一种基于碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属构建的电化学免疫传感器的制备及应用
阅读说明：本技术 一种基于碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属构建的电化学免疫传感器的制备及应用 (Preparation and application of electrochemical immunosensor constructed based on carbon sphere loaded molybdenum disulfide doped copper rhodium bimetal ) 是由 鞠熀先 丁慧 魏琴 贾洪英 邵明月 范大伟 孙旭 曹伟 王雪莹 匡轩 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属构建的免疫传感器的制备及应用,属于纳米材料和电化学分析技术领域。采用铜铑双金属改性的碳球负载二硫化钼制备电化学免疫传感器,用于降钙素原的灵敏检测。(The invention relates to preparation and application of an immunosensor constructed based on carbon sphere loaded molybdenum disulfide doped copper rhodium bimetal, and belongs to the technical field of nano materials and electrochemical analysis. The electrochemical immunosensor is prepared by adopting copper-rhodium bimetallic modified carbon spheres loaded with molybdenum disulfide and is used for sensitive detection of procalcitonin.)
技术领域
本发明涉及一种基于碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属构建的电化学免疫传感器的制备和应用，属于纳米材料和电化学分析领域。
背景技术
降钙素原（procalcitonin, PCT）是甲状腺C细胞分泌的一种蛋白质，PCT在人体中的浓度反映了全身炎症反应的活跃程度，是炎症的敏感生物标志物。当机体存在严重感染、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，PCT含量升高。在临床检测中，当血清中PCT浓度超过0.5 ng/mL时，强烈推荐使用抗生素治疗。血清中PCT含量对脓毒症的诊断也有指导作用，PCT高于2ng/mL表示患者已经感染了脓毒症。因此，准确检测血清中PCT对脓毒症的早期诊断至关重要，对进一步指导治疗具有重要意义，如何实现对降钙素原高效准确的检测是目前亟待解决的问题。
电化学分析法由于具有灵敏度高、特异性强、操作简便、易于小型化等优点而受到广泛关注。近年来，将电化学分析法和生物免疫传感器技术相结合的电化学免疫传感器的基本原理是基于抗原抗体之间的特异性识别，其具有响应速度快、成本低等优点。因此，具有良好的发展应用前景。
本发明制备了一种基于碳球负载二硫化钼的电化学免疫传感器，采用碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属作为传感器平台构建了一种无标记型电化学免疫传感器，并且将其用于降钙素原的检测。二硫化钼是一种典型的层状结构，每个钼原子的周围包被有六个硫原子，呈现出三角棱柱状，其棱面也可作为催化活性中心。研究表明，二硫化钼在边缘平面上具有高表面能的催化活性位点。由于二硫化钼具有高度的电催化活性和与原子氢的结合能，被认为是铂族催化剂潜在的理想替代物。此外，二硫化钼可以有效地与其它纳米材料结合，表现出优异的相容性。本实验中通过水热合成法合成碳球负载的二硫化钼，增大了接触的比表面积，可使其具有更多的活性位点。其次，在本实验中掺杂了铜铑双金属，具有协同效应，对过氧化氢显示出更好的催化效果。本发明所制备的碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属复合材料具有以下优点：碳球负载的二硫化钼具有大的比表面积和优异的催化性能，引入的铜铑双金属可以均匀的分布在碳球负载的二硫化钼表面，通过两者之间的协同作用，加快了电子的传递速率，提高复合材料的催化活性，最终使合成的材料对过氧化氢具有优异的催化能力，而铜铑双金属也可以大大提高抗体的负载量。
本发明的目的之一是提出一种基于水热法制备碳球负载二硫化钼的方法；
本发明的目的之二是制备碳球负载二硫化钼掺杂的铜铑双金属复合材料，氨基化的材料提供更多的氨基与抗体上的羧基构建稳定的酰胺键来增加抗体的固定化；
本发明的目的之三是将基于碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属制备免疫传感器应用于血清中降钙素原的检测，氨基化的铜铑双金属可以直接与降钙素原抗体连接，不需要使用其它的连接剂，简化了实验的操作步骤，拓宽了检测降钙素原的检测限，增大了检测范围，极大的提高了检测的灵敏度。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属的电化学免疫传感器的制备方法
（1）介孔碳球的制备
1）向70~160 mL乙醇，10~50 mL水，3~15 mL氨水的混合溶液中加入3~15 mL正硅酸四乙酯，磁力搅拌15 min后，依次加入0.4~1.8 g间苯二酚和0.5~3 mL甲醛溶液，室温下搅拌24h；
2）搅拌结束后分别用超纯水和无水乙醇各洗涤三次以去除杂质，最后将收集得到的产物置于真空干燥箱中，70 ℃干燥12 h；
3）将干燥得到的产物在700 ℃氮气环境中煅烧5 h；
4）将煅烧产物用氢氧化钠溶液刻蚀后，用超纯水洗涤去除杂质后将收集得到的产物置于真空干燥箱中，70 ℃干燥12 h后得到产物介孔碳球；
（2）碳球负载二硫化钼的制备
1）向30 mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中依次加入20~60 mg介孔碳球和10~40 mg 四硫代钼酸铵，超声处理30 min；
2）继续向混合溶液中加入1~5 mL水合肼，超声处理30 min；
3）继续将溶液转移到50 mL高压反应釜中，210 ℃反应18 h；
4）反应结束后将溶液冷却到室温并用超纯水和无水乙醇各洗涤三次，收集得到的产物进行冷冻干燥；
（3）铜铑双金属的制备
1）向2~10 mL油胺和5~20 mL甲苯混合溶液中依次加入8~30 mg乙酰丙酮铑，7~25 mg乙酰丙酮铜，搅拌10 min；
2）继续向溶液中加入20~80 mg二甲基胺硼烷，搅拌20 min；
3）将上述溶液转移到50 mL高压反应釜中，190 ℃反应12 h；
4）反应结束后将溶液冷却到室温并用环己烷和无水乙醇洗涤各三次，收集所得产物并分散到2 mL水中备用；
（4）碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属复合物的制备
1）将2~8 mL铜铑双金属溶液与2 mg氨基化的碳球负载二硫化钼混合后振荡12 h，振荡结束后置于4 ℃冰箱备用；
（5）电化学免疫传感器的制备
1）依次用0.05、0.3和1.0 mm三氧化二铝粉末将玻碳电极打磨至镜面，用超纯水清洗干净；
2）将6.0 μL 0.5~2.5 mg/mL的碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属复合物溶液滴加到电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
3）继续滴加6 μL 6~12 μg/mL的降钙素原抗体修饰在电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
4）继续滴加3 μL质量分数为0.5%~2%的牛血清白蛋白溶液，封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH=7.38的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
5）分别滴加6 μL不同浓度的降钙素原修饰在电极表面，4 ℃温度下孵化1 h，用pH=7.38的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥。
2. 基于碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属复合物的电化学免疫传感器检测降钙素原的应用。
3. 电化学免疫传感器作为降钙素原检测的应用，检测步骤如下：
（1）实验过程中的测试采用三电极体系，其中饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，所构建的传感器为工作电极，整个实验在10 mL、50 mmol/L的pH 6.24~8.04磷酸盐缓冲溶液中进行；
（2）用计时电流方法检测分析物，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔90 s向10 mL、50 mmol/L的pH 6.24~8.04磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的过氧化氢溶液，记录电流变化；
（4）将待测的降钙素原样品溶液代替降钙素原标准溶液进行检测，基于碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属的电化学免疫传感器检测降钙素原，检测范围为0.001 - 100 ng/mL，检测限为1.09 pg/mL。
本发明的有益成果
（1）本发明使用了碳球负载二硫化钼作为基底，具有较大的比表面积，良好的电子传递能力，碳球负载的二硫化钼对过氧化氢具有优异的催化性能；
（2）掺杂的铜铑双金属具有良好的导电性能和生物相容性，金属之间的协同作用有利于固定大量抗体，可以极大的提高传感器的灵敏度；
（3）本发明制备了一种碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属的电化学免疫传感器并用于降钙素原的检测。反应过程简单，响应速度快，信号响应范围宽，在线性0.001-100 ng/mL范围内呈现线性，检测限为1.09 pg/mL，实现了对降钙素原的简单快速和高灵敏检测。
具体实施方案
实施例1
（1）介孔碳球的制备
1）向70 mL乙醇，10 mL水，3 mL氨水的混合溶液中加入3 mL正硅酸四乙酯，磁力搅拌15min后，依次加入0.4 g间苯二酚和0.5 mL甲醛溶液，室温下搅拌24 h；
2）搅拌结束后分别用超纯水和无水乙醇各洗涤三次以去除杂质，最后将收集得到的产物置于真空干燥箱中，70 ℃干燥12 h；
3）将干燥得到的产物在700 ℃氮气环境中煅烧5 h；
4）将煅烧产物用氢氧化钠溶液刻蚀后，用超纯水洗涤去除杂质后将收集得到的产物置于真空干燥箱中，70 ℃干燥12 h后得到产物介孔碳球；
（2）碳球负载二硫化钼的制备
1）向30 mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中依次加入20 mg介孔碳球和10 mg四硫代钼酸铵，超声处理30 min；
2）继续向混合溶液中加入1 mL水合肼，超声处理30 min；
3）继续将溶液转移到50 mL高压反应釜中，210 ℃反应18 h；
4）反应结束后将溶液冷却到室温并用超纯水和无水乙醇各洗涤三次，收集得到的产物进行冷冻干燥；
（3）铜铑双金属的制备
1）向2 mL油胺和5 mL甲苯混合溶液中依次加入8 mg乙酰丙酮铑，7 mg乙酰丙酮铜，搅拌10 min；
2）继续向溶液中加入20 mg二甲基胺硼烷，搅拌20 min；
3）将上述溶液转移到50 mL高压反应釜中，190 ℃反应12 h；
4）反应结束后将溶液冷却到室温并用环己烷和无水乙醇洗涤各三次，收集所得产物并分散到2 mL水中备用；
（4）碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属复合物的制备
1）将2 mL铜铑双金属溶液与2 mg氨基化的碳球负载二硫化钼混合后振荡12 h，振荡结束后置于4 ℃冰箱备用。
实施例2
（1）介孔碳球的制备
1）向90 mL乙醇，20 mL水，6 mL氨水的混合溶液中加入6 mL正硅酸四乙酯，磁力搅拌15min后，依次加入0.6 g间苯二酚和1 mL甲醛溶液，室温下搅拌24 h；
2）搅拌结束后分别用超纯水和无水乙醇各洗涤三次以去除杂质，最后将收集得到的产物置于真空干燥箱中，70 ℃干燥12 h；
3）将干燥得到的产物在700 ℃氮气环境中煅烧5 h；
4）将煅烧产物用氢氧化钠溶液刻蚀后，用超纯水洗涤去除杂质后将收集得到的产物置于真空干燥箱中，70 ℃干燥12 h后得到产物介孔碳球；
（2）碳球负载二硫化钼的制备
1）向30 mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中依次加入30 mg介孔碳球和20 mg四硫代钼酸铵，超声处理30 min；
2）继续向混合溶液中加入2 mL水合肼，超声处理30 min；
3）继续将溶液转移到50 mL高压反应釜中，210 ℃反应18 h；
4）反应结束后将溶液冷却到室温并用超纯水和无水乙醇各洗涤三次，收集得到的产物进行冷冻干燥；
（3）铜铑双金属的制备
1）向6 mL油胺和10 mL甲苯混合溶液中依次加入12 mg乙酰丙酮铑，12 mg乙酰丙酮铜，搅拌10 min；
2）继续向溶液中加入40 mg二甲基胺硼烷，搅拌20 min；
3）将上述溶液转移到50 mL高压反应釜中，190 ℃反应12 h；
4）反应结束后将溶液冷却到室温并用环己烷和无水乙醇洗涤各三次，收集所得产物并分散到2 mL水中备用；
（4）碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属复合物的制备
1）将4 mL铜铑双金属溶液与2 mg氨基化的碳球负载二硫化钼混合后振荡12 h，振荡结束后置于4 ℃冰箱备用。
实施例3
（1）介孔碳球的制备
1）向150 mL乙醇，50 mL水，12 mL氨水的混合溶液中加入15 mL正硅酸四乙酯，磁力搅拌15 min后，依次加入1.8 g间苯二酚和3 mL甲醛溶液，室温下搅拌24 h；
2）搅拌结束后分别用超纯水和无水乙醇各洗涤三次以去除杂质，最后收集得到的产物置于真空干燥箱中，70 ℃干燥12 h；
3）将干燥得到的产物在700 ℃氮气环境中煅烧5 h；
4）将煅烧产物用氢氧化钠溶液刻蚀后，用超纯水洗涤去除杂质后将收集得到的产物置于真空干燥箱中，70 ℃干燥12 h后得到产物介孔碳球
（2）碳球负载二硫化钼的制备
1）向30 mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中依次加入60 mg介孔碳球和40 mg四硫代钼酸铵，超声处理30 min；
2）继续向混合溶液中加入4 mL水合肼，超声处理30 min；
3）继续将溶液转移到50 mL高压反应釜中，210 ℃反应18 h；
4）反应结束后将溶液冷却到室温后离心并用超纯水和无水乙醇各洗涤三次，收集得到的产物进行冷冻干燥；
（3）铜铑双金属的制备
1）向10 mL油胺和20 mL甲苯混合溶液中依次加入24 mg乙酰丙酮铑，24 mg乙酰丙酮铜，搅拌10 min；
2）继续向溶液中加入80 mg二甲基胺硼烷，搅拌20 min；
3）将上述溶液转移到50 mL高压反应釜中，190 ℃反应12 h；
4）反应结束后将溶液冷却到室温并用环己烷和无水乙醇洗涤各三次，收集所得产物并分散到2 mL水中备用；
（4）碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属复合物的制备
1）将8 mL铜铑双金属溶液与2 mg氨基化的碳球负载二硫化钼混合后振荡12 h，振荡结束后置于4 ℃冰箱备用。
实施例4
1. 电化学免疫传感器的制备
（1）依次用0.05、0.3和1.0 mm三氧化二铝粉末将玻碳电极打磨至镜面，用超纯水清洗干净；
（2）将6.0 μL 0.5 mg/mL的碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属复合物溶液滴加到电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
（3）继续滴加6 μL 6 μg/mL的降钙素原抗体修饰在电极表面，4º C冰箱中保存至干燥；
（4）继续滴加3 μL质量分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液，封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH=7.38的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
（5）分别滴加6 μL不同浓度的降钙素原修饰在电极表面，4 ℃温度下孵化1 h，用pH=7.38的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
2. 电化学免疫传感器检测降钙素原的应用，检测步骤如下：
（1）实验过程中的测试采用三电极体系，其中饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，所构建的传感器为工作电极，整个实验在10 mL、50 mmol/L的pH=6.24磷酸盐缓冲溶液中进行；
（2）用计时电流方法检测分析物，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔90 s向10 mL、50 mmol/L的pH=6.24磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的过氧化氢溶液，记录电流变化。
实施例5
1.电化学免疫传感器的制备
（1）依次用0.05、0.3和1.0 mm三氧化二铝粉末将玻碳电极打磨至镜面，用超纯水清洗干净；
（2）将6.0 μL 1.5 mg/mL的碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属复合物溶液滴加到电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
（3）继续滴加6 μL 10 μg/mL的降钙素原抗体修饰在电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
（4）继续滴加3 μL质量分数为1.5%的牛血清白蛋白溶液，封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH=7.38的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
（5）分别滴加6 μL不同浓度的降钙素原修饰在电极表面，4 ℃温度下孵化1 h，用pH=7.38的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
2. 电化学免疫传感器检测降钙素原的应用，检测步骤如下：
（1）实验过程中的测试采用三电极体系，其中饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，所构建的传感器为工作电极，整个实验在10 mL、50 mmol/L的pH=7.38磷酸盐缓冲溶液中进行；
（2）用计时电流方法检测分析物，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔90 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.38磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的过氧化氢溶液，记录电流变化。
实施例6
1. 电化学免疫传感器的制备
（1）依次用0.05、0.3和1.0 mm三氧化二铝粉末将玻碳电极打磨至镜面，用超纯水清洗干净；
（2）将6.0 μL 2 mg/mL的碳球负载二硫化钼掺杂铜铑双金属复合物溶液滴加到电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
（3）继续滴加6 μL 12 μg/mL的降钙素原抗体修饰在电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
（4）继续滴加3 μL质量分数为2%的牛血清白蛋白溶液，封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH=7.38的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
（5）分别滴加6 μL不同浓度的降钙素原修饰在电极表面，4 ℃温度下孵化1 h，用pH=7.38的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥；
2. 电化学免疫传感器检测降钙素原的应用，检测步骤如下：
（1）实验过程中的测试采用三电极体系，其中饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，所构建的传感器为工作电极，整个实验在10 mL、50 mmol/L的pH=8.04磷酸盐缓冲溶液中进行；
（2）用计时电流方法检测分析物，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔90 s向10 mL、50 mmol/L的pH=8.04磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的过氧化氢溶液，记录电流变化。
实施例7
实施例3和例5所述的方法对降钙素原的检测，在0.001-100 ng/mL范围内呈现线性，检测限为1.09 pg/mL，最终实现对降钙素原的简单快速、高灵敏和特异性检测。