccgtgcattg atcatgtcac gcccaatgca 360

cccgagttct tcagccaagc tcctaagcaa gttagatgca gccgggtcga tcgaggaaat 420

caggaaaatc aagcgccttg ctctaaatgg ttaattacta ctgccacacg tagcgggtcc 480

ctgtccactc ggcatcacac ggaatctgca ccgagttccc ccccgcagac ccaaggtcca 540

actctccaag cggcaatcct ctctcgcttc ctcagcccca ctgaatgatc gcgtaaccgt 600

aattaatcta gctacattta agattaagaa aaaatacggg tagaattgga gtgccccaat 660

tgtgccaaga tggactcatc taggacaatt gggctgtact ttgattctgc ccattcttct 720

agcaacctgt tagcatttcc gatcgtccta caagacacag gagatgggaa gaagcaaatc 780

gccccgcaat ataggatcca gcgccttgac ttgtggactg atagtaagga ggactcagta 840

ttcatcacca cctatggatt catctttcaa gctgggaatg aagaagccac tgtcggcatg 900

atcgatgata aacccaagcg cgagttactt tccgctgcga tgctctgcct aggaagcgtc 960

ccaaataccg gagaccttat tgagctggca agggcctgtc tcactatgat agtcacatgc 1020

aagaagagtg caactaatac tgagagaatg gttttctcag tagtgcaggc accccaagtg 1080

ctgcaaagct gtagggttgt ggcaaacaaa tactcatcag tgaatgcagt caagcacgtg 1140

aaagcgccag agaagattcc cgggagtgga accctagaat acaaggtgaa ctttgtctcc 1200

ttgactgtgg taccgaagaa ggatgtctac aagatcccag ctgcagtatt gaaggtttct 1260

ggctcgagtc tgtacaatct tgcgctcaat gtcactatta atgtggaggt agacccgagg 1320

agtcctttgg ttaaatctct gtctaagtct gacagcggat actatgctaa cctcttcttg 1380

catattggac ttatgaccac cgtagatagg aaggggaaga aagtgacatt tgacaagctg 1440

gaaaagaaaa taaggagcct tgatctatct gtcgggctca gtgatgtgct cgggccttcc 1500

gtgttggtaa aagcaagagg tgcacggact aagctcttgg cacctttctt ctctagcagt 1560

gggacagcct gctatcccat agcaaatgct tctcctcagg tggccaagat actctggagt 1620

caaaccgcgt gcctgcggag cgttaaaatc attatccaag caggtaccca acgcgctatc 1680

gcagtgaccg ccgaccacga ggttacctct actaagctgg agaaggggca cacccttgcc 1740

aaatacaatc cttttaagaa ataagctgcg tctctgagat tgcgctccgc ccactcaccc 1800

agatcatcat gacacaaaaa actaatctgt cttgattatt tacagttagt ttacctgtct 1860

atcaagttag aaaaaacacg ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc ctccaggtgc 1920

aagatggact ccaaacccca catcaggatc ccggcatctc cgacgctgat cactcgaatc 1980

actctggtac tgagctacat ctgctcgacg agctctcttg atggcaggcc acttgcagct 2040

gcggggattg tggtaacagg agataaagca atcaatatat acacctcatc ccagacaggg 2100

tcaatcatag tcaagttgct cccgaatatg cccaaggaca aagaggcatg tgcgaaagcc 2160

ccactagagg catacaacag aacactgacc actttactca cccccctcgg tgattccatc 2220

cgcaggatac aaggatctgt gtccacatca ggaggaggga gacaggggcg ccttataggt 2280

gccattatag gcagtgtagc tcttggggtt gcgacatcgg cacagataac agcagctgcg 2340

gccctaatac aagctaacca gaatgccgcc aacatcctcc ggcttaagga gagcatcgct 2400

gcgaccaatg aagctgtgca tgaggtcact gacggattat cgcaactagc agtggcaatt 2460

gggaagatgc aacagtttgt aaacgaccaa tttaataata cagcgcggga attggactgt 2520

ataaaaattt cacaacaagt cggtatagaa ctcaacttat acctaactga actgactaca 2580

gtgttcgggc cacaaatcac ttcccctgcc ctaactcagc tgaccatcca agcgctttat 2640

aatttagctg gcggtaatat ggattaccta ttgactaaat taggtatagg gaacaatcat 2700

ctcagctcat taataggcag tggcttgatc acaggcaacc ctatactgta tgactcacag 2760

actcaactct tgggcatcca ggtaaattta ccctccgtcg ggaaccttaa taatatgcgt 2820

gccacctacc tggaaacttt atctgtaagc acaaccaaag ggtttgcctc agcacttgtc 2880

ccgaaggtag tgacacaagt cggctccgtg atagaagaac ttgacacctc atactgtata 2940

gaatctgatc tggatttata ctgtacaagg atagtgacat tccctatgtc tccaggaatt 3000

tattcttgtc tgagcggtaa tacatcagct tgcatgtact caaagactga aggcgcactc 3060

aatacgccat acatggccct caaaggctca gtcattgcca attgcaaaat aacaacctgc 3120

agatgtgcag accccccagg tatcatatcg caaaattatg gagaagctgt atctcttata 3180

gataggcatt catgcaatgt cttatcatta gatgggataa ccctgaggct cagtggggag 3240

tttgatgcaa cttatcaaaa gaatatctca atactagatt ctcaagtcat cgtgacaggc 3300

aaccttgata tatcaaccga gcttggaaat gtcaacaatt caataagcaa tgctctggac 3360

aggttagcag agagtaacag caaactagac aaagtcaatg tcaaattaac cagcacatct 3420

gctctcatta cctatatcat cctaaccatc atatctcttg tttttggtgc acttagcttg 3480

gttttagcat gctatctaat gtacaaacaa agggcacaac aaaagaccct actgtggctt 3540

gggaacaaca ccctcgatca gatgagagcc actacaagaa catgaacaca gatgaggaac 3600

gaaggtttcc ctaatagtaa tttatgtgaa agttctggta gtctgtcagt tcagagagtt 3660

aagaaaaaac taccggttgt agatgaccaa aggacgatat acgggtagaa cggtaagaga 3720

ggccgcccct caattgcgag ccaggcttca caacctccgt tctaccgctt caccgacaac 3780

agtcctcaat catggaccat gcagtcagca gagttgcgtt agagaatgag gaaagagaag 3840

cgaagagcac atggcgcttg gttttccgga tcgcggtttt acttttaaca gtggtgacct 3900

tagctatctc tgtagctgcc ttggtataca gcatgggggc cagtacgccc cgcgacctcg 3960

taggcgtatc gactatggtc tctaaggtgg aagacaagat tacgtcctca atcagttcga 4020

gtcaagatgt agtagacagg atatacaaac aagtagctct tgaatctccg ctggcactgc 4080

taaatactga atctataatt atgaatgcaa taacgtctct ctctcatcag attaatgggg 4140

ctgcaaacaa tagcaggtgt ggggcgccta ttcatgaccc agattatatc ggggggatag 4200

gtaaagaact catagtagac gacatcagtg gtgttacatc attctaccca tctgcatacc 4260

aagaacacct gaattttatc ccagcgccca ccacaggatc aggctgcact cggataccct 4320

catttgatat gagtgctacc cactactgtt atactcataa cgtgatattg tctggctgca 4380

tagaccactc acattcacat caatacttag cacttggtgt gcttcggaca tccgcaacag 4440

ggagggtatt cttttctact ctacgttcca tcaacttaga tgacaaccaa aatcggaagt 4500

cctgcagtgt gagtgcaact cctctaggtt gtgatatcct gtgctctaaa gtcacggagg 4560

ctgaagaaga ggattataag tcagttgccc ctacatcaat ggtgcacgga agattaggtt 4620

ttgacggtca gtaccatgag aaggacttag acaccacagt cttatttaag gattgggtag 4680

caaattaccc gggggttggg agcggatctt ttattgatga ccgtgtctgg ttcccagttt 4740

acggagggtt gaaacctaat tcgcccagcg acactgcaca agaagggaaa tatataatat 4800

acaagcgcta taataacaca tgccctgatg gacaggagta tcaaatccgg atggctaagt 4860

cttcatacaa gcctgggcgt ttcagtggaa agcgtgtaca gcaagccatc ttatctatca 4920

aagtgtcgac atctttgggt gaggacccgg tgctgactgt tccacccaat acaattacac 4980

tcatgggggc cgaaggaaga gtcctcacgg tagggacgtc tcacttcttg tatcaacgag 5040

ggtcttcata tttctcccct gccttattat atcctatgac agtccataac aaaacagcta 5100

ctcttcataa tccttataca tttaatgcct tcacccggcc aggtagtgtc ccttgtcagg 5160

catcagcaag atgccccaac ccgtgtatca ctggagtcta tactgatccg taccctctgg 5220

tcttctacag gaaccacact ttgcgagggg tattcgggac aatgcttgat gatgaacaaa 5280

caagactcaa ccccgtatct gcagtattcg acaatatatc tcgcagtcgt gtaaccagag 5340

taagttcaag cagcaccaag gcagcataca cgacatcaac atgcttcaaa gttgtcaaga 5400

ccaataaagt ttattgcctc agcattgccg aaatatccaa caccctattt ggggaattca 5460

gaatcgttcc tttgttagtt gagatcctaa aggatgaaag ggctagagaa gctagatctg 5520

gttagttgag tcaattataa aggagttgga aagatggcat tgtatcacct atcctctgcg 5580

acatcaagaa tcaaaccgaa tgccggcgcg tgctcgaatt ccatgttgcc agttgaccac 5640

aatcagccag tgctcatgcg atcagattaa gccttgtcaa tagtctcttg atttagaaaa 5700

aatgtaagtg gcaatgagat acaaggcaaa acagctcatg gtaaataata cgggtaggac 5760

atggcgagct ccggtcctga aagggcagag catcagatta tcctaccaga gtcacacctg 5820

tcttcaccat tggtcaagca caaactactc tattactgga aattaactgg gctaccgctt 5880

cctgatgaat gtgacttcga ccacctcatt ctcagccgac aatggaaaaa aatacttgaa 5940

tcggcctctc ctgatactga gagaatgata aaactcggaa gggcagtaca ccaaactctt 6000

aaccacaatt ccagaataac cggagtgctc caccccaggt gtttagaaga actggctaat 6060

attgaggtcc cagattcaac caacaaattt cggaagattg agaagaagat ccaaattcac 6120

aacacgagat atggagaact gttcacaagg ctgtgtacgc atatagagaa gaaactgctg 6180

gggtcatctt ggtctaacaa tgtcccccgg tcagaggagt tcagcagcat tcgtacggat 6240

ccggcattct ggtttcactc aaaatggtcc acagccaagt ttgcatggct ccatataaaa 6300

cagatccaga ggcatctgat ggtggcagct aggacaaggt ctgcggccaa caaattggtg 6360

atgctaaccc ataaggtagg ccaagtcttt gtcactcctg aacttgtcgt tgtgacgcat 6420

acgaatgaga acaagttcac atgtcttacc caggaacttg tattgatgta tgcagatatg 6480

atggagggca gagatatggt caacataata tcaaccacgg cggtgcatct cagaagctt 6539

<210> 5

<211> 15342

<212> DNA

<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)

<400> 5

taatacgact cactataggg accaaacaga gaatccgtga gttacgttaa aaggcgaagg 60

agcaattgaa gtcgcacggg tagaaggtgt gactctcgag tgcgagcccg aagcacaaac 120

tcgagaaagc cttctgccaa catgtcttcc gtatttgatg agtacgaaca gctcctcgcg 180

gctcagactc gccccaatgg agctcatgga gggggagaaa aagggagtac cttaaaagta 240

gacgtcccgg tattcactct taacagtgat gacccagaag atagatggag ctttgtggta 300

ttctgcctcc ggattgctgt tagcgaagat gccaacaaac cactcaggca aggtgctctc 360

atatctcttt tatgctccca ctcacaggta atgaggaacc atgttgccct tgcagggaaa 420

cagaatgaag ccacattggc cgtgcttgag attgatggct ttgccaacgg cacgccccag 480

ttcaacaata ggagtggagt gtctgaagag agagcacaga gatttgcgat gatagcagga 540

tctctccctc gggcatgcag caacggaacc ccgttcgtca cagccggggc cgaagatgat 600

gcaccagaag acatcaccga taccctggag aggatcctct ctatccaggc tcaagtatgg 660

gtcacagtag caaaagccat gactgcgtat gagactgcag atgagtcgga aacaaggcga 720

atcaataagt atatgcagca aggcagggtc caaaagaaat acatcctcta ccccgtatgc 780

aggagcacaa tccaactcac gatcagacag tctcttgcag tccgcatctt tttggttagc 840

gagctcaaga gaggccgcaa cacggcaggt ggtacctcta cttattataa cctggtaggg 900

gacgtagact catacatcag gaataccggg cttactgcat tcttcttgac actcaagtac 960

ggaatcaaca ccaagacatc agcccttgca cttagtagcc tctcaggcga catccagaag 1020

atgaagcagc tcatgcgttt gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacatta 1080

cttggtgata gtgaccagat gagctttgcg cctgccgaat atgcacaact ttactccttt 1140

gccatgggta tggcatcagt cctagataaa ggtactggga aataccaatt tgccagggac 1200

tttatgagca catcattctg gagacttgga gtagagtacg ctcaggctca gggaagtagc 1260

attaacgagg atatggctgc cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag gggcctggca 1320

gctgctgccc aacgggtctc cgaggagacc agcagcatag acatgcctac tcaacaagtc 1380

ggagtcctca ctgggcttag cgaggggggg tcccaagctc tacaaggcgg atcgaataga 1440

tcgcaagggc aaccagaagc cggggatggg gagacccaat tcctggatct gatgagagcg 1500

gtagcaaata gcatgaggga ggcgccaaac tctgcacagg gcactcccca atcggggcct 1560

cccccaactc ctgggccatc ccaagataac gacaccgact gggggtattg atggacaaaa 1620

cccagcctgc ttccacaaaa acatcccaat gccctcaccc gtagtcgacc cctcgatttg 1680

cggctctata tgaccacacc ctcaaacaaa catccccctc tttcctccct ccccctgctg 1740

tacaactccg cacgccctag ataccacagg cacaatgcgg ctcactaaca atcaaaacag 1800

agccgaggga attagaaaaa agtacgggta gaagagggat attcagagat cagggcaagt 1860

ctcccgagtc tctgctctct cctctacctg atagaccagg acaaacatgg ccacctttac 1920

agatgcagag atcgacgagc tatttgagac aagtggaact gtcattgaca acataattac 1980

agcccagggt aaaccagcag agactgttgg aaggagtgca atcccacaag gcaagaccaa 2040

ggtgctgagc gcagcatggg agaagcatgg gagcatccag ccaccggcca gtcaagacaa 2100

ccccgatcga caggacaggt ctgacaaaca accatccaca cccgagcaaa cgaccccgca 2160

tgacagcccg ccggccacat ccgccgacca gccccccacc caggccacag acgaagccgt 2220

cgacacacag ctcaggaccg gagcaagcaa ctctctgctg ttgatgcttg acaagctcag 2280

caataaatcg tccaatgcta aaaagggccc atggtcgagc ccccaagagg ggaatcacca 2340

acgtccgact caacagcagg ggagtcaacc cagtcgcgga aacagtcagg aaagaccgca 2400

gaaccaagtc aaggccgccc ctggaaacca gggcacagac gtgaacacag catatcatgg 2460

acaatgggag gagtcacaac tatcagctgg tgcaacccct catgctctcc gatcaaggca 2520

gagccaagac aatacccttg tatctgcgga tcatgtccag ccacctgtag actttgtgca 2580

agcgatgatg tctatgatgg aggcgatatc acagagagta agtaaggttg actatcagct 2640

agatcttgtc ttgaaacaga catcctccat ccctatgatg cggaccgaaa tccaacagct 2700

gaaaacatct gttgcagtca tggaagccaa cttgggaatg atgaagattc tggatcccgg 2760

ttgtgccaac atttcatctc tgagtgatct acgggcagtt gcccgatctc acccggtttt 2820

agtttcaggc cctggagacc cctctcccta tgtgacacaa ggaggcgaaa tggcacttaa 2880

taaactttcg caaccagtgc cacatccatc tgaattgatt aaacccgcca ctgcatgcgg 2940

gcctgatata ggagtggaaa aggacactgt ccgtgcattg atcatgtcac gcccaatgca 3000

cccgagttct tcagccaagc tcctaagcaa gttagatgca gccgggtcga tcgaggaaat 3060

caggaaaatc aagcgccttg ctctaaatgg ttaattacta ctgccacacg tagcgggtcc 3120

ctgtccactc ggcatcacac ggaatctgca ccgagttccc ccccgcagac ccaaggtcca 3180

actctccaag cggcaatcct ctctcgcttc ctcagcccca ctgaatgatc gcgtaaccgt 3240

aattaatcta gctacattta agattaagaa aaaatacggg tagaattgga gtgccccaat 3300

tgtgccaaga tggactcatc taggacaatt gggctgtact ttgattctgc ccattcttct 3360

agcaacctgt tagcatttcc gatcgtccta caagacacag gagatgggaa gaagcaaatc 3420

gccccgcaat ataggatcca gcgccttgac ttgtggactg atagtaagga ggactcagta 3480

ttcatcacca cctatggatt catctttcaa gctgggaatg aagaagccac tgtcggcatg 3540

atcgatgata aacccaagcg cgagttactt tccgctgcga tgctctgcct aggaagcgtc 3600

ccaaataccg gagaccttat tgagctggca agggcctgtc tcactatgat agtcacatgc 3660

aagaagagtg caactaatac tgagagaatg gttttctcag tagtgcaggc accccaagtg 3720

ctgcaaagct gtagggttgt ggcaaacaaa tactcatcag tgaatgcagt caagcacgtg 3780

aaagcgccag agaagattcc cgggagtgga accctagaat acaaggtgaa ctttgtctcc 3840

ttgactgtgg taccgaagaa ggatgtctac aagatcccag ctgcagtatt gaaggtttct 3900

ggctcgagtc tgtacaatct tgcgctcaat gtcactatta atgtggaggt agacccgagg 3960

agtcctttgg ttaaatctct gtctaagtct gacagcggat actatgctaa cctcttcttg 4020

catattggac ttatgaccac cgtagatagg aaggggaaga aagtgacatt tgacaagctg 4080

gaaaagaaaa taaggagcct tgatctatct gtcgggctca gtgatgtgct cgggccttcc 4140

gtgttggtaa aagcaagagg tgcacggact aagctcttgg cacctttctt ctctagcagt 4200

gggacagcct gctatcccat agcaaatgct tctcctcagg tggccaagat actctggagt 4260

caaaccgcgt gcctgcggag cgttaaaatc attatccaag caggtaccca acgcgctatc 4320

gcagtgaccg ccgaccacga ggttacctct actaagctgg agaaggggca cacccttgcc 4380

aaatacaatc cttttaagaa ataagctgcg tctctgagat tgcgctccgc ccactcaccc 4440

agatcatcat gacacaaaaa actaatctgt cttgattatt tacagttagt ttacctgtct 4500

atcaagttag aaaaaacacg ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc ctccaggtgc 4560

aagatgggct ccagaccttc taccaagaac ccagcaccta tgatgctgac tatccgggtt 4620

gcgctggtac tgagttgcat ctgtccggca aactccattg atggcaggcc tcttgcagct 4680

gcaggaattg tggttacagg agacaaagcc gtcaacatat acacctcatc ccagacagga 4740

tcaatcatag ttaagctcct cccgaatctg cccaaggata aggaggcatg tgcgaaagcc 4800

cccttggatg catacaacag gacattgacc actttgctca ccccccttgg tgactctatc 4860

cgtaggatac aagagtctgt gactacatct ggagggggga gacaggggcg ccttataggc 4920

gccattattg gcggtgtggc tcttggggtt gcaactgccg cacaaataac agcggccgca 4980

gctctgatac aagccaaaca aaatgctgcc aacatcctcc gacttaaaga gagcattgcc 5040

gcaaccaatg aggctgtgca tgaggtcact gacggattat cgcaactagc agtggcagtt 5100

gggaagatgc agcagtttgt taatgaccaa tttaataaaa cagctcagga attagactgc 5160

atcaaaattg cacagcaagt tggtgtagag ctcaacctgt acctaaccga attgactaca 5220

gtattcggac cacaaatcac ttcacctgct ttaaacaagc tgactattca ggcactttac 5280

aatctagctg gtggaaatat ggattactta ttgactaagt taggtgtagg gaacaatcaa 5340

ctcagctcat taatcggtag cggcttaatc accggtaacc ctattctata cgactcacag 5400

actcaactct tgggtataca ggtaactcta ccttcagtcg ggaacctaaa taatatgcgt 5460

gccacctact tggaaacctt atccgtaagc acaaccaggg gatttgcctc ggcacttgtc 5520

ccaaaagtgg tgacacaggt cggttctgtg atagaagaac ttgacacctc atactgtata 5580

gaaactgact tagatttata ttgtacaaga atagtaacgt tccctatgtc ccctggtatt 5640

tattcctgct tgagcggcaa tacgtcggcc tgtatgtact caaagaccga aggcgcactt 5700

actacaccat acatgactat caaaggttca gtcatcgcca actgcaagat gacaacatgt 5760

agatgtgtaa accccccggg tatcatatcg caaaactatg gagaagccgt gtctctaata 5820

gataaacaat catgcaatgt tttatcctta ggcgggataa ctttaaggct cagtggggaa 5880

ttcgatgtaa cttatcagaa gaatatctca atacaagatt ctcaagtaat aataacaggc 5940

aatcttgata tctcaactga gcttgggaat gtcaacaact cgatcagtaa tgctttgaat 6000

aagttagagg aaagcaacag aaaactagac aaagtcaatg tcaaactgac tagcacatct 6060

gctctcatta cctatatcgt tttgactatc atatctcttg tttttggtat acttagcctg 6120

attctagcat gctacctaat gtacaagcaa aaggcgcaac aaaagacctt attatggctt 6180

gggaataata ctctagatca gatgagagcc actacaaaaa tgtgaacaca gatgaggaac 6240

gaaggtttcc ctaatagtaa tttatgtgaa agttctggta gtctgtcagt tcagagagtt 6300

aagaaaaaac taccggttgt agatgaccaa aggacgatat acgggtagaa cggtaagaga 6360

ggccgcccct caattgcgag ccaggcttca caacctccgt tctaccgctt caccgacaac 6420

agtcctcaat catggaccgc gccgttagcc aagttgcgtt agagaatgat gaaagagagg 6480

caaaaaatac atggcgcttg atattccgga ttgcaatctt attcttaaca gtagtgacct 6540

tggctatatc tgtagcctcc cttttatata gcatgggggc tagcacacct agcgatcttg 6600

taggcatacc gactaggatt tccagggcag aagaaaagat tacatctaca cttggttcca 6660

atcaagatgt agtagatagg atatataagc aagtggccct tgagtctccg ttggcattgt 6720

taaatactga gaccacaatt atgaacgcaa taacatctct ctcttatcag attaatggag 6780

ctgcaaacaa cagtgggtgg ggggcaccta tccatgaccc agattatata ggggggatag 6840

gcaaagaact cattgtagat gatgctagtg atgtcacatc attctatccc tctgcatttc 6900

aagaacatct gaattttatc ccggcgccta ctacaggatc aggttgcact cgaataccct 6960

catttgacat gagtgctacc cattactgct acacccataa tgtaatattg tctggatgca 7020

gagatcactc acattcatat cagtatttag cacttggtgt gctccggaca tctgcaacag 7080

ggagggtatt cttttctact ctgcgttcca tcaacctgga cgacacccaa aatcggaagt 7140

cttgcagtgt gagtgcaact cccctgggtt gtgatatgct gtgctcgaaa gtcacggaga 7200

cagaggaaga agattataac tcagctgtcc ctacgcggat ggtacatggg aggttagggt 7260

tcgacggcca gtaccacgaa aaggacctag atgtcacaac attattcggg gactgggtgg 7320

ccaactaccc gggagtaggg ggtggatctt ttattgacag ccgcgtatgg ttctcagtct 7380

acggagggtt aaaacccaat tcacccagtg acactgtaca ggaagggaaa tatgtgatat 7440

acaagcgata caatgacaca tgcccagatg agcaagacta ccagattcga atggccaagt 7500

cttcgtataa gcctggacgg tttggtggga aacgcataca gcaggctatc ttatctatca 7560

aggtgtcaac atccttaggc gaagacccgg tactgactgt accgcccaac acagtcacac 7620

tcatgggggc cgaaggcaga attctcacag tagggacatc tcatttcttg tatcaacgag 7680

ggtcatcata cttctctccc gcgttattat atcctatgac agtcagcaaa aaaacagcca 7740

ctcttcatag tccttataca ttcaatgcct tcactcggcc aggtagtatc ccttgccagg 7800

cttcagcaag atgccccaac tcgtgtgtta ctggagtcta tacagatcca tatcccctaa 7860

tcttctatag aaaccacacc ttgcgagggg tattcgggac aatgcttgat ggtgtacaag 7920

caagacttaa ccctgcgtct gcagtattcg atagcacatc ccgcagtcgc attactcgag 7980

tgagttcaag cagtaccaaa gcagcataca caacatcaac ttgttttaaa gtggtcaaga 8040

ctaataagac ctattgtctc agcattgctg aaatatctaa tactctcttc ggagaattca 8100

gaatcgtccc gttactagtt gagatcctca aagatgacgg ggttagagaa gccaggtctg 8160

gctagttgag tcaattataa aggagttgga aagatggcat tgtatcacct atcctctgcg 8220

acatcaagaa tcaaaccgaa tgccggcgcg tgctcgaatt ccatgttgcc agttgaccac 8280

aatcagccag tgctcatgcg atcagattaa gccttgtcaa tagtctcttg atttagaaaa 8340

aatgtaagtg gcaatgagat acaaggcaaa acagctcatg gtaaataata cgggtaggac 8400

atggcgagct ccggtcctga aagggcagag catcagatta tcctaccaga gtcacacctg 8460

tcttcaccat tggtcaagca caaactactc tattactgga aattaactgg gctaccgctt 8520

cctgatgaat gtgacttcga ccacctcatt ctcagccgac aatggaaaaa aatacttgaa 8580

tcggcctctc ctgatactga gagaatgata aaactcggaa gggcagtaca ccaaactctt 8640

aaccacaatt ccagaataac cggagtgctc caccccaggt gtttagaaga actggctaat 8700

attgaggtcc cagattcaac caacaaattt cggaagattg agaagaagat ccaaattcac 8760

aacacgagat atggagaact gttcacaagg ctgtgtacgc atatagagaa gaaactgctg 8820

gggtcatctt ggtctaacaa tgtcccccgg tcagaggagt tcagcagcat tcgtacggat 8880

ccggcattct ggtttcactc aaaatggtcc acagccaagt ttgcatggct ccatataaaa 8940

cagatccaga ggcatctgat ggtggcagct aggacaaggt ctgcggccaa caaattggtg 9000

atgctaaccc ataaggtagg ccaagtcttt gtcactcctg aacttgtcgt tgtgacgcat 9060

acgaatgaga acaagttcac atgtcttacc caggaacttg tattgatgta tgcagatatg 9120

atggagggca gagatatggt caacataata tcaaccacgg cggtgcatct cagaagctta 9180

tcagagaaaa ttgatgacat tttgcggtta atagacgctc tggcaaaaga cttgggtaat 9240

caagtctacg atgttgtatc actaatggag ggatttgcat acggagctgt ccagctactc 9300

gagccgtcag gtacatttgc aggagatttc ttcgcattca acctgcagga gcttaaagac 9360

attctaattg gcctcctccc caatgatata gcagaatccg tgactcatgc aatcgctact 9420

gtattctctg gtttagaaca gaatcaagca gctgagatgt tgtgtctgtt gcgtctgtgg 9480

ggtcacccac tgcttgagtc ccgtattgca gcaaaggcag tcaggagcca aatgtgcgca 9540

ccgaaaatgg tagactttga tatgatcctt caggtactgt ctttcttcaa gggaacaatc 9600

atcaacgggt acagaaagaa gaatgcaggt gtgtggccgc gagtcaaagt ggatacaata 9660

tatgggaagg tcattgggca actacatgca gattcagcag agatttcaca cgatatcatg 9720

ttgagagagt ataagagttt atctgcactt gaatttgagc catgtataga atatgaccct 9780

gtcaccaacc tgagcatgtt cctaaaagac aaggcaatcg cacaccccaa cgataattgg 9840

cttgcctcgt ttaggcggaa ccttctctcc gaagaccaga agaaacatgt aaaagaagca 9900

acttcgacta atcgcctctt gatagagttt ttagagtcaa atgattttga tccatataaa 9960

gagatggaat atctgacgac ccttgagtac cttagagatg acaatgtggc agtatcatac 10020

tcgctcaagg agaaggaagt gaaagttaat ggacggatct tcgctaagct gacaaagaag 10080

ttaaggaact gtcaggtgat ggcggaaggg atcctagccg atcagattgc acctttcttt 10140

cagggaaatg gagtcattca ggatagcata tccttgacca agagtatgct agcgatgagt 10200

caactgtctt ttaacagcaa taagaaacgt atcactgact gtaaagaaag agtatcttca 10260

aaccgcaatc atgatccgaa aagcaagaac cgtcggagag ttgcaacctt cataacaact 10320

gacctgcaaa agtactgtct taattggaga tatcagacaa tcaaattgtt cgctcatgcc 10380

atcaatcagt tgatgggcct acctcacttc ttcgaatgga ttcacctaag actgatggac 10440

actacgatgt tcgtaggaga ccctttcaat cctccaagtg accctactga ctgtgacctc 10500

tcaagagtcc ctaatgatga catatatatt gtcagtgcca gagggggtat cgaaggatta 10560

tgccagaagc tatggacaat gatctcaatt gctgcaatcc aacttgctgc agctagatcg 10620

cattgtcgtg ttgcctgtat ggtacagggt gataatcaag taatagcagt aacgagagag 10680

gtaagatcag acgactctcc ggagatggtg ttgacacagt tgcatcaagc cagtgataat 10740

ttcttcaagg aattaattca tgtcaatcat ttgattggcc ataatttgaa ggatcgtgaa 10800

accatcaggt cagacacatt cttcatatac agcaaacgaa tcttcaaaga tggagcaatc 10860

ctcagtcaag tcctcaaaaa ttcatctaaa ttagtgctag tgtcaggtga tctcagtgaa 10920

aacaccgtaa tgtcctgtgc caacattgcc tctactgtag cacggctatg cgagaacggg 10980

cttcccaaag acttctgtta ctatttaaac tatataatga gttgtgtgca gacatacttt 11040

gactctgagt tctccatcac caacaattcg caccccgatc ttaatcagtc gtggattgag 11100

gacatctctt ttgtgcactc atatgttctg actcctgccc aattaggggg actgagtaac 11160

cttcaatact caaggctcta cactagaaat atcggtgacc cggggactac tgcttttgca 11220

gagatcaagc gactagaagc agtgggatta ctgagtccta acattatgac taatatctta 11280

actaggccgc ctgggaatgg agattgggcc agtctgtgca acgacccata ctctttcaat 11340

tttgagactg ttgcaagccc aaatattgtt cttaagaaac atacgcaaag agtcctattt 11400

gaaacttgtt caaatccctt attgtctgga gtgcacacag aggataatga ggcagaagag 11460

aaggcattgg ctgaattctt gcttaatcaa gaggtgattc atccccgcgt tgcgcatgcc 11520

atcatggatg caagctctgt aggtaggaga aagcaaattc aagggcttgt tgacacaaca 11580

aacaccgtaa ttaagattgc gcttactagg aggccattag gcatcaagag gctgatgcgg 11640

atagtcaatt attctagcat gcatgcaatg ctgtttagag acgatgtttt ttcctccagt 11700

agatccaacc accccttagt ctcttctaat atgtgttctc tgacactggc agactatgca 11760

cggaatagaa gctggtcacc tttgacggga ggcaggaaaa tactgggtgt atctaatcct 11820

gatacgatag aactcgtaga gggtgagatt cttagtgtaa gcggagggtg tacaagatgt 11880

gacagcggag atgaacaatt tacttggttc catcttccaa gcaatataga attgaccgat 11940

gacaccagca agaatcctcc gatgagggta ccatatctcg ggtcaaagac acaggagagg 12000

agagctgcct cacttgcaaa aatagctcat atgtcgccac atgtaaaggc tgccctaagg 12060

gcatcatccg tgttgatctg ggcttatggg gataatgaag taaattggac tgctgctctt 12120

acgattgcaa aatctcggtg taatgtaaac ttagagtatc ttcggttact gtccccttta 12180

cccacggctg ggaatcttca acatagacta gatgatggta taactcagat gacattcacc 12240

cctgcatctc tctacagggt gtcaccttac attcacatat ccaatgattc tcaaaggctg 12300

ttcactgaag aaggagtcaa agaggggaat gtggtttacc aacagatcat gctcttgggt 12360

ttatctctaa tcgaatcgat ctttccaatg acaacaacca ggacatatga tgagatcaca 12420

ctgcacctac atagtaaatt tagttgctgt atcagagaag cacctgttgc gattcctttc 12480

gagctacttg gggtggtacc ggaactgagg acagtgacct caaataagtt tatgtatgat 12540

cctagccctg tatcggaggg agactttgcg agacttgact tagctatctt caagagttat 12600

gagcttaatc tggagtcata tcccacgata gagctaatga acattctttc aatatccagc 12660

gggaagttga ttggccagtc tgtggtttct tatgatgaag atacctccat aaagaatgac 12720

gccataatag tgtatgacaa tacccgaaat tggatcagtg aagctcagaa ttcagatgtg 12780

gtccgcctat ttgaatatgc agcacttgaa gtgctcctcg actgttctta ccaactctat 12840

tacctgagag taagaggcct agacaatatt gtcttatata tgggtgattt atacaagaat 12900

atgccaggaa ttctactttc caacattgca gctacaatat ctcatcccgt cattcattca 12960

aggttacatg cagtgggcct ggtcaaccat gacggatcac accaacttgc agatacggat 13020

tttatcgaaa tgtctgcaaa actattagta tcttgcaccc gacgtgtgat ctccggctta 13080

tattcaggaa ataagtatga tctgctgttc ccatctgtct tagatgataa cctgaatgag 13140

aagatgcttc agctgatatc ccggttatgc tgtctgtaca cggtactctt tgctacaaca 13200

agagaaatcc cgaaaataag aggcttaact gcagaagaga aatgttcaat actcactgag 13260

tatttactgt cggatgctgt gaaaccatta cttagccccg atcaagtgag ctctatcatg 13320

tctcctaaca taattacatt cccagctaat ctgtactaca tgtctcggaa gagcctcaat 13380

ttgatcaggg aaagggagga cagggatact atcctggcgt tgttgttccc ccaagagcca 13440

ttattagagt tcccttctgt gcaagatatt ggtgctcgag tgaaagatcc attcacccga 13500

caacctgcgg catttttgca agagttagat ttgagtgctc cagcaaggta tgacgcattc 13560

acacttagtc agattcatcc tgaactcaca tctccaaatc cggaggaaga ctacttagta 13620

cgatacttgt tcagagggat agggactgca tcttcctctt ggtataaggc atctcatctc 13680

ctttctgtac ccgaggtaag atgtgcaaga cacgggaact ccttatactt agctgaaggg 13740

agcggagcca tcatgagtct tctcgaactg catgtaccac atgaaactat ctattacaat 13800

acgctctttt caaatgagat gaaccccccg caacgacatt tcgggccgac cccaactcag 13860

tttttgaatt cggttgttta taggaatcta caggcggagg taacatgcaa agatggattt 13920

gtccaagagt tccgtccatt atggagagaa aatacagagg aaagtgacct gacctcagat 13980

aaagcagtgg ggtatattac atctgtagtg ccctacaggt ctgtatcatt gctgcattgt 14040

gacattgaaa ttcctccagg gtccaatcag agcttactag atcaactagc tatcaattta 14100

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tatattctct ctaatggtta tgcatgtcga ggagatatgg agtgttacct ggtatttgtc 14280

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gtgcagcggc acggtacgct tttgtctaaa tcagatgaga tcacactgac caggttattc 14400

acctcacagc ggcagcgtgt gacagacatc ctatccagtc ctttaccaag attaataaag 14460

tacttgagga agaatattga cactgcgctg attgaagccg ggggacagcc cgtccgtcca 14520

ttctgtgcgg agagtctggt gagcacgcta gcgaacataa ctcagataac ccagatcatc 14580

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