阅读说明：本技术 一种基于锌和钼共掺杂钒酸铋阵列的光电化学己烯雌酚传感器的制备方法 (Preparation method of photoelectrochemical diethylstilbestrol sensor based on zinc and molybdenum co-doped bismuth vanadate array ) 是由 钱彦荣 魏琴 鞠熀先 冯金慧 任祥 王雪莹 范大伟 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于锌和钼共掺杂的钒酸铋阵列的光电化学己烯雌酚传感器的制备方法及应用。本发明具体是将锌和钼共掺杂的钒酸铋阵列作为基底材料电沉积在氧化铟锡导电玻璃上,锌和钼共掺杂的钒酸铋的蠕虫状多孔结构具有大的表面积可增加光的捕获和生物分子的负载,同时,锌和钼元素的掺杂可加入额外的电子,促进光生电子空穴的分离效率；制备的锰铁氰化合物是一种对过氧化氢具有催化功能的金属无机框架材料,将其作为竞争标记物；基于此,本体系以过氧化氢作为电子供体,构建了一种基于减弱型信号竞争策略的光电化学传感器,实现了对己烯雌酚的灵敏检测,该方法对早期诊断和监测自身免疫性疾病具有重要意义。(The invention relates to a preparation method and application of a photoelectrochemical diethylstilbestrol sensor based on a zinc and molybdenum co-doped bismuth vanadate array. The zinc and molybdenum co-doped bismuth vanadate array is used as a substrate material to be electrodeposited on indium tin oxide conductive glass, a worm-shaped porous structure of the zinc and molybdenum co-doped bismuth vanadate has a large surface area, so that light capture and biomolecule load can be increased, and additional electrons can be added in the doping of zinc and molybdenum elements to promote the separation efficiency of photo-generated electron holes; the prepared manganese ferricyanide compound is a metal inorganic framework material with a catalytic function on hydrogen peroxide, and is used as a competitive marker; based on the method, hydrogen peroxide is used as an electron donor, a photoelectrochemical sensor based on a weakening signal competition strategy is constructed, sensitive detection on diethylstilbestrol is realized, and the method has important significance for early diagnosis and monitoring of autoimmune diseases.)

一种基于锌和钼共掺杂钒酸铋阵列的光电化学己烯雌酚传感 器的制备方法

技术领域

本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，具体将锌和钼共掺杂的钒酸铋作为基底材料，金纳米颗粒/锰铁氰化合物复合物作为竞争标记物，构建了检测己烯雌酚的光电化学传感器的制备方法。

背景技术

己烯雌酚是一种合成型***化合物，广泛用于家畜生产、水产养殖和预防妊娠并发症的临床药物中，研究证明，暴露于己烯雌酚的普通人群会增加患自身免疫性疾病和癌症的风险。由于其潜在的毒性和稳定性，其已经被确定为一种由环境引起的内分泌干扰物质。目前，对于己烯雌酚的检测方法有很多，比如酶联免疫吸附法、电化学分析、毛细管电泳技术等方法，但上述方法具有操作复杂、仪器昂贵、耗时等劣势，因此本发明发展的是一种操作简便、价格低廉、灵敏度高的检测方法。本发明构建的光电化学传感器是一种利用光电活性物质的光电转换性质确定待分析物浓度的装置，因其检测信号是电信号，激发信号是光源，实现了激发信号与检测信号的分离，具有较低的背景信号和较高的灵敏度，且其制备简便、成本较低，因此在食品分析、环境检测、水质分析、生物分析等领域应用广泛。

光活性材料是光电化学传感器关键组成部分。作为一种性能优良的光电转换半导体材料，钒酸铋因较窄的带隙（2.4 eV）被广泛应用于光催化、燃料电池等领域，然而较差的电荷分离效率和电荷转移能力限制了它的应用。因此，在本项发明中，通过电沉积和煅烧的方法制备钒酸铋并对其进行锌和钼元素共掺杂，这不仅可调控钒酸铋的电子结构，还能形成局部内置电场，利于电荷的分离。形成的蠕虫状钒酸铋纳米结构具有大的表面积，利于负载生物分子。另外，将制备的过氧化物模拟酶锰铁氰化合物作为竞争标记物可以催化过氧化氢，使传感器摆脱了传统的酶传感器对环境要求高、花费高等劣势，提高光电化学传感器的灵敏度。

发明内容

本发明的目的之一是分别合成锌和钼元素共掺杂的钒酸铋，利用元素的掺杂，在钒酸铋阵列中形成一个内置电场，提高钒酸铋的电荷分离，促进光生电子的转移，提高光电转换效率。

本发明目的之二是合成锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物，金氨键与信号抗体结合，形成锰铁氰化合物及金纳米颗粒生物共轭物。

本发明目的之三是以锌和钼元素共掺杂钒酸铋阵列作为光活性基底材料，以锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物作为信号标记物，构建竞争型光电化学免疫传感器，并且用于己烯雌酚的快速、灵敏检测。

本发明的技术方案如下：

1. 一种基于锌和钼共掺杂的钒酸铋的光电化学己烯雌酚传感器的制备方法，制备步骤如下：

制备锌和钼共掺杂的钒酸铋；锌和钼共掺杂的钒酸铋的制备方法如下所示：首先，碘氧铋纳米片电沉积在氧化铟锡玻璃上，具体步骤如下：将0.04 ~ 0.08 mol/L 硝酸铋溶于50mL 0.4~0.8 mol/L 碘化钾溶液中，用浓硝酸调上述溶液pH至1.4 ~ 1.7，然后将20 mL0.23 mol/L对苯醌溶液逐滴加入上述溶液中，该溶液作为电沉积的电解液；电沉积过程在以氧化铟锡玻璃为工作电极，铂电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极的三电极体系中进行，设置阴极偏压为-0.1 V，沉积时间为3~5 min，得到碘氧铋纳米片；然后，将4 µL含摩尔比分别为0.5~3%和3~5%的乙酰丙酮钼和乙酰丙酮锌的0.2 mol/L乙酰丙酮钒溶液滴于电沉积的碘氧铋纳米片上，将上述制备的工作电极煅烧450 ℃ 2 h，用1 mol/L 氢氧化钠溶液将多余的五氧化二矾清除，得到锌和钼共掺杂钒酸铋纳米阵列；制备的锌和钼共掺杂钒酸铋阵列具有较大的表面积，利于负载生物分子，使对可见光的吸收面积变大，同时锌和钼的掺杂使内部形成一个内置电场，促进了电子转移，提高光电转换效率。

2.制备锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物检测抗体孵化物溶液；金纳米颗粒的制备如下所示：50-55 mL 质量分数为0.01% 氯金酸溶液，120 ℃油浴中煮沸，2.5-5.0 mL质量分数为1 %的柠檬酸三钠溶液加入上述溶液，搅拌下继续煮沸30 min至溶液变***，制得金纳米颗粒溶液；制备的金纳米颗粒粒径均匀，有利于生物分子的连接。

3.锰铁氰化合物的制备过程如下：0.3~0.8 g 聚乙烯吡咯烷酮溶于10 mL无水乙醇和10 mL蒸馏水的混合溶液中，将0.04 ~ 0.08 g乙酸锰溶于上述溶液，称之为溶液A；将0.06 - 0.1 g的铁***溶于10 mL乙醇和10 mL蒸馏水的混合溶液中，称之为溶液B；将溶液B缓慢逐滴加入溶液A中，将上述混合液在室温下静置24 h，离心并用蒸馏水和乙醇洗涤数次，在60 ℃下真空干燥；制备的锰铁氰化合物是一种过氧化氢模拟酶，对过氧化氢具有较好的催化作用，可以消耗作为电子供体的过氧化氢；

首先，进行铁氰化合物的氨基化，将18 mg 锰铁氰化合物分散在含0.15 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的10 mL乙醇溶液，悬浮液回流90 ℃ 24 h，冷却至室温后上述溶液用乙醇离心洗涤，获得氨基化的铁氰化合物；将10 mL 金纳米颗粒溶液与氨基化铁氰化合物振荡过夜，离心水洗得到锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物；

2 mL 10 µg/mL己烯雌酚抗体溶液和10 µL 5 mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和10 µL 1 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺4 ℃下振荡30 min，然后将3 mg锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物加入上述溶液4 ℃振荡6 h，最后将100 µL质量分数为0.1-1 %牛血清白蛋白注入上述溶液振荡12 h，用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液离心清洗3次，并分散于2 mLpH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中。

4. 制备信号减弱型光电化学免疫传感器：将2.5 cm × 0.8 cm的氧化铟锡导电玻璃依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min，氮气吹干；将锌和钼共掺杂的钒酸铋电沉积在干净的氧化铟锡玻璃的导电面上，作为工作电极；继续滴加4 µL 3 mmol/L巯基乙酸到电极表面以固定牛血清蛋白包裹的己烯雌酚，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗；继续滴加3 µL1×10^-2 mol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和2×10^-3 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液以活化羧基，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗；继续滴加5 µL 1 µg/mL牛血清蛋白包覆的己烯雌酚滴加电极表面，4 ℃冰箱中晾干，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗；继续滴加5 µL 质量分数为0.1~1.0 % 牛血清白蛋白溶液到修饰电极表面，以封闭电极表面上未结合的非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，pH 7.4的磷酸盐冲洗；继续滴加5 µL 0.1 pg/m ~ 20 ng/mL己烯雌酚标准溶液和用锰铁氰化合物及及金纳米颗粒复合物标记的己烯雌酚抗体的混合溶液到电极表面，4 ℃冰箱中晾干，pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗，制得修饰完全的工作电极，即一种检测己烯雌酚的竞争型光电化学免疫传感器。

5. 所述的检测己烯雌酚竞争型光电化学免疫传感器检测步骤如下：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，如权利要求1所制备的氧化铟锡修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在10 mL 含0.1 mol/L过氧化氢的pH 7.4磷酸盐溶液中进行测试；用时间-电流法对分析物进行检测，运行时间100 s，照射LED灯波长为400 ~ 450 nm；

当背景电流趋于稳定后，每隔10 s开灯持续照射10 s，记录光电流，绘制工作曲线；将待测己烯雌酚样品溶液代替己烯雌酚标准溶液进行检测，结果可通过工作曲线查得。

本发明的有益成果

1.本发明合成的锌和钼共掺杂的钒酸铋阵列，提高光生电荷分离能力和载流子密度，同时蠕虫状纳米结构具有大的比表面积可以增加生物分子的负载量，显著提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；同时锌和钼的共掺杂在钒酸铋阵列中形成了一个内置电场，可以促进电子的转移，提高光电化学的转换效率。

2.本发明合成锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物，构建信号减弱型光电化学免疫传感器；锰铁氰化合物作为一种金属有机框架材料，具有过氧化物酶活性的模拟酶，可与基底材料竞争作为电子供体的过氧化氢，构建一种信号减弱型的光电化学竞争型免疫传感器。

3. 本发明利用纳米复合材料锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物直接与己烯雌酚抗体结合，构建无酶免疫传感器，避免因为酶的失活或泄露引起检测误差；同时利用锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物实现信号减弱，极大提高了光电化学传感器的检测灵敏度，具有重要的科学意义和应用价值。

4. 本发明制备的信号减弱型光电化学免疫传感器，用于己烯雌酚的检测，响应时间短，稳定性好，可以实现对己烯雌酚的简单、快速、高灵敏和特异性检测。

具体实施方式

现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此

实施例1

一种基于锌和钼共掺杂的钒酸铋的光电化学己烯雌酚传感器的制备方法，制备步骤如下：

1.制备锌和钼共掺杂的钒酸铋阵列；锌和钼共掺杂的钒酸铋的制备方法如下所示：首先，碘氧铋纳米片电沉积在氧化铟锡玻璃上，具体步骤如下：将0.04 mol/L 硝酸铋溶于50mL 0.4 mol/L 碘化钾溶液中，用浓硝酸调上述溶液pH至1.4，然后将20 mL 0.23 mol/L对苯醌溶液逐滴加入上述溶液中，该溶液作为电沉积的电解液；电沉积过程在以氧化铟锡玻璃为工作电极，铂电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极的三电极体系中进行，设置阴极偏压为-0.1 V，沉积时间为3 min，得到碘氧铋纳米片；然后，将4 µL含摩尔比分别为0.5%和3 %的乙酰丙酮钼和乙酰丙酮锌的0.2 mol/L乙酰丙酮钒溶液滴于电沉积的碘氧铋纳米片上，将上述制备的工作电极煅烧450 ℃ 2 h，用1 mol/L 氢氧化钠溶液将多余的五氧化二矾清除，得到锌和钼共掺杂的钒酸铋纳米结构；

2. 制备锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物检测抗体孵化物溶液；金纳米颗粒的制备如下所示：50 mL 质量分数为0.01 % 氯金酸溶液，120 ℃油浴中煮沸，2.5-5.0 mL质量分数为1 %的柠檬酸三钠溶液加入上述溶液，搅拌下继续煮沸30 min至溶液变***，制得金纳米颗粒溶液；

锰铁氰化合物的制备过程如下：0.3 g 聚乙烯吡咯烷酮溶于10 mL无水乙醇和10 mL蒸馏水的混合溶液中，将0.04 ~ 0.08 g乙酸锰溶于上述溶液，称之为溶液A；将0.06 g的铁***溶于10 mL乙醇和10 mL蒸馏水的混合溶液中，称之为溶液B；将溶液B缓慢逐滴加入溶液A中，将上述混合液在室温下静置24 h，离心并用蒸馏水和乙醇洗涤数次，在60 ℃下真空干燥；

首先，进行铁氰化合物的氨基化，将18 mg 锰铁氰化合物分散在含0.15 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的10 mL乙醇溶液，悬浮液回流90 ℃ 24 h，冷却至室温后上述溶液用乙醇离心洗涤，获得氨基化的铁氰化合物；将10 mL 金纳米颗粒溶液与氨基化铁氰化合物振荡过夜，离心水洗得到锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物；

2 mL 10 µg/mL己烯雌酚抗体溶液和10 µL 5 mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和10 µL 1 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺4 ℃下振荡30 min，然后将3 mg锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物加入上述溶液4 ℃振荡6 h，最后将100 µL质量分数为0.1 %牛血清白蛋白注入上述溶液振荡12 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液离心清洗3次，并分散于2 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中；

3. 制备信号减弱型光电化学免疫传感器；将2.5 cm × 0.8 cm的氧化铟锡导电玻璃依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min，氮气吹干；将锌和钼共掺杂的钒酸铋电沉积在干净的氧化铟锡玻璃的导电面上，作为工作电极；继续滴加4 µL 3 mmol/L巯基乙酸到电极表面以固定牛血清蛋白包裹的己烯雌酚，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗；继续滴加3 µL 1×10^-2 mol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和2×10^-3 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液以活化羧基，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗；继续滴加5 µL 1 µg/mL牛血清蛋白包覆的己烯雌酚滴加电极表面，4 ℃冰箱中晾干，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗；继续滴加5 µL质量分数为0.1 % 牛血清白蛋白溶液到修饰电极表面，以封闭电极表面上未结合的非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，pH 7.4的磷酸盐冲洗；继续滴加5 µL 0.1 pg/m ~ 20ng/mL己烯雌酚标准溶液和用锰铁氰化合物及及金纳米颗粒复合物标记的己烯雌酚抗体的混合溶液到电极表面，4 ℃冰箱中晾干，pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗，制得修饰完全的工作电极，即一种检测己烯雌酚的竞争型光电化学免疫传感器；

4. 所述的检测己烯雌酚竞争型光电化学免疫传感器检测步骤如下：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，如权利要求1所制备的氧化铟锡修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在10 mL含0.1 mol/L过氧化氢的pH 7.4磷酸盐溶液中进行测试；用时间-电流法对分析物进行检测，运行时间100 s，照射LED灯波长为400nm；当背景电流趋于稳定后，每隔10 s开灯持续照射10 s，记录光电流，绘制工作曲线；将待测己烯雌酚样品溶液代替己烯雌酚标准溶液进行检测，结果可通过工作曲线查得。

实施例2

一种基于锌和钼共掺杂钒酸铋阵列的光电化学己烯雌酚传感器的制备方法，制备步骤如下：

1.制备锌和钼共掺杂的钒酸铋阵列；锌和钼共掺杂的钒酸铋的制备方法如下所示：首先，碘氧铋纳米片电沉积在氧化铟锡玻璃上，具体步骤如下：将0.05 mol/L 硝酸铋溶于50mL 0.5 mol/L 碘化钾溶液中，用浓硝酸调上述溶液PH至1.5，然后将20 mL 0.23 mol/L对苯醌溶液逐滴加入上述溶液中，该溶液作为电沉积的电解液；电沉积过程在以氧化铟锡玻璃为工作电极，铂电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极的三电极体系中进行，设置阴极偏压为-0.1 V，沉积时间为3~5 min，得到碘氧铋纳米片；然后，将4 µL含摩尔比分别为1%和4 %的乙酰丙酮钼和乙酰丙酮锌的0.2 mol/L乙酰丙酮钒溶液滴于电沉积的碘氧铋纳米片上，将上述制备的工作电极煅烧450 ℃ 2 h，用1 mol/L 氢氧化钠溶液将多余的五氧化二矾清除，得到锌和钼共掺杂钒酸铋纳米阵列；

2. 制备锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物检测抗体孵化物溶液；金纳米颗粒的制备如下所示：51 mL 质量分数为0.01 % 氯金酸溶液，120 ℃油浴中煮沸，3 mL质量分数为1 %的柠檬酸三钠溶液加入上述溶液，搅拌下继续煮沸30 min至溶液变***，制得金纳米颗粒溶液；

锰铁氰化合物的制备过程如下：0.3~0.8 g 聚乙烯吡咯烷酮溶于10 mL无水乙醇和10mL蒸馏水的混合溶液中，将0.05 g乙酸锰溶于上述溶液，称之为溶液A；将0.07 g的铁***溶于10 mL乙醇和10 mL蒸馏水的混合溶液中，称之为溶液B；将溶液B缓慢逐滴加入溶液A中，将上述混合液在室温下静置24 h，离心并用蒸馏水和乙醇洗涤数次，在60 ℃下真空干燥；

首先，进行铁氰化合物的氨基化，将18 mg 锰铁氰化合物分散在含0.15 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的10 mL乙醇溶液，悬浮液回流90 ℃ 24 h，冷却至室温后上述溶液用乙醇离心洗涤，获得氨基化的铁氰化合物；将10 mL 金纳米颗粒溶液与氨基化铁氰化合物振荡过夜，离心水洗得到锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物；

2 mL 10 µg/mL己烯雌酚抗体溶液和10 µL 5 mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和10 µL 1 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺4 ℃下振荡30 min，然后将3 mg锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物加入上述溶液4 ℃振荡6 h，最后将100 µL质量分数为0.3 %牛血清白蛋白注入上述溶液振荡12 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液离心清洗3次，并分散于2 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中；

3. 制备信号减弱型光电化学免疫传感器；将2.5 cm × 0.8 cm的氧化铟锡导电玻璃依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min，氮气吹干；将锌和钼共掺杂的钒酸铋电沉积在干净的氧化铟锡玻璃的导电面上，作为工作电极；继续滴加4 µL 3 mmol/L巯基乙酸到电极表面以固定牛血清蛋白包裹的己烯雌酚，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗；继续滴加3 µL 1×10^-2 mol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和2×10^-3 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液以活化羧基，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗；继续滴加5 µL 1 µg/mL牛血清蛋白包覆的己烯雌酚滴加电极表面，4 ℃冰箱中晾干，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗；继续滴加5 µL、质量分数为0.3 % 牛血清白蛋白溶液到修饰电极表面，以封闭电极表面上未结合的非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，pH为7.4的磷酸盐冲洗；继续滴加5 µL 0.1 pg/m ~20 ng/mL己烯雌酚标准溶液和用锰铁氰化合物及及金纳米颗粒复合物标记的己烯雌酚抗体的混合溶液到电极表面，4 ℃冰箱中晾干，pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗，制得修饰完全的工作电极，即一种检测己烯雌酚的竞争型光电化学免疫传感器；

4. 所述的检测己烯雌酚竞争型光电化学免疫传感器检测步骤如下：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，如权利要求1所制备的氧化铟锡修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在10 mL含0.1 mol/L过氧化氢的pH 7.4磷酸盐溶液中进行测试；用时间-电流法对分析物进行检测，运行时间100 s，照射LED灯波长为410nm；当背景电流趋于稳定后，每隔10 s开灯持续照射10 s，记录光电流，绘制工作曲线；将待测己烯雌酚样品溶液代替己烯雌酚标准溶液进行检测，结果可通过工作曲线查得。

实施例3

一种基于锌和钼共掺杂钒酸铋阵列的光电化学己烯雌酚传感器的制备方法，制备步骤如下：

1.制备锌和钼共掺杂的钒酸铋阵列；锌和钼共掺杂的钒酸铋的制备方法如下所示：首先，碘氧铋纳米片电沉积在氧化铟锡玻璃上，具体步骤如下：将0.08 mol/L 硝酸铋溶于50mL 0.8 mol/L 碘化钾溶液中，用浓硝酸调上述溶液PH至1.7，然后将20 mL 0.23 mol/L对苯醌溶液逐滴加入上述溶液中，该溶液作为电沉积的电解液；电沉积过程在以氧化铟锡玻璃为工作电极，铂电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极的三电极体系中进行，设置阴极偏压为-0.1 V，沉积时间为5 min，得到碘氧铋纳米片；然后，将4 µL含摩尔比分别为3 %和5 %的乙酰丙酮钼和乙酰丙酮锌的0.2 mol/L乙酰丙酮钒溶液滴于电沉积的碘氧铋纳米片上，将上述制备的工作电极煅烧450 ℃ 2 h，用1 mol/L 氢氧化钠溶液将多余的五氧化二矾清除，得到锌和钼共掺杂的钒酸铋纳米阵列；

2. 制备锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物检测抗体孵化物溶液；金纳米颗粒的制备如下所示： 55 mL 质量分数为0.01 % 氯金酸溶液，120 ℃油浴中煮沸， 5.0 mL质量分数为1 %的柠檬酸三钠溶液加入上述溶液，搅拌下继续煮沸30 min至溶液变***，制得金纳米颗粒溶液；

锰铁氰化合物的制备过程如下： 0.8 g 聚乙烯吡咯烷酮溶于10 mL无水乙醇和10 mL蒸馏水的混合溶液中，将0.08 g乙酸锰溶于上述溶液，称之为溶液A；将0.1 g的铁***溶于10 mL乙醇和10 mL蒸馏水的混合溶液中，称之为溶液B；将溶液B缓慢逐滴加入溶液A中，将上述混合液在室温下静置24 h，离心并用蒸馏水和乙醇洗涤数次，在60 ℃下真空干燥；

首先，进行铁氰化合物的氨基化，将18 mg 锰铁氰化合物分散在含0.15 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的10 mL乙醇溶液，悬浮液回流90 ℃ 24 h，冷却至室温后上述溶液用乙醇离心洗涤，获得氨基化的铁氰化合物；将10 mL 金纳米颗粒溶液与氨基化铁氰化合物振荡过夜，离心水洗得到锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物；

2 mL 10 µg/mL己烯雌酚抗体溶液和10 µL 5 mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和10 µL 1 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺4 ℃下振荡30 min，然后将3 mg锰铁氰化合物及金纳米颗粒复合物加入上述溶液4 ℃振荡6 h，最后将100 µL质量分数为1 %牛血清白蛋白注入上述溶液振荡12 h，用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液离心清洗3次，并分散于2 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中；

3. 制备信号减弱型光电化学免疫传感器；将2.5 cm × 0.8 cm的氧化铟锡导电玻璃依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min，氮气吹干；将锌和钼共掺杂的钒酸铋电沉积在干净的氧化铟锡玻璃的导电面上，作为工作电极；继续滴加4 µL 3 mmol/L巯基乙酸到电极表面以固定牛血清蛋白包裹的己烯雌酚，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗；继续滴加3 µL 1×10^-2 mol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和2×10^-3 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液以活化羧基，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗；继续滴加5 µL 1 µg/mL牛血清蛋白包覆的己烯雌酚滴加电极表面，4 ℃冰箱中晾干，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗；继续滴加5 µL质量分数为1.0 % 牛血清白蛋白溶液到修饰电极表面，以封闭电极表面上未结合的非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，pH为7.4的磷酸盐冲洗；继续滴加5 µL 0.1 pg/m ~ 20ng/mL己烯雌酚标准溶液和用锰铁氰化合物及及金纳米颗粒复合物标记的己烯雌酚抗体的混合溶液到电极表面，4 ℃冰箱中晾干，pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗，制得修饰完全的工作电极，即一种检测己烯雌酚的竞争型光电化学免疫传感器；

4. 所述的检测己烯雌酚竞争型光电化学免疫传感器检测步骤如下：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，如权利要求1所制备的氧化铟锡修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在10 mL含0.1 mol/L过氧化氢的pH 7.4磷酸盐溶液中进行测试；用时间-电流法对分析物进行检测，运行时间100 s，照射LED灯波长为450nm；当背景电流趋于稳定后，每隔10 s开灯持续照射10 s，记录光电流，绘制工作曲线；将待测己烯雌酚样品溶液代替己烯雌酚标准溶液进行检测，结果可通过工作曲线查得。