一种检测碱基切除修复酶的电化学生物传感器及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种检测碱基切除修复酶的电化学生物传感器及其制备方法与应用 (Electrochemical biosensor for detecting base excision repair enzyme and preparation method and application thereof ) 是由 张春阳 崔琳 赵敏慧 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种检测碱基切除修复酶的电化学生物传感器及其制备方法与应用。所述生物传感器包括β-CD/FeCN/GCE电极,所述β-CD/FeCN/GCE电极由含铁富氮碳纳米管和环糊精修饰至玻碳电极上制得；所述电化学生物传感器还包括MB-hairpin/AuNPs探针,所述MB-hairpin/AuNPs探针包括金纳米颗粒,以及修饰在AuNP上的硫醇化的MB-发夹结构探针,所述MB-发夹结构探针中的茎区设计有1至多个待测碱基切除修复酶的目标碱基。本发明制备得到电化学生物传感器灵敏度高、背景信号低等优点,在碱基切除修复酶抑制剂的筛选以及对于生物样品的分析等领域具有广泛的应用价值。(The invention provides an electrochemical biosensor for detecting base excision repair enzyme and a preparation method and application thereof. The biosensor comprises a beta-CD/FeCN/GCE electrode, wherein the beta-CD/FeCN/GCE electrode is prepared by modifying an iron-containing nitrogen-rich carbon nanotube and cyclodextrin onto a glassy carbon electrode; the electrochemical biosensor also comprises an MB-hairpin/AuNPs probe, wherein the MB-hairpin/AuNPs probe comprises gold nanoparticles and a thiolated MB-hairpin structure probe modified on AuNP, and a stem region in the MB-hairpin structure probe is designed with 1 to a plurality of target bases of the base excision repair enzyme to be detected. The electrochemical biosensor prepared by the invention has the advantages of high sensitivity, low background signal and the like, and has wide application value in the fields of screening of the base excision repair enzyme inhibitor, analysis of biological samples and the like.)
技术领域
本发明属于电化学检测技术领域，具体涉及一种检测碱基切除修复酶的电化学生物传感器及其制备方法与应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
天然酶活性高，特异性好，在机体代谢和各种生化反应中起着重要作用。然而，天然酶面临着巨大的挑战，包括制备、纯化和储存成本高、在恶劣条件下容易变性，以及在某些复杂介质(如废水)中催化活性受到抑制。对高效特异性酶的需求促使化学家们利用新型纳米技术来设计具有相似结构和模拟功能的合成酶，因此大量功能性纳米材料不断涌现。贵金属(如Pd和Au)，金属氧化物(如MnO2，Fe3O4和CeO2)碳基纳米材料，金属配合物，卟啉，和聚合物已被广泛研究，以模拟天然酶的结构和功能。与天然酶相比，纳米材料具有成本低、催化活性可调、稳定性好、在恶劣环境条件下(如甲醇、乙醇和二甲基甲酰胺)具有鲁棒性好、易于长期储存和处理等优点，有望成为人工酶的研究热点。
通过非共价相互作用实现超分子宿主-客体识别是大型功能结构装配的一种新方法。一般来说，主体(例如β-CD)包含大容量空腔以及具有对客体分子杰出的识别和封装能力。由于识别基元具有特异性和生物正交性，主-客体相互作用在生物分析中得到了广泛的应用。
碱基切除修复(BER)是DNA修复机制之一，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)在维持基因组完整性方面起着关键作用。UDG能够通过催化尿嘧啶和脱氧核糖之间的n-糖苷键水解，从DNA中去除尿嘧啶损伤。由于DNA糖基化酶对DNA损伤修复至关重要，且与个体和人群疾病易感性相关，UDG已成为一种有前景的生物标志物和潜在的治疗靶点。传统的DNA糖基化酶检测方法有凝胶电泳法、放射性检测法、色谱分析法，但这些方法通常费时费力，并涉及危险的放射性物质和复杂的程序。另外，包括比色法和荧光法在内的几种新的UDG检测方法已经开发出来，但它们涉及到发夹探针和带有染料标记的功能核酸探针的制备过程。因此，亟需开发简单、灵敏的DNA糖基化酶的检测方法。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供一种基于主客体作用和模拟酶电催化信号放大的电化学生物传感器及其制备方法和应用，本发明制备得到电化学生物传感器具有灵敏度高、背景信号低等优点，在碱基切除修复酶抑制剂的筛选以及对于生物样品的分析等领域具有广泛的应用价值。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种检测碱基切除修复酶的电化学生物传感器，所述电化学生物传感器包括β-CD/FeCN/GCE电极，所述β-CD/FeCN/GCE电极由含铁富氮碳纳米管(FeCN)和环糊精(β-CD)修饰至玻碳电极(GCE)上制得。
进一步的，所述电化学生物传感器还包括MB-hairpin/AuNPs探针，所述MB-hairpin/AuNPs探针包括金纳米颗粒(AuNP)，以及修饰在AuNP上的硫醇化的MB-发夹结构(hairpin)探针，所述MB-发夹结构探针中的茎区设计有待测碱基切除修复酶的目标碱基，所述目标碱基个数可根据实际情况进行设置，如1个，2个，4个，6个等。
其中，所述碱基切除修复酶为DNA糖基化酶，包括但不限于烷基腺嘌呤DNA糖化酶(AAG)、甲酰胺嘧啶DNA糖化酶(FPG)、尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)、胸腺嘧啶-DNA糖化酶(TDG)等；优选为尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)。
本发明的第二个方面，提供上述检测碱基切除修复酶的电化学生物传感器的制备方法，所述制备方法包括：
(1)β-CD/FeCN/GCE电极的制备：将FeCN溶液滴加至GCE表面上以获得FeCN/GCE；干燥后将β-CD溶液溶液滴加至FeCN/GCE上即获得β-CD/FeCN/GCE电极；
(2)MB-hairpin/AuNPs探针的制备：将金纳米颗粒(AuNP)溶液与硫醇化的MB-发夹结构探针溶液混合孵育，离心、洗涤、分散后即得。
本发明的第三个方面，提供上述电化学生物传感器在检测碱基切除修复酶中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种基于上述电化学生物传感器检测碱基切除修复酶的方法，所述方法包括：将MB-hairpin/AuNPs探针添加至待测样品中得混合溶液，然后将β-CD/FeCN/GCE电极加入上述混合溶液中进行孵育处理，进行电化学检测。
本发明的第五个方面，提供上述电化学生物传感器和/或检测方法在碱基切除修复酶相关药物筛选、生物样品酶分析中的应用。
所述碱基切除修复酶相关药物包括但不限于碱基切除修复酶抑制剂和碱基切除修复酶激活剂；
所述生物样品包括生物的细胞，如HeLa细胞。经试验验证，本发明所提出的生物传感器具有较好的对真实复杂生物样品分析能力，可用于对细胞碱基切除修复酶(如UDG)活性的定量检测，在生物医学基础研究及临床诊断等领域都具有很大的应用潜力。
本发明的有益效果为：
1、模拟酶的使用：尽管天然酶具有良好的活性和特异性，但他们的广泛应用受到其高成本以及易变性的限制，而本发明所使用的含铁富氮碳纳米管(FeCN)利用了低成本的双氰胺和氯化亚铁(II)四水合物一步自组装制备，然后通过简单的热处理合成，方法简便，成本低廉，且模拟过氧化物酶含铁富氮碳纳米管(FeCN)可以电催化具有电催化活性的亚甲基蓝，显著放大电化学信号。
2、高灵敏度：FeCN对MB的催化氧化是通过O2氧化较为稳定的催化底物RSH来介导的，而不是外部的H2O2，大大简化了实验过程，可灵敏检测UDG，检测限为7.413×10-5U mL-1。
3、低背景信号：由于发夹DNA的茎环结构和AuNPs的立体效应，MB和β-CD之间发生超分子主客体反应，导致极低的背景信号。
4、广泛的潜在应用：本发明设计的电催化放大生物传感器可以用于UDG抑制剂的筛选以及对于生物样品的分析，在生物医学研究中具有广泛的潜在应用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明基于主-客体相互作用和FeCN模拟酶电催化信号放大一步检测UDG的电化学生物传感器原理图。
图2为本发明不同纳米粒子的表征图，A为合成的含铁富氮碳纳米管(FeCN)的X射线衍射图(XRD)，B为合成的纳米金以及MB修饰的发卡探针结合纳米金的紫外吸收光谱，C为合成的含铁富氮碳纳米管(FeCN)的透射电子显微镜(TEM)图像，D为金纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)图像。
图3为本发明实验可行性分析表征图，A为在含有0.1摩尔每升KCl的5毫摩尔每升的Fe(CN)6 3-/4-中的不同修饰电极的电化学阻抗谱(EIS)，a为裸玻碳电极(GCE)，b为FeCN/GCE，c为β-CD/FeCN/GCE，d为MB-hairpin/AuNPs+1U mL-1UDG+β-CD/FeCN/GCE；B为在含有0.1摩尔每升PBS中的不同修饰电极的电化学示差脉冲伏安法(DPV)曲线，a为MB-hairpin/AuNPs+β-CD/FeCN/GCE，b为MB-hairpin/AuNPs+1U mL-1UDG+β-CD/FeCN/GCE，c为MB-hairpin/AuNPs+1U mL-1UDG+β-CD/FeCN/GCE+10mM半胱氨酸，d为MB-hairpin/AuNPs+1UmL- 1UDG+FeCN/GCE。
图4为本发明实验条件优化图，A为FeCN浓度的优化，B为β-CD浓度的优化，C为UDG与传感器一步反应的孵育时间，误差棒代表三次独立实验的标准偏差。
图5为本发明灵敏度和选择性实验结果表征图，A为用不同浓度的UDG(从a到j：0，0.0005，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1U每毫升)孵育的生物传感器的电化学示差脉冲伏安法(DPV)曲线，B为电流和UDG浓度的对数在0.0005至1U每毫升的范围内之间的线性关系，检测条件：含有10毫摩尔每升的半胱氨酸的0.1摩尔每升的pH为7.4的磷酸缓冲溶液，C为选择性实验结果表征图，分别为0.01毫克每毫升的BSA、1U每升的hAAG，1U每升的FPG，误差棒代表三次独立实验的标准偏差。
图6为本发明不同浓度UGI对UDG相对活性的影响差异。UDG的浓度保持为1U每毫升，误差棒代表三次独立实验的标准偏差。
图7为本发明电流和海拉细胞(HeLa)细胞数的对数之间从5到10000个细胞的线性相关性图，误差棒代表三次独立实验的标准偏差。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，传统的DNA糖基化酶检测方法通常费时费力，并涉及危险的放射性物质和复杂的程序。为了解决如上的技术问题，本发明提出了基于主客体作用和模拟酶介导的电催化放大生物传感器检测碱基切除修复酶的方法。
本发明的一种典型实施方式中，提供了一种检测碱基切除修复酶的电化学生物传感器，所述电化学生物传感器包括β-CD/FeCN/GCE电极，所述β-CD/FeCN/GCE电极由含铁富氮碳纳米管(FeCN)和环糊精(β-CD)修饰至玻碳电极(GCE)上制得。
本发明的又一具体实施方式中，所述电化学生物传感器还包括MB-hairpin/AuNPs探针，所述MB-hairpin/AuNPs探针包括金纳米颗粒(AuNP)，以及修饰在AuNP上的硫醇化的MB-发夹结构(hairpin)探针，所述MB-发夹结构探针中的茎区设计有1至多个待测碱基切除修复酶的目标碱基，所述目标碱基个数可根据实际情况进行设置，如1个，2个，4个，6个等。
本发明的又一具体实施方式中，所述碱基切除修复酶为DNA糖基化酶，包括但不限于烷基腺嘌呤DNA糖化酶(AAG)、甲酰胺嘧啶DNA糖化酶(FPG)、尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)和胸腺嘧啶-DNA糖化酶(TDG)。
本发明的又一具体实施方式中，所述发夹结构探针的茎区3'端修饰亚甲基蓝(MB)，5'端修饰巯基，使得发夹结构通过金硫键与金纳米颗粒(AuNP)进行连接。
本发明的又一具体实施方式中，当待测碱基切除修复酶为尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)时，所述发夹结构的核苷酸序列可以为：
5’-HS-UUU GUC UGU GAA GGA GGT AGA TCA CAG ACA AA-(CH2)6-MB-3’(SEQ IDNO.1)。其中，斜体字母代表在发夹结构茎区发生互补配对的碱基。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述检测碱基切除修复酶的电化学生物传感器的制备方法，所述制备方法包括：
(1)β-CD/FeCN/GCE电极的制备：将FeCN溶液滴加至GCE表面上以获得FeCN/GCE；干燥后将β-CD溶液溶液滴加至FeCN/GCE上即获得β-CD/FeCN/GCE电极。
(2)MB-hairpin/AuNPs探针的制备：将金纳米颗粒(AuNP)溶液与硫醇化的MB-发夹结构探针溶液混合孵育，离心、洗涤、分散后即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述FeCN溶液浓度为0.5～4mg/mL(优选为2mg/ml)；所述β-CD溶液的浓度为0.5～4mg/mL(优选为2mg/ml)；经试验验证，当FeCN溶液浓度为2mg/ml，β-CD溶液的浓度为2mg/ml时，电化学峰值电流最强，检测效果最佳。
其中，所述FeCN制备方法包括：将双氰胺与亚铁盐在惰性气体氛围下加热至490～510℃自组装形成前体，将前体在惰性气体氛围下加热至890～910℃，煅烧后获得含铁富氮碳纳米管FeCN。
其中，所述金纳米颗粒(AuNP)直径为13nm，优选采用柠檬酸钠还原法制得。
所述硫醇化的MB-发夹结构探针的活化处理过程为：采用三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)将二硫键键合的寡核苷酸还原0.5～1.5小时(优选为1小时)。
混合孵育时间为10～20小时(优选为16小时)，即将硫醇化的发卡探针通过金-硫键连接在AuNPs上。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述电化学生物传感器在检测碱基切除修复酶中的应用。
其中，所述碱基切除修复酶为DNA糖基化酶，包括但不限于烷基腺嘌呤DNA糖化酶(AAG)、甲酰胺嘧啶DNA糖化酶(FPG)、尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)、胸腺嘧啶-DNA糖化酶(TDG)。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种基于上述电化学生物传感器检测碱基切除修复酶的方法，所述方法包括：将MB-hairpin/AuNPs探针添加至待测样品中得混合溶液，然后将β-CD/FeCN/GCE电极加入上述混合溶液中进行孵育处理后，进行电化学检测。
其中，所述孵育处理条件为40～120min(优选为80min)，孵育处理温度为30～40℃(优选为37℃)。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述电化学生物传感器和/或检测方法在碱基切除修复酶相关药物筛选、生物样品酶分析中的应用。
所述碱基切除修复酶为DNA糖基化酶，包括但不限于烷基腺嘌呤DNA糖化酶(AAG)、甲酰胺嘧啶DNA糖化酶(FPG)、尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)、胸腺嘧啶-DNA糖化酶(TDG)；进一步优选为尿嘧啶-DNA糖化酶(UDG)。
所述碱基切除修复酶相关药物包括但不限于碱基切除修复酶抑制剂和碱基切除修复酶激活剂；
所述生物样品包括生物的细胞，如HeLa细胞。经试验验证，本发明所提出的生物传感器具有较好的对真实复杂生物样品分析能力，可用于对细胞碱基切除修复酶(如UDG)活性的定量检测，在生物医学基础研究及临床诊断等领域都具有很大的应用潜力。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。下述实施例中，发卡探针由5’到3’的序列为：
5’-HS-UUU GUC UGU GAA GGA GGT AGA TCA CAG ACA AA-(CH2)6-MB-3’。
实施例
本实施例的原理，如图1所示：
用于UDG检测的电化学生物传感器原理如图1所示。将FeCN溶液滴到GCE表面，得到FeCN/GCE。在室温下干燥后，将β-CD溶液滴到FeCN/GCE上形成β-CD/FeCN/GCE。所述DNA底物设计为带茎和环的发夹结构。茎包含两条互补链，包括亚甲基蓝MB标记的3'端和巯基标记的5'端，其中有六个尿嘧啶碱基。5'末端的巯基与AuNPs通过金硫键连接，由于AuNPs的立体效应和发夹茎环结构的DNA，MB因此不能被β-CD/FeCN/GCE识别，导致较低的背景电流。UDG的存在可以促进发夹DNA的六个尿嘧啶碱基的去除，产生一个在3'端带有MB的直链单链DNA。MB可以通过与β-CD的主客体作用组装到电极上，导致MB峰值电流的显著增强。与此同时，具有硫醇结构的L-半胱氨酸(RSH)被O2转化为L-胱氨酸(RSSR)，并释放H2O2。在H2O2的帮助下，FeCN催化MB的氧化，产生放大的电化学信号。由于FeCN模拟酶的高效电催化作用，稳定的催化底物RSH和超分子主客体策略，该生物传感器具有极低的背景和信号放大的优点，它可以用于敏感检测UDG活动。
具体过程：
FeCN的合成：将双氰胺(12mmol)与氯化铁(II)四水合物(FeCl2·4H2O，0.84mmol)混合，将混合物置于石英舟上，放入管式炉中通氩气，在500℃下加热2小时。然后将温度以10℃/min的斜率进一步升温至900℃，并在通氩气的情况中在900℃下保持2小时，得到黑色粉末状材料。在研钵中研磨后，得到的FeCN粉末储存在干燥器中。
金纳米颗粒(AuNP)(直径13纳米)和MB-hairpin/AuNP探针的合成：对于金纳米颗粒的合成，首先，制备过程中使用的所有玻璃器皿需要在王水(3份浓盐酸，1份浓HNO3)中彻底清洗，再用二次水冲洗，烘干备用(需要注意：王水极其危险，应谨慎处理，处理时需要戴手套和护目镜)。先将0.01％HAuCl4溶液100毫升进行剧烈搅拌煮沸，然后快速加入1％柠檬酸钠溶液2.5毫升。混合溶液保持沸腾30分钟，然后冷却到室温。当AuNPs形成后，溶液变成深红色，然后搅拌并冷却到室温。所得的AuNPs储存在4℃的棕色玻璃瓶中，以备进一步使用。
MB-hairpin探针被稀释到10微摩尔每升缓冲区(1.5毫摩尔每升MgCl2 10毫摩尔每升pH值为8.0Tris-HCl)然后在95℃孵育5分钟，缓慢冷却至室温超过30分钟至完全折叠成一个发夹结构。然后硫醇化的MB-hairpin探针(10微摩尔每升)被1毫摩尔每升三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)活化1h打开双硫键。将AuNPs与MB-hairpin探针混合16h，所得溶液以12000rpm离心20min，去除多余的寡核苷酸。用0.1摩尔每升PBS洗涤酒红色MB-hairpin/AuNP沉淀，再用0.1摩尔每升PBS分散。所得到的探针溶液被储存在冰箱中使用。采用紫外分光光度法对[email protected]进行了鉴定。
电化学生物传感器的制备：电化学传感器是构建在GCE电极上。电极在修饰之前，分别用1.0，0.3和0.05微米α-Al2O3粉抛光GCE电极，然后分别依次用纯水和乙醇超声处理3分钟。将10微升FeCN溶液(2毫克每毫升，溶剂为超纯水)滴加到GCE表面上以获得FeCN/GCE。在室温下干燥后，将10微升的β-CD溶液(2毫摩尔每升，溶剂为超纯水)滴在FeCN/GCE上以获得β-CD/FeCN/GCE。
UDG和抑制剂分析的电化学检测：将5微升MB-hairpin/AuNP探针添加到包含不同浓度UDG和1微升10×UDG反应缓冲的10微升的反应体系中。将β-CD/FeCN/GCE与10微升含有不同浓度的目标UDG的MB-hairpin/AuNP探针溶液中于37℃孵育80分钟，将电极彻底清洗和氮气吹干，储存在4℃。此外，以UGI为模型抑制剂，研究了UDG抑制实验。除了不同浓度的抑制剂UGI与含有1U mL-1UDG的反应缓冲液预混合外，UDG抑制试验也采用了类似的方法
细胞提取物的制备：HeLa细胞在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，放在37℃、含有5％二氧化碳的培养箱中进行培养。当海拉细胞生长到指数增长阶段，用胰蛋白酶消化收集，用冷的PBS(pH值7.4，Gibco，美国)洗涤两次，所得溶液以1000转离心5分钟。这些细胞被悬浮在100微升裂解缓冲液中，在冰上孵育30分钟，在4℃以12000g离心20分钟。将上清液转移到一个新鲜的试管中，并储存在-80℃。实验结果
1、材料的表征
本实施例使用X射线衍射图(XRD)研究了FeCN催化剂的晶体结构(图2A)。在26.2℃处的峰表示碳(002)面的特征衍射，与碳纳米管的结构特征一致。在40至50℃范围内的峰可以指向Fe3C结构(JCPDF No.89-2867)的衍射，表明在热缩聚和碳化之后形成了FeCN。使用紫外-可见吸收光谱表征MB-发夹/AuNPs偶联物的形成(图2B)。10nm AuNPs的吸附峰为518nm(图2B，黑色曲线)。发夹探针修饰AuNPs后，由于发夹DNA与AuNPs偶联导致AuNP直径增大，导致表面等离子体共振峰从518微移至522nm(图2B，红色曲线)。值得注意的是，一个新的吸收峰出现在260nm处，这是DNA碱基双键的特征吸收峰，表明MB-hairpin/AuNPs偶联物的形成。图2C展示了合成的掺入少量铁纳米颗粒的FeCN的透射电子显微镜(TEM)图像。此外，还用透射电镜研究了AuNPs的形貌。形状均匀，平均直径13nm(图2D)。
2、原理的实验验证
为了证明本技术方案的可行性，本实施例通过电化学阻抗谱(EIS)来表征了修饰电极在5毫摩尔每升[Fe(CN)6]3-/4-溶液中不同阶段的电化学行为。当FeCN包覆在GCE上时，由于FeCN的良好导电性，与裸玻碳电极(GCE)(图3A，曲线a)相比，电子转移电阻(Ret)降低至22Ω(图3A，曲线b)。当环糊精(β-CD)组装到FeCN/GCE上时，电子转移电阻(Ret)进一步降低到50Ω(图3A，曲线c)。在β-CD/FeCN/GCE表面上组装与1U每毫升UDG反应的MB-hairpin/AuNPs探针后(图3A，曲线d)，Ret增加到560Ω，因为DNA的带负电的磷酸骨架静电排斥带负电的氧化还原探针[Fe(CN)6]3-/4-减弱了电子转移。
利用示差脉冲伏安法(DPV)探讨了不同修饰电极的生物传感器的可行性。如图3B，当目标物UDG存在时，可以观察到一个大的MB峰值电流(图3B，曲线b)，但在缺乏UDG的情况下，没有检测到电化学信号(图3B，曲线a)。值得注意的是，电化学信号的放大(图3B，曲线b)最初来源于在不添加H2O2的前提下，FeCN对MB的电催化还原。当加入半胱氨酸在电解液中，MB的DPV峰值电流进一步增大(图3B，曲线c)，这可以解释为具有巯基结构的L-半胱氨酸被O2氧化释放H2O2，促进FeCN对电子介质MB的催化氧化，产生放大的电化学信号。相比之下，在缺乏β-CD的情况下，因为没有β-CD，MB不能通过主-客体相互作用聚集在电极上，在UDG存在的情况下电化学信号也极低(图3B，曲线d)。
3、实验条件优化
为了实现最佳的检测性能，优化FeCN和β-CD的浓度以及UDG与生物传感器孵育时间等实验条件(图4)。如图4A所示，随着FeCN的浓度从0.5增加到2毫克每毫升，电化学峰值电流随之增强，当浓度大于2毫克，电流值减小，因为高浓度的FeCN可能引起FeCN从电极上掉落。因此，在后续实验中使用2毫克每毫升FeCN。进一步研究了β-CD浓度对分析性能的影响(图4B)。峰值电流随着β-CD的浓度从0.5增加到2毫摩尔每升增强，当浓度超过2毫摩尔每升时，由于饱和的主-客体相互作用和β-CD不导电导致电子转移阻碍，电流值降低。因此，2毫摩尔每升β-CD用于后续研究。此外，优化了生物传感器一步检测UDG的孵育时间(图4C)。随着孵育时间从40min到80min的变化，电流值随着孵育时间的增加而迅速增强，在80min以上趋于平稳，因此在后续的研究中选择80min作为最佳孵育时间
4、灵敏度和选择性实验
为了评估本技术方案检测UDG的灵敏度，在最佳实验条件下，在含10毫摩尔每升半胱氨酸的0.1摩尔每升PBS(pH为7.4)中测量了不同浓度UDG对DPV电流的影响(图5A)。示差脉冲伏安法(DPV)信号随着UDG浓度从0.0005到1U每毫升的增加而增强，在DPV电流的变化与UDG浓度(0.0005U每毫升到1U每毫升)的对数之间获得了良好的线性关系。相应的方程为I＝1.329+0.2836log10C，相关系数为0.9767(图5B)，其中I为电流强度，C为UDG浓度(U每毫升)。基于空白响应的3倍标准偏差，该生物传感器的检测限被计算为7.413×10-5U每毫升，优于所报道的UDG测定方法，比荧光法高27倍，比比色法高270倍，比电化学法高107倍。本技术方案的高灵敏度可归因为三个因素：(1)由于发夹dna的茎环结构和AuNPs的立体效应，MB和β-CD之间发生超分子主客体反应导致极低的背景；(2)模拟过氧化物酶FeCN在较宽的pH和温度范围内具有良好的电催化活性和稳定性；(3)L-半胱氨酸被O2转化为L-胱氨酸(RSSR)，同时释放H2O2，促进FeCN对MB的催化氧化，产生放大的电化学信号。
为了评估本技术方案检测UDG的特异性，本实施例使用牛血清白蛋白(BSA)、人烷基腺嘌呤DNA糖化酶(hAAG)、甲酰胺嘧啶DNA糖化酶(FPG)作为阴性对照，评价检测的特异性。BSA不能识别和去除DNA底物中的尿嘧啶。hAAG可以切除烷基化腺嘌呤生成无尿嘧啶位点，FPG可以切除4，6-二氨基-5-甲酰胺嘧啶、8-羟基鸟嘌呤、2，6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺嘧啶，但不能切割本研究所用的DNA底物。如图5C所示，目标物UDG检测到高电化学信号，而0.01毫克每毫升BSA、1U每毫升hAAG、1U每毫升FPG检测到的电流响应可以忽略不计。实验结果表明，本技术方案对UDG具有较好的特异性。
5、电化学生物传感器的重现性和稳定性实验
在1U每毫升UDG存在下，通过6次连续实验研究了该电化学生物传感器的重复性。相对标准偏差(RSD)为1.6％，表明该电化学生物传感器具有良好的重复性。此外，在测试后，电极经过抛光和清洗后，在相同的条件下，电流信号较之前的响应变化5.8％，表明该电化学生物传感器具有良好的稳定性和再生能力。
6、UDG抑制剂实验
为了验证所提出的用于UDG抑制实验的电化学生物传感器的可行性，使用尿嘧啶糖基酶抑制剂(UGI)作为模型抑制剂。UGI可以以1:1摩尔的化学计量比与UDG结合形成紧密的、生理上不可逆的复合物。UDG的相对活性(RA)根据
7、生物样品实验
为了评估本技术方案所提出的生物传感器对真实复杂生物样品分析的能力，本实施例使用HeLa细胞作为检测细胞UDG活性的模型。如图7所示，峰值电流与HeLa细胞数的对数呈线性相关，范围为5～10000个细胞，线性方程为I＝0.7468log10N-0.4502，相关系数为0.9931，其中I为电流强度，N为HeLa细胞数。基于空白响应的3倍标准偏差，确定检测限为5个细胞。这些结果清楚地表明该电化学生物传感器可用于细胞UDG活性的定量检测，在临床诊断中具有很大的应用潜力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种检测碱基切除修复酶的电化学生物传感器及其制备方法与应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
uuugucugug aaggaggtag atcacagaca aa 32