一种检测***特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法
阅读说明：本技术 一种检测***特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法 (Preparation method of electrochemical immunosensor for detecting prostate specific antigen ) 是由 李灿鹏 梁还 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法,将玻碳电极用Al<Sub>2</Sub>O<Sub>3</Sub>抛光粉抛光成镜面,超声清洗；依次将金纳米粒子负载黑磷纳米片纳米复合材料分散液、前列腺特异性抗体、卵白蛋白溶液、前列腺特异性抗原溶液、Ab2生物探针共轭物滴加到玻碳电极表面上,并用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,制备得到夹心型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器；本发明制成电化学免疫传感器检测前列腺抗原具有较高的灵敏度、较宽的检测范围、较快的检测速度、较低的检出限以及操作方便等优点。(The invention provides a preparation method of an electrochemical immunosensor for detecting prostate specific antigen, which uses Al for a glassy carbon electrode 2 O 3 Polishing the polishing powder into a mirror surface, and ultrasonically cleaning; sequentially dripping gold nanoparticle-loaded black phosphorus nanosheet nanocomposite dispersion liquid, a prostate specific antibody, an ovalbumin solution, a prostate specific antigen solution and an Ab2 bioprobe conjugate onto the surface of a glassy carbon electrode, and washing the surface of the electrode by using a phosphate buffer solution with the pH value of 7.2 to prepare the sandwich type electrochemical immunosensor for detecting the prostate specific antigen; the electrochemical immunosensor prepared by the invention has the advantages of higher sensitivity, wider detection range, higher detection speed, lower detection limit, convenient operation and the like.)
技术领域
本发明涉及功能性纳米复合材料、免疫分析和生物传感技术领域，具体涉及一种检测***特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法。
背景技术
***癌是男性***常见的恶性肿瘤之一，严重影响了患者的生活质量，甚至威胁了患者的生命。通过特异性和敏感性的生物标志物和分析工具进行早期的诊断，可以降低***癌发生率，能有效的提高生存率。因此，可以通过检测***特异性抗原的含量以及量的变化来判断***癌的性质以及状态，在医学上通过在血清中对***特异性抗原进行定量检测，对***癌的早期诊断成为目前临床上关注的焦点。将电化学法和免疫法结合制成电化学免疫传感器来检测***抗原的方法具有较高的灵敏度、较低的价格、较快的检测速度以及特殊的选择性和操作方便等优点，已成为检测疾病标记物的重要方法。
目前放射性免疫分析和色谱分析等技术已报道用于检测血清样品中经过样品处理的***抗原。放射性免疫分析方法具有快速、灵敏、特异性强、简便实用、成本低廉等优点。其主要的缺点是存在着防护及防止污染的问题，且试剂盒使用时间短，可测量范围相对狭窄，难以实现操作及测量的自动化等。色谱分析用于***特异性抗原的分析测定具有分析速度快，样品用量少等优点，但检测过程费时且处理时间长。表面等离子荧光法、表面增强拉曼光谱等技术的应用使***抗原检测得到了进一步发展。然而这些方法不仅需要昂贵试剂盒自动化仪器，而且操作复杂、耗时长。
电化学免疫传感器是基于抗原和抗体特异性结合的一种分析方法，具有检测迅速、检出限低、灵敏度高、操作简单和制备成本低的优点。近年来，电化学免疫传感器备受关注，被广泛应用于肿瘤标志物的检测中。
发明内容
针对当前***特异性抗原检测成本高、灵敏度低、稳定性差等问题，本发明提出一种检测***特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)将直径为3-5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在质量分数50％硝酸溶液、乙醇水溶液、纯水中超声清洗；
(2)将10μL浓度为0.5-2mg/mL的金纳米粒子负载黑磷纳米片纳米复合材料([email protected])分散液滴加到步骤(1)处理后的玻碳电极表面上，室温下晾干，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干；
(3)将10μL浓度为8-12μg/mL的***特异性抗体(Ab1)滴加到步骤(2)处理过的电极表面，4℃孵育12h；用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干；
(4)将10μL质量分数为0.1-0.3wt％的卵白蛋白(OVA)溶液滴加到步骤(3)处理过的电极表面，室温下育孵育40min，用以封闭非特异性活性位点，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干；
(5)10μL浓度为0.0001-10ng/mL***特异性抗原(PSA)溶液滴加到步骤(4)处理过的电极表面，室温下孵育1h，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干；
(6)将10μL Ab2生物探针共轭物滴加到步骤(5)处理过的电极表面，室温下孵育1h，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干得到夹心型检测***特异性抗原的电化学免疫传感器。
步骤(1)乙醇水溶液为无水乙醇和超纯水体积比1:1混合的混合液。
步骤(2)[email protected]分散液的制备方法，具体步骤如下：
(1)AuNPs的制备：在搅拌下，将1.0-1.5mL浓度为23-25mmol/L的HAuCl4溶液加入到80-120mL沸腾的去离子水中，在80-150℃下搅拌5-15min，迅速加入8-12mL浓度为14-16mmol/L的柠檬酸钠溶液，回流20-40min，直至溶液变为酒红色，溶液自然冷却至室温，得到AuNPs分散液，并于4℃下储存；
(2)黑磷烯(BPene)的制备：称取10-20mg黑磷晶体研磨至粉末状并分散在20-40mL去离子水中，冰浴避光超声5-8h，超声功率为300-500W，以3000rpm离心5-20min，去除残留未脱落的块状黑磷颗粒，收集的上清液以9000rpm离心5-20min，冷冻干燥得到黑磷烯待用；
(3)[email protected]纳米复合材料的制备：取步骤(2)制备得到的黑磷烯制备成浓度为1mg/mL的BP分散液，取100-300μL BP分散液滴加到1-3mL步骤(1)制备得到的AuNPs分散液中，4℃搅拌12h，离心清洗3次得到[email protected]纳米复合材料，将[email protected]纳米复合材料分散在水中得到浓度为0.5-2mg/mL的金纳米粒子负载黑磷纳米片纳米复合材料[email protected]分散液。
步骤(6)Ab2生物探针共轭物制备方法，具体步骤如下；
取4-6mg [email protected]3O4@COF纳米复合材料分散于4-6mL去离子水中，超声20-50min得到混合溶液，将1-3mL浓度为1mg/mL的亚甲基蓝(MB)水溶液加入到混合溶液中，4℃下搅拌8-16h，离心洗涤3次后，产物溶解在0.5mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中，然后分5次均量加入总量100μL的浓度为0.8-1.2mg/mL的***特异性抗原抗体于上述溶液中进行标记，在4℃下置于摇床反应12h后，加入100μL质量分数8-12wt％牛血清白蛋白BSA溶液，摇床反应12h，将所得溶液离心分离并将沉淀分散在0.5mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中得到Ab2生物探针共轭物并于4℃保存备用。
所述[email protected]3O4@COF纳米复合材料的制备方法，具体步骤如下：
(1)Fe3O4纳米簇的制备：称取1-3g六水三氯化铁，2-5g醋酸氨，0.1-0.5g柠檬酸钠一起溶解于70mL无水乙醇中，在160℃下搅拌1h后，在200℃下溶剂热反应10-20h，自然冷却到室温，分别用乙醇和水离心3次，真空干燥得到Fe3O4纳米簇待用；
(2)Fe3O4@COF纳米复合材料的制备：称取12-20mg步骤(1)制备得到的Fe3O4纳米簇和10-18mg联苯胺(BD)一起溶解在15mL四氢呋喃(THF)中，超声混合5-15min形成褐色均匀溶液，然后在50℃下搅拌30min得到分散液，在分散液中加入1,3,5-三醛基间苯三酚(Tp)-四氢呋喃(THF)溶液，加料速率为0.4mL/min，反应12-24h后抽滤得到黄色产物Fe3O4@聚酰亚胺微球，将其分散在邻二氯苯-正丁醇混合溶剂中，随后加入作为催化剂的吡咯烷0.15mL；然后，在77K的液态氮气浴下，三次冷冻-泵-解冻循环进行脱气，密封，在120℃下加热24-48h，产品经过滤、丙酮洗涤，40℃真空干燥48h，得到Fe3O4@COF纳米复合材料；
(3)[email protected]3O4@COF纳米复合材料的制备：将步骤(2)得到的Fe3O4@COF纳米复合材料加水配制成浓度为1mg/mL的Fe3O4@COF溶液，取0.1-0.7mL的Fe3O4@COF溶液滴加在1.5-4.5mL的AuNPs分散液中，4℃搅拌12h，离心洗涤，得到[email protected]3O4@COF纳米复合材料。
步骤(2)1,3,5-三醛基间苯三酚-四氢呋喃溶液为溶解了6-18mg 1,3,5-三醛基间苯三酚的4mL四氢呋喃溶液。
步骤(2)邻二氯苯-正丁醇混合溶剂为1.35mL邻二氯苯和0.15mL正丁醇混合而成。
本发明所述***特异性抗原电化学免疫传感器的应用方法，具体步骤如下：
(1)使用电化学工作站，在三电极体系中，以所制备的电化学免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)利用差分脉冲伏安法DPV法对目标分析物进行检测，扫描电压范围-0.1-0.5V，脉冲振幅0.05V，脉冲宽度0.05s，记录电流峰值；
(3)记录不同浓度下的***特异性抗原所对应的电流峰值；
(4)利用工作曲线法，得到待测样品中***特异性抗原的浓度，结果表明检测范围0.0001ng/mL-10ng/mL，检测下限(LOD)达到30fg/mL(S/N＝3)。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过在工作电极表面依次修饰金纳米粒子负载导电性较好的黑磷纳米片([email protected])和对信号分子亚甲基蓝具有优良富集作用的金纳米粒子修饰磁性共价有机框架的纳米复合材料([email protected]3O4@COF)；通过用这两种材料实现对电化学信号探针的放大效果，所构建的夹心型电化学免疫传感器实现了精确定量检测***特异性抗原的目的，有优越的稳定性和良好的再现性，本发明利用[email protected]3O4@COF纳米复合材料来标记二抗作为传感器的信号放大策略，对客体信号分子具有较好的富集作用，并拥有大量的催化活性位点，表现出了优异的催化性能；[email protected]作为基底材料展现出优越的导电性能，能有效提高免疫传感器的灵敏度；制备得到的传感器的线性检测范围是0.0001ng/mL-10ng/mL，最低检测下限为30fg/mL(3×10-14摩尔/升)，成功地检测了实际血清样品中PSA的含量，低于现有电化学免疫传感器的检出限量，表现出较高的检测灵敏性，为PSA的检测提供了廉价、快速、灵敏的方法。
(2)本发明构建的电化学免疫传感器，具有操作简单、检测迅速、成本低等优点，可用于实际样品的快速检测。
(3)本发明采用对信号分子具有优良富集作用且性能稳定的磁性共价有机框架材料构建电化学信号放大的传感器，可以有效的催化电化学反应从而提高电信号。
(4)本发明用导电性优良的金纳米粒子/黑磷纳米片的复合材料作为所构建的电化学免疫传感器的基底材料，对其电信号的放大也具有促进作用。
(5)本发明将电化学法和免疫法结合制成电化学免疫传感器来检测***抗原方法具有较高的灵敏度、较宽的检测范围、较快的检测速度、较低的检出限以及特殊的选择性和操作方便等优点，有望成为检测标记物的重要方法。
附图说明
图1为PSA电化学免疫传感器的构建原理图；
图2为实施例3中的黑磷晶体和黑磷纳米片的拉曼光谱图；
图3为实施例3中的Fe3O4纳米簇和Fe3O4@COF红外光谱图；
图4为实施例3中的Fe3O4@COF、[email protected]3O4@COF、BP和[email protected]的透射电镜图(图中A为Fe3O4@COF；B为[email protected]3O4@COF；C为BP；D为[email protected])；
图5为不同修饰电极的阻抗谱图；
图6为不同修饰电极的CV图(A)和DPV图(B)；
图7为不同浓度PSA修饰电极的DPV图(A)和标准曲线(B)。
具体实施方式
实施例中所使用的化学试剂和溶剂均为分析纯；原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买；所述搅拌采用磁力搅拌器搅拌方式；pH＝7.2的磷酸盐缓冲液按照现有公开技术进行配置。
图1所示为夹心型检测***特异性抗原的电化学免疫传感器的构建原理图，从图中看出以[email protected]作为免疫反应的平台固定抗体Ab1，金修饰的黑磷纳米片固定在电极表面，不仅加速了电子传递，而且提供了生物相容的微环境固定Ab1，PSA作为分析物，通过抗体抗原的特异性反应，[email protected]3O4@[email protected]@Ab2作为电化学标记物，最后，通过电化学差分脉冲伏安法来检测目标分析物PSA。
实施例1
一种检测***特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)AuNPs的制备：在搅拌下，将1.0mL浓度为23.46mmol/L的HAuCl4溶液加入80mL沸腾的去离子水中，在80℃下搅拌15min，迅速加入8mL浓度为14.55mmol/L的柠檬酸钠溶液，回流20min，直至溶液变为酒红色，溶液自然冷却至室温，得到AuNPs分散液，并于4℃下储存；
(2)黑磷烯(BPene)的制备：称取10mg黑磷晶体研磨至粉末状并分散在20mL去离子水中，冰浴避光超声5h，超声功率为300W，以3000rpm离心5min，去除残留未脱落的块状黑磷颗粒，收集的上清液以9000rpm离心5min，冷冻干燥得到黑磷烯待用；
(3)[email protected]纳米复合材料的制备：取步骤(2)制备得到的黑磷烯制备成浓度为1mg/mL的BP分散液，取100μL制备的BP分散液为滴加到1mL步骤(1)制备的AuNPs分散液中，4℃搅拌12h，离心清洗3次得到[email protected]纳米复合材料，将[email protected]纳米复合材料分散在水中配制成浓度为0.5mg/mL的[email protected]分散液备用；
(4)Fe3O4纳米簇的制备：称取1g六水三氯化铁，2g醋酸氨，0.1g柠檬酸钠一起溶解于70mL无水乙醇中，在160℃下搅拌1h后，在200℃下溶剂热反应10h，自然冷却到室温，分别用乙醇和水离心3次，真空干燥得到Fe3O4纳米簇待用；
(5)Fe3O4@COF纳米复合材料的制备：称取12mg步骤(1)制备得到的Fe3O4纳米簇和10mg联苯胺(BD)一起溶解在15mL四氢呋喃(THF)中，超声混合5min形成褐色均匀溶液，然后在50℃下搅拌30min得到分散液，在分散液中加入溶解6mg的1,3,5-三醛基间苯三酚(Tp)的4mL的四氢呋喃(THF)溶液，加料速率为0.4mL/min，反应12h后抽滤得到黄色产物Fe3O4@聚酰亚胺微球，将其分散在邻二氯苯-正丁醇(1.35mL-0.15mL)的混合溶剂中，混合溶剂为1.35mL邻二氯苯和0.15mL正丁醇混合而成，随后加入作为催化剂的吡咯烷0.15mL；然后，在77K的液态氮气浴下，三次冷冻-泵-解冻循环进行脱气，密封，在120℃下加热24h，产品经过滤、丙酮洗涤，40℃真空干燥48h，得到Fe3O4@COF纳米复合材料；
(6)[email protected]3O4@COF纳米复合材料的制备：将步骤(5)得到Fe3O4@COF纳米复合材料加水配制成浓度为1mg/mL的Fe3O4@COF溶液，取0.1mL Fe3O4@COF溶液滴加在1.5mL金纳米粒子分散液中，金纳米粒子分散液由步骤(1)制备得到，4℃搅拌12h，离心洗涤，得到[email protected]3O4@COF纳米复合材料；
(7)取4mg步骤(6)制备得到的[email protected]3O4@COF纳米复合材料分散于4mL去离子水中，超声20min得到混合溶液，将1mL浓度为1mg/mL的亚甲基蓝(MB)水溶液加入到混合溶液中，4℃下搅拌8h，离心洗涤3次后，产物溶解在0.5mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中，然后分5次均量加入总量100μL的浓度为0.8mg/mL的***特异性抗原PSA抗体于上述溶液中进行标记，在4℃下置于摇床反应12h后，加入100μL质量分数8wt％牛血清白蛋白BSA溶液，摇床反应12h，将所得溶液离心分离并将沉淀分散在0.5mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中得到Ab2生物探针共轭物并于4℃保存备用；
(8)将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在质量分数50％硝酸溶液、无水乙醇和超纯水体积比1:1混合的混合、纯水中超声清洗，制得裸玻碳电极GCE；
(9)取10μL步骤(3)制备的浓度为0.5mg/mL的[email protected]分散液滴加到步骤(8)处理后的玻碳电极表面上，室温下晾干，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，制得GCE/[email protected]；
(10)将10μL浓度为8μg/mL的***特异性抗体Ab1滴加到步骤(9)处理过的玻碳电极表面，4℃孵育12h，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，制得GCE/[email protected]/Ab1；
(11)将10μL质量分数为0.1wt％的卵白蛋白OVA溶液滴加到步骤(10)处理过的玻碳电极表面，室温下育孵育40min，用以封闭非特异性活性位点，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，制得GCE/[email protected]/Ab1/OVA；
(12)10μL浓度为10ng/mL***特异性抗原PSA溶液滴加到步骤(10)处理过的玻碳电极表面，室温下孵育1h，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，制得GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA；
(13)将10μL步骤(7)制备的Ab2生物探针共轭物滴加到步骤(5)处理过的玻碳电极表面，室温下孵育1h，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干得到夹心型检测***特异性抗原的电化学免疫传感器GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA/Ab2。
本实施例***特异性抗原电化学免疫传感器的应用，具体步骤如下：
(1)使用电化学工作站，在三电极体系中，以所制备的电化学免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)利用差分脉冲伏安法DPV法对目标分析物进行检测，扫描电压范围-0.1-0.5V，脉冲振幅0.05V，脉冲宽度0.05s，记录电流峰值；
(3)记录不同浓度下的***特异性抗原所对应的电流峰值；
(4)利用工作曲线法，得到待测样品中***特异性抗原的浓度，结果表明检测范围0.0001ng/mL-10ng/mL，检测下限(LOD)达到30fg/mL(S/N＝3)。
实施例2
一种检测***特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)Au NPs的制备：在搅拌下，将1.2mL浓度为23mmol/L的HAuCl4溶液加入100mL沸腾的去离子水中，在100℃下搅拌10min，迅速加入10mL浓度为16mmol/L的柠檬酸钠溶液，回流30min，直至溶液变为酒红色，溶液自然冷却至室温，得到AuNPs分散液，并于4℃下储存；
(2)黑磷烯(BPene)的制备：称取15mg黑磷晶体研磨至粉末状并分散在30mL去离子水中，冰浴避光超声6h，所述超声功率为400W，以3000rpm离心10min，去除残留未脱落的块状黑磷颗粒，收集的上清液以9000rpm离心10min，冷冻干燥得到黑磷烯待用；
(3)[email protected]纳米复合材料的制备：取步骤(2)制备得到的黑磷烯制备成浓度为1mg/mL的BP分散液，取200μL制备的BP分散液为滴加到2mL步骤(1)制备的AuNPs分散液中，4℃搅拌12h，离心清洗3次得到[email protected]纳米复合材料，将[email protected]纳米复合材料分散在水中配制成浓度为1mg/mL的[email protected]分散液备用；
(4)Fe3O4纳米簇的制备：称取2g六水三氯化铁，3g醋酸氨，0.3g柠檬酸钠一起溶解于70mL无水乙醇中，在160℃下搅拌1h后在200℃下溶剂热反应15h，自然冷却到室温，分别用乙醇和水离心3次，真空干燥得到Fe3O4纳米簇待用；
(5)Fe3O4@COF纳米复合材料的制备：称取15mg步骤(1)制备得到的Fe3O4纳米簇和15mg联苯胺(BD)一起溶解在15mL四氢呋喃(THF)中，超声混合10min形成褐色均匀溶液，然后在50℃下搅拌30min得到分散液，在分散液中缓慢加入溶解10mg的1,3,5-三醛基间苯三酚(Tp)的4mL的四氢呋喃(THF)溶液，加料速率为0.4mL/min，反应15h后抽滤得到黄色产物Fe3O4@聚酰亚胺微球，将其分散在邻二氯苯-正丁醇(1.35mL-0.15mL)的混合溶剂中，混合溶剂为1.35mL邻二氯苯和0.15mL正丁醇混合而成，随后加入作为催化剂的吡咯烷0.15mL；然后，在77K的液态氮气浴下，三次冷冻-泵-解冻循环进行脱气，密封，在120℃下加热30h，产品经过滤、丙酮洗涤，40℃真空干燥48h，得到Fe3O4@COF纳米复合材料；
(6)[email protected]3O4@COF纳米复合材料的制备：将步骤(5)得到Fe3O4@COF纳米复合材料加水配制成浓度为1mg/mL的Fe3O4@COF溶液，取0.57mL Fe3O4@COF溶液滴加在3mL金纳米粒子分散液中，金纳米粒子分散液由步骤(1)制备得到，4℃搅拌12h，离心洗涤，得到[email protected]3O4@COF纳米复合材料；
(7)取4.5mg步骤(6)制备得到的[email protected]@COF纳米复合材料分散于5mL去离子水中，超声30min得到混合溶液，将2mL浓度为1mg/mL的亚甲基蓝(MB)水溶液加入到混合溶液中，4℃下搅拌12h，离心洗涤3次后，产物溶解在0.5mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中，然后分5次均量加入总量100μL的浓度为1mg/mL的***特异性抗原PSA抗体于上述溶液中进行标记，在4℃下置于摇床反应12h后，加入100μL质量分数10wt％牛血清白蛋白BSA溶液，摇床反应12h，将所得溶液离心分离并将沉淀分散在0.5mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中得到Ab2生物探针共轭物并于4℃保存备用；
(8)将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在质量分数50％硝酸溶液、无水乙醇和超纯水体积比1:1混合的混合液、纯水中超声清洗，制得裸玻碳电极GCE；
(9)取10μL步骤(3)制备的浓度为1mg/mL的[email protected]分散液滴加到步骤(8)处理后的玻碳电极表面上，室温下晾干，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，制得GCE/[email protected]；
(10)将10μL浓度为10μg/mL的***特异性抗体Ab1滴加到步骤(9)处理过的玻碳电极表面，4℃孵育12h，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干制得GCE/[email protected]/Ab1；
(11)将10μL质量分数为0.2wt％的卵白蛋白OVA溶液滴加到步骤(10)处理过的玻碳电极表面，室温下育孵育40min，用以封闭非特异性活性位点，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，制得GCE/[email protected]/Ab1/OVA；
(12)10μL浓度为10ng/mL***特异性抗原PSA溶液滴加到步骤(10)处理过的玻碳电极表面，室温下孵育1h，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，制得GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA；
(13)将10μL步骤(7)制备的Ab2生物探针共轭物滴加到步骤(5)处理过的玻碳电极表面，室温下孵育1h，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干得到夹心型检测***特异性抗原的电化学免疫传感器GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA/Ab2。
本实施例***特异性抗原电化学免疫传感器的应用，具体步骤如下：
(1)使用电化学工作站，在三电极体系中，以所制备的电化学免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)利用差分脉冲伏安法DPV法对目标分析物进行检测，扫描电压范围-0.1-0.5V，脉冲振幅0.05V，脉冲宽度0.05s，记录电流峰值；
(3)记录不同浓度下的***特异性抗原所对应的电流峰值；
(4)利用工作曲线法，得到待测样品中***特异性抗原的浓度，结果表明检测范围0.0001ng/mL-10ng/mL，检测下限(LOD)达到30fg/mL(S/N＝3)。
实施例3
一种检测***特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)Au NPs的制备：在搅拌下，将1.5mL浓度为25mmol/L的HAuCl4溶液加入120mL沸腾的去离子水中，在150℃下搅拌5min，迅速加入12mL浓度为14mmol/L的柠檬酸钠溶液，回流40min，直至溶液变为酒红色，溶液自然冷却至室温，得到AuNPs分散液，并于4℃下储存；
(2)黑磷烯(BPene)的制备：称取20mg黑磷晶体研磨至粉末状并分散在40mL去离子水中，冰浴避光超声8h，超声功率为500W，以3000rpm离心20min，去除残留未脱落的块状黑磷颗粒，收集的上清液以9000rpm离心20min，冷冻干燥得到黑磷烯待用；
(3)[email protected]纳米复合材料的制备：取步骤(2)制备得到的黑磷烯制备成浓度为1mg/mL的BP分散液，取300μL制备的BP分散液为滴加到3mL制备的AuNPs分散液中，4℃搅拌12h，离心清洗3次得到[email protected]纳米复合材料，将[email protected]纳米复合材料分散在水中配制成浓度为2mg/mL的[email protected]分散液备用；
(4)Fe3O4纳米簇的制备：称取3g六水三氯化铁，5g醋酸氨，0.5g柠檬酸钠一起溶解于70mL无水乙醇中，在160℃下搅拌1h后，在200℃下溶剂热反应20h，自然冷却到室温，分别用乙醇和水离心3次，真空干燥得到Fe3O4纳米簇待用；
(5)Fe3O4@COF纳米复合材料的制备：称取20mg步骤(1)制备得到的Fe3O4纳米簇和18mg联苯胺(BD)一起溶解在15mL四氢呋喃(THF)中，超声混合15min形成褐色均匀溶液，然后在50℃下搅拌30min得到分散液，在分散液中缓慢加入溶解18mg的1,3,5-三醛基间苯三酚(Tp)的4mL的四氢呋喃(THF)溶液，加料速率为0.4mL/min，反应24h后抽滤得到黄色产物Fe3O4@聚酰亚胺微球，将其分散在邻二氯苯-正丁醇(1.35mL-0.15mL)的混合溶剂中，混合溶剂为1.35mL邻二氯苯和0.15mL正丁醇混合而成，随后加入作为催化剂的吡咯烷0.15mL；然后，在77K的液态氮气浴下，三次冷冻-泵-解冻循环进行脱气，密封，在120℃下加热48h，产品经过滤、丙酮洗涤，40℃真空干燥48h，得到Fe3O4@COF纳米复合材料；
(6)[email protected]3O4@COF纳米复合材料的制备：将步骤(5)得到Fe3O4@COF纳米复合材料加水配制成浓度为1mg/mL的Fe3O4@COF溶液，取0.7mL Fe3O4@COF溶液滴加在4.5mL金纳米粒子分散液中，金纳米粒子分散液由步骤(1)制备得到，4℃搅拌12h，离心洗涤，得到[email protected]3O4@COF纳米复合材料；
(7)取6mg步骤(6)制备得到的[email protected]3O4@COF纳米复合材料分散于6mL去离子水中，超声50min得到混合溶液，将3mL浓度为1mg/mL的亚甲基蓝(MB)水溶液加入到混合溶液中，4℃下搅拌16h，离心洗涤3次后，产物溶解在0.5mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中，然后分5次均量加入总量100μL的浓度为1.2mg/mL的***特异性抗原PSA抗体于上述溶液中进行标记，在4℃下置于摇床反应12h后，加入100μL质量分数12wt％牛血清白蛋白BSA溶液，摇床反应12h，将所得溶液离心分离并将沉淀分散在0.5mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中得到Ab2生物探针共轭物并于4℃保存备用；
(8)将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在质量分数50％硝酸溶液、无水乙醇和超纯水体积比1:1混合的混合液、纯水中超声清洗，制得裸玻碳电极GCE；
(9)取10μL步骤(3)制备的浓度为2mg/mL的[email protected]分散液滴加到步骤(8)处理后的玻碳电极表面上，室温下晾干，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，制得GCE/[email protected]；
(10)将10μL浓度为12μg/mL的***特异性抗体Ab1滴加到步骤(9)处理过的玻碳电极表面，4℃孵育12h，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干制得GCE/[email protected]/Ab1；
(11)将10μL质量分数为0.3wt％的卵白蛋白OVA溶液滴加到步骤(10)处理过的玻碳电极表面，室温下育孵育40min，用以封闭非特异性活性位点，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，制得GCE/[email protected]/Ab1/OVA；
(12)10μL浓度为10ng/mL***特异性抗原PSA溶液滴加到步骤(10)处理过的玻碳电极表面，室温下孵育1h，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，制得GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA；
(13)将10μL步骤(7)制备的Ab2生物探针共轭物滴加到步骤(5)处理过的玻碳电极表面，室温下孵育1h，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干得到夹心型检测***特异性抗原的电化学免疫传感器GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA/Ab2。
本实施例***特异性抗原电化学免疫传感器的应用，具体步骤如下：
(1)使用电化学工作站，在三电极体系中，以所制备的电化学免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)利用差分脉冲伏安法DPV法对目标分析物进行检测，扫描电压范围-0.1-0.5V，脉冲振幅0.05V，脉冲宽度0.05s，记录电流峰值；
(3)记录不同浓度下的***特异性抗原所对应的电流峰值；
(4)利用工作曲线法，得到待测样品中***特异性抗原的浓度，结果表明检测范围0.0001ng/mL-10ng/mL，检测下限(LOD)达到30fg/mL(S/N＝3)。
图2为实施例3中步骤(2)中黑磷晶体及剥离后的黑磷烯的拉曼光谱图，在320-490cm-1范围内出现一个面外振动峰(361cm-1)和两个面内振动峰(438cm-1)、(465.4cm-1)，如图所示，黑磷烯的三个振动峰较黑磷晶体都发生了一定的位移，分别为1.3、1.4和1.9cm-1，说明了黑磷晶体被剥离成黑磷烯，黑磷晶体之间的范德华力减小，从而证明黑磷烯的制备成功。
图3所示为实施例3中步骤(4)制备得到的Fe3O4纳米簇和步骤(5)制备得到的Fe3O4@COF的红外光谱图；由于Fe3O4纳米簇和Fe3O4@COF在红外可见光区都有特征吸收峰，因此红外可见吸收光谱可用于监控该复合物的合成情况，从图中可知，Fe3O4在3429cm-1(O-H)和586cm-1(Fe-O)有吸收峰，Fe3O4@COF光谱中显示亚胺1598cm-1(C＝N)基团的特征峰，1448cm-1和1285cm-1处的两个峰对应于芳族C＝C和新形成的酮形式的C-N键，表明Fe3O4@COF复合成功。
图4为实施例3中Fe3O4@COF、[email protected]3O4@COF、BP和[email protected]的透射电镜图；图中A为Fe3O4@COF；B为[email protected]3O4@COF；C为BP；D为[email protected]；如图4A所示，聚亚胺微球沉积在Fe3O4颗粒上，形成100nm厚的有机壳层，形貌连续、光滑，粒径分布均匀；图4B图可看出在Fe3O4@COF表面附有约5nm大小的AuNPs，说明纳米材料[email protected]3O4@COF复合成功；图4C可看出制备的BP呈薄片状结构；图4D图也可以看出在BP表面附有约5nm大小的AuNPs，说明纳米材料[email protected]复合成功。
半圆直径与电荷转移电阻(Rct)密切相关，半圆直径对应于电子转移阻力，而直线表示电荷扩散，电子阻抗谱图显示了不同修饰电极在逐步制备过程中的EIS数据，将实施例3步骤(8)-步骤(11)中制备的GCE、GCE/[email protected]、GCE/[email protected]/Ab1、GCE/[email protected]/Ab1/OVA、GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA和GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA/Ab2分别测试其阻抗谱图，频率范围为10-1-105Hz，如图5所示，图中a-f分别表示GCE、GCE/[email protected]、GCE/[email protected]/Ab1、GCE/[email protected]/Ab1/OVA、GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA和GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA/Ab2的阻抗曲线，结果表明，与裸GCE相比，[email protected]/GCE的Rct明显降低，这是因为AuNPs能促进电子转移；当修饰电极分别在Ab1、OVA和PSA溶液中孵育时，由于蛋白质生物大分子阻碍电荷转移，Rct依次增加，GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA修饰电极与Ab2生物探针共轭物孵育后，由于高比表面积的Fe3O4@COF对铁氰化物离子的吸附能力强，AuNPs在Ab2生物共轭体中的电子转移能力好，Rct值明显降低。
将实施例3步骤(8)-步骤(11)中制备的GCE、GCE/[email protected]、GCE/[email protected]/Ab1、GCE/[email protected]/Ab1/OVA、GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA和GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA/Ab2分别进行CV(电位范围0.5-0.1V)和DPV(电位范围-0.2-0.5V)测试，因为可以通过测量修饰电极的电流强度变化来揭示传感器的电化学行为，如图6A所示为CV曲线，如图6B所示为DPV曲线，图中a-f分别表示GCE、GCE/[email protected]、GCE/[email protected]/Ab1、GCE/[email protected]/Ab1/OVA、GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA和GCE/[email protected]/Ab1/OVA/PSA/Ab2，从图中可知，在裸GCE上固定一层[email protected]后，电信号响应明显改善，因为[email protected]可以促进电子转移，修饰电极分别在Ab1、OVA和PSA溶液中孵育后，峰值电流响应依次下降，原因是蛋白质生物大分子会抑制电荷转移，当滴加Ab2生物探针共轭物，峰值电流响应显著增加，其原因可能是由于Ab2生物探针共轭物中Fe3O4@COF的高比表面积可吸收大量的铁***离子，从而提高电子转移效率。
实施例4-11
将实施例3中步骤(10)***特异性抗原(PSA)溶液的浓度分别为0、0.0001、0.0002、0.0005、0.001、0.01、0.1、1ng/mL，其他与实施例3相同，制备得到的电化学免疫传感器的使用方法同实施例3，检测下限(LOD)达到30fg/mL(S/N＝3)。
实施例4-11制备得到的传感器加上实施例3制备得到的传感器共得到9个电化学传感器，进行DPV(电位范围-0.4--0.1V)测试，如图7A所示，在0.0001-10ng/mL的浓度范围内，随着PSA浓度的增加，电流响应的值增加，这归因于在更高浓度的PSA溶液下，在电极上固定MB的信号分子具有大量的Ab2信号探针复合物；如图7B标准曲线所示，电流强度(I)与log CPSA之间有良好的线性关系，根据3σ准则，检测下限(LOD)为30fg/mL(S/N＝3)；相关系数(R2)为0.996的线性关系式为I(μA)＝-0.899*log CPSA-6.319，基于[email protected]3O4@COF纳米材料具有较大的孔径和良好的生物相容性，制备的免疫传感器具有更强的分析性能、更低的检出限、更高的灵敏度和更宽的线性范围，有助于免疫传感器捕获更多的信号分子，进一步增大溶出信号和提高检测灵敏度。