阅读说明：本技术 平铺光片显微镜及其使用方法 (Flat light sheet microscope and using method thereof ) 是由 高亮 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本公开涉及一种平铺光片显微镜及其使用方法。平铺光片显微镜的激发子系统依序包括空间光调制器(SLM)、第一振镜、在成像室的至少一侧的照明路径以及所述照明路径末端的激发物镜,所述SLM的光学调制平面与所述激发物镜的入瞳共轭,且构造为对照明光进行调制；所述第一振镜被构造为：通过偏转振镜角度将照明光引导到成像室一侧的照明路径上,并布置为共轭到所述SLM的光学调制平面；并且所述激发物镜为空气物镜,且构造为与所述成像室间隔开。利用根据本公开的各个实施例的平铺光片显微镜及其使用方法,其能够与不同的透明化方法兼容,成本较低,维护和操作起来灵活且方便。(The present disclosure relates to a flat sheet microscope and a method of using the same. An excitation subsystem of the tiled light sheet microscope sequentially comprises a Spatial Light Modulator (SLM), a first galvanometer, an illumination path on at least one side of an imaging chamber and an excitation objective lens at the tail end of the illumination path, wherein an optical modulation plane of the SLM is conjugated with an entrance pupil of the excitation objective lens and is configured to modulate illumination light; the first galvanometer is configured to: directing illumination light onto an illumination path on one side of an imaging chamber by deflecting a galvanometer angle and arranged to be conjugate to an optical modulation plane of the SLM; and the excitation objective is an air objective and is configured to be spaced apart from the imaging chamber. With the tiled light sheet microscope and the use method thereof according to the embodiments of the present disclosure, it is compatible with different transparentization methods, with lower cost, and flexible and convenient maintenance and operation.)

平铺光片显微镜及其使用方法

技术领域

本公开涉及一种精密光学仪器及其使用方法，更具体地，涉及一种平铺光片显微镜和平铺光片显微镜的功能以及使用方法。

背景技术

近期发展的平铺光片选择性平面照明显微镜(TLS-SPIM)技术，通过在成像视野内(FOV)平铺小而薄的光片，并采集额外的图像来克服光片尺寸、光片厚度和照明光约束力之间的矛盾，从而在远远大于光片尺寸的成像视野上保持了光片显微镜的3D成像能力。

组织透明化技术使得光学成像技术可以应用于生物组织成像，并获得生物组织的高空间分辨率信息。然而，不同的透明化方法适用于不同类型的生物组织。同时，不同透明化方法处理过的生物组织往往具有不同的透明度、光学折射率、机械强度、化学性质以及形态变化，这些不同的样品特性都对样品标记、处理和成像方法造成多方面的限制。同时，组织透明化方法还处在高速发展的阶段。因此应用于透明化生物组织高分辨率成像的光学显微镜必须提供平和的成像性能，满足不同应用场景下对于成像空间分辨率、视场(FOV)大小(其与空间分辨率之间存在权衡)、成像速度的灵活要求，并且适用于不同透明化技术处理的样品。然而，目前的平铺光片显微镜无法满足这样的需求。

此外，目前的平铺光片显微镜的成本和使用体验对于用户并不友好，其成像效果依赖于用户的专业操作，例如校准操作和维护操作等，用户经验不足的情况下难以保证成像效果；产生新的应用需求时，也不能针对性且低成本地实现局部的更新，应用的灵活度不够，难以满足用户层出不穷的应用需求，也增加了用户用其来实现研发工作的难度。这些问题阻碍透明生物组织高分辨率成像技术的应用和推广。

提供了本公开以解决背景技术中存在的上述缺陷。

发明内容

旨在提供一种平铺光片显微镜及其使用方法，其能够与不同的透明化方法兼容，用于对不同的生物组织样品进行高分辨率3D成像，成本较低，维护和操作灵活方便。

在第一方面，本公开的实施例提供了一种平铺光片显微镜，所述平铺光片显微镜的激发子系统依序包括空间光调制器(SLM)、第一振镜、在成像室的至少一侧的照明路径以及所述照明路径末端的激发物镜，所述SLM的光学调制平面与所述激发物镜的入瞳共轭，且构造为对照明光进行调制；所述第一振镜被构造为：通过偏转振镜角度将照明光引导到成像室一侧的照明路径上，并布置为共轭到所述SLM的光学调制平面；并且所述激发物镜为空气物镜，且构造为与所述成像室间隔开。

在第二方面，本公开的实施例提供了一种平铺光片显微镜的使用方法，包括：接收来自用户的预设放大倍率，和成像空间分辨率需求，并据此向SLM加载相位图来实现所述激发光片的几何形状、平铺次数和平铺位置。

利用根据本公开的各个实施例的平铺光片显微镜及其使用方法，其能够与不同的透明化方法兼容，成本较低，维护和操作起来灵活且方便。

附图说明

在不一定按比例绘制的附图中，相同的附图标记可以在不同的视图中描述相似的部件。具有字母后缀或不同字母后缀的相同附图标记可以表示相似部件的不同实例。附图大体上通过举例而不是限制的方式示出各种实施例，并且与说明书以及权利要求书一起用于对所公开的实施例进行说明。这样的实施例是例证性的，而并非旨在作为本装置或方法的穷尽或排他实施例。

图1示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜的示意图；

图2示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜的示意图；

图3示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜的示意图；

图4(a)-图4(d)示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜的各种操作的示意图；

图5示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜中的样品平移子系统的示意图；

图6(a)-图6(g)示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜通过向其中的SLM加载各种相位图所能实现的照明光片的调整(包括平铺和校准)效果；

图7(a)示出根据本公开实施例的对平铺光片显微镜中的SLM的调制相位图所进行的各种处理的示意图；

图7(b)-图7(f)示出利用图7(a)中所示的各种处理得到的调制相位图；

图7(g)-图7(k)分别示出将图7(b)-图7(f)中所示的各个调制相位图加载到SLM所实现的调整后的激发光片的图示；

图8(a)示出根据本公开实施例的高斯光片的长度与厚度之间的关系的图示；

图8(b)示出根据本公开实施例的利用不同的检测数值孔径(NA)和光片厚度的高斯光片所能实现的理论轴向分辨率的图示；

图8(c)示出根据本公开实施例的利用不同的检测NA和光片长度的高斯光片所实现的轴向分辨率的图示；

图8(d)示出根据本公开实施例的利用2k×2k检测相机和不同的检测NA在奈奎斯特采样像素大小下获得的视场的大小；

图9(a)-图9(d)示出利用不同的激发NA生成的激发光束的横截面强度分布图；

图9(e)-图9(h)示出通过分别扫描图9(a)-图9(d)中生成的激发光束获得的虚拟激发光片的截面强度分布图；

图9(i)-图9(l)示出图9(e)-图9(h)示出的各种虚拟激发光片的强度曲线图；

图9(m)-图9(p)示出图9(e)-图9(h)示出的各种虚拟激发光片的横截面强度分布图；

图9(q)和图9(r)分别是图9(m)和图9(n)的放大视图；

图10(a)-图10(f)示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜所获取的与各个平铺位置对应的各个独立的3D图像层的图示；

图10(g)示出基于图10(a)-图10(f)所示的各个3D图像层重建所得到的最终的3D图像。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本公开的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本公开作详细说明。下面结合附图和具体实施例对本公开的实施例作进一步详细描述，但不作为对本公开的限定。

本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指在该词前的要素涵盖在该词后列举的要素，并不排除也涵盖其他要素的可能。

图1示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜100的示意图。如图1所示，所述平铺光片显微镜100包括用于生成用于对样品进行照明以激发荧光的光片的激发子系统，该激发子系统沿着激光的传输方向可以包括空间光调制器(SLM)101、第一振镜102、在成像室104的至少一侧的照明路径(本文中可称为第一照明路径)103以及所述照明路径103末端的激发物镜(本文中可称为第一激发物镜)104。当然，除了这些构件以外，平铺光片显微镜100的激发子系统还可以包括用于生成激光束的激光发生器、用于对激光束进行扩束和准直的扩束准直透镜等，在此不赘述。其中，所述SLM 101的光学调制平面与所述第一激发物镜104的入瞳共轭，且构造为对照明光进行调制。例如，SLM 101的光学调制平面可以经由一对或数对中继透镜(例如但不限于图1中所示的第一对中继透镜L3和L4以及第二对中继透镜L5和L6)与第一激发物镜104的入瞳共轭，如此，通过对SLM 101加载相位图来调制光学调制像平面处的照明光，例如在SLM 101的光学调制平面叠加相位，即等效于在入瞳平面(与第一激发物镜104的入瞳共轭的平面)处的照明光波前上叠加相应的相位分布，从而实现光片的各种功能，例如但不限于光片平铺。具体说来，通过向SLM 101加载离焦相位图，实现在SLM101的光学调制平面对激发光波前叠加球面相位，即可沿着激发光的传播方向对激发光片进行平铺。

所述第一振镜102可以被构造为：通过偏转振镜角度(如图1中的双向箭头所示)将照明光引导到成像室105一侧的第一照明路径103上，并布置为共轭到所述SLM 101的光学调制平面，例如可以经由一对或数对中继透镜(例如但不限于图1中所示的第一对中继透镜L3和L4)共轭到SLM 101的光学调制平面。如图1所示，所述第一激发物镜104为空气物镜，且构造为与所述成像室105间隔开。通过采用空气物镜作为第一激发物镜104且使之与成像室105之间保持充足的工作距离，使得平铺光片显微镜100能够与不同的透明化方法兼容，而不会被各种透明化方法使用的成像缓冲液污染或损坏，从而降低了平铺光片显微镜100的制造和维护成本，便于其推广应用。

图2示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜200的示意图。该平铺光片显微镜200除了包括图1中的各种构件以外，还在成像室105的与第一照明路径103相对的一侧上对称地设有第二照明路径106，通过偏转第一振镜102的振镜角度(如图2中的双向箭头所示)可以将照明光按需引导到第一照明路径103或者第二照明路径106上。第二照明路径106的末端设有第二激发物镜107。该第二激发物镜107也可以为空气物镜，且构造为与成像室105保持充足的工作距离。在第二照明路径106上，SLM 101的光学调制平面也可以经由一对或数对中继透镜(例如但不限于图2中所示的第一对中继透镜L3和L4以及第三对中继透镜L7和L8)与第二激发物镜107的入瞳共轭。如图2所示，通过复用例如用于生成激光束的激光发生器、用于对激光束进行扩束和准直的扩束准直透镜(例如L1和L2)、SLM 101、一对中继透镜L3及L4以及第一振镜102，以紧凑的光学结构和低廉的成本实现了能够按需动态地启用任一侧的照明路径的平铺光片显微镜200。具体说来，可以动态地选择距离成像室105及其中的样品距离更近的一侧的照明路径来实现光片照明，如此可以减少激发光在样品中的传播距离，从而实现更好的成像效果。

图3示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜300的示意图，其中主要示出了激发子系统和检测子系统310。如图3所示，该平铺光片显微镜300可以包括激光生成组件308、扩束准直透镜L1和L2、二元SLM组件301、光学狭缝309、至少第一对中继透镜L3和L4、第一振镜302、至少第二对中继透镜L5和L6或者L7和L8、激发物镜304和307以及所述检测子系统310。

激光生成组件308被配置为生成激光束，例如具有488nm和561nm的激发波长的合束后的激光束。扩束准直透镜L1和L2可以配置为对来自激光生成组件308的激光束进行扩展和准直，例如将合束后的激光束扩束到大约7mm的1/e²射束直径，扩束准直透镜L1的焦距例如但不限于30mm而扩束准直透镜L2的焦距例如但不限于250mm，并将扩展后的激光束发送到二元SLM组件301。

二元SLM组件301可以包括二元SLM 3011且配置为对扩展后的激光束进行相位调制。相应地，向二元SLM 3011加载的相位图为二元相位图，可通过将相应连续相位图二值化来得到。除了二元SLM 3011(例如尺寸为1280×1024的二元SLM 3011)以外，二元SLM组件301还可以包括偏振分光棱镜3013、半波片3012，用于对扩展后的激光束进行分光、滤杂和相位调制。经调制的激光束可以被聚焦到光学狭缝309上，以阻挡由所述二元SLM组件301生成的不需要的激光衍射级，从而提升成像效果。所述二元SLM组件301可以经由所述至少第一对中继透镜L3和L4共轭到所述第一振镜302，透镜L3的焦距例如但不限于300mm而透镜L4的焦距例如但不限于175mm。第一振镜302通过偏转振镜角度可以将照明光引导到两个对称的照明路径303和306中的一个上。在晶格光片显微镜中，第一振镜302还可以通过扫描激光束来创建虚拟激发光片以实现样品照明。

所述第一振镜302可以经由所述至少第二对中继透镜L5和L6或者L7和L8共轭到相应激发物镜304或307的入瞳，其中，透镜L5和L7的焦距例如但不限于150mm，而透镜L6和L8的焦距例如但不限于250mm，如此能够从两个相反的方向照明样品，从而尽量减小激发光在样品中的传输距离，相应地减少激发光的衰减，实现更好的成像效果。在一些实施例中，第二激发物镜307和第一激发物镜304可以具有不同的数值孔径(NA)，例如，Mitutoyo公司的MY5X-802和MY5X-803两者均可以用作第一激发物镜304和第二激发物镜307。这两个物镜具有相同的光瞳尺寸和工作距离，而MY5X-803具有0.28NA，相比之下，MY5X-802具有0.14NA，通过使用MY5X-803能够获得更高的激发NA，也就是更薄的光片。可以根据具体的成像需求(例如光片厚度)，来更换激发物镜，通过将两个激发物镜设置为具有不同的NA，可以按需获得不同厚薄的光片，以满足具体的成像需求。

检测子系统310与包含上述构件的激发子系统可以是彼此独立的系统，从而可以独立升级以适应超出所采用具体检测子系统成像能力的应用，且显微镜的工作原理保持不变。各个子系统的独立修正升级可以降低修正升级的成本，更灵活地满足多变的成像需求，且能延长显微镜的使用寿命。

检测子系统310可以配置为采集被激发平面的荧光信号并对所述被激发平面成像。在一些实施例中，检测子系统310可以包括多套设计且可以由用户按需在这多套设计中灵活更换。例如，检测子系统310可以包括Olympus MVX10微距变焦显微镜以采集发射的荧光信号，并包括sCMOS相机(例如Hamamatsu公司生产的型号为Orca Flash 4.0的sCMOS相机)用于对荧光信号成像。MVX10显微镜用在检测子系统310中具有多种优势。首先，该显微镜配备了多个对平度进行了校正且具有长工作距离的物镜，其专门设计用于对大样品进行成像。其次，显微镜主体能够将放大倍率从0.63倍调整到6.3倍，因此可以快速调整视场(FOV)大小，以便在所需的空间分辨率和成像速度下方便地进行样品观测和3D成像。第三，它具有传统的显微镜设计，因此对于大多数用户来说，该显微镜的操作更加方便和熟悉。MVX10可以用其他类似的微距变焦显微镜来替代，例如蔡司V16显微镜。如图3所示，检测子系统310也可以简化至检测物镜3101和套管透镜3102，为了能够方便地调节放大倍率，可以在此基础上引入更复杂的设计。

在一些实施例中，所述平铺光片显微镜还可以包括或可通信地连接到控制子系统。作为示例，该控制子系统可以包括计算机工作站、美国国家仪器公司的数据采集卡PCIe-6323 DAQ卡和BNC 2090A连接器块。该控制子系统可以从Labview开发的控制软件中获取输入参数，并生成相应的同步控制信号，以控制根据本公开各个实施例的平铺光片显微镜的各种机械和光电器件。

在一些实施例中，所述控制子系统被配置为：接收来自用户的预设放大倍率，并据此向SLM加载相位图来实现所述激发光片的几何形状、平铺次数和平铺位置。具体说来，控制子系统可以配置为以第一操作模式、第二操作模式、第三操作模式和第四操作模式中的任一种来操作所述平铺光片显微镜，以满足不同的具体应用场景和成像需求。在第一操作模式下，使得所述平铺光片显微镜执行对样品任意成像平面上的2D成像(可参见图4(a))；在所述第二操作模式下，使得所述平铺光片显微镜执行对样品的选择的单个关注区域(ROI)的3D成像(参见图4(b))；在所述第三操作模式下，使得所述平铺光片显微镜执行对样品的选择的多个ROI的3D成像(参见图4(c))；以及在所述第四操作模式下，使得所述平铺光片显微镜执行对所选择ROI阵列的3D成像(参见图4(d))。

下面将结合图4(a)-图4(b)对各种操作模式进行具体说明。

如图4(a)所示，首先可以由用户预设显微镜的放大倍率(也称为检测倍率)，例如，检测倍率可以在0.63倍到6.3倍之间调整，以改变样品检查的视场(FOV)的大小。根据需要，可以在3.2倍、4倍、5倍和6.3倍的放大倍率下进行平铺光片的3D成像，以达到不同的成像速度和空间分辨率。

如图4(b)所示，在用户预设的检测倍率之后，控制子系统可以基于相应的视场大小、期望的空间分辨率和成像速度，来确定激发光片的几何形状(厚的激发光片还是薄的激发光片)、光片平铺次数(1次、2次、3次、还是n次(n为自然数))和平铺位置。在一些实施例中，控制子系统被配置为通过对SLM的调制相位图执行各种处理(在下文中会详细说明)来生成所需几何形状、光片平铺次数和平铺位置的平铺光片。在一些实施例中，用户(操作者)可人工判断平铺光片的照明效果是否满足应用需求，如果满足，且向控制子系统发送确认指令。控制子系统可配置为接收来自用户的确认指令，并响应于该确认指令，停止对调制相位图的进一步处理。这种半自动校准能够帮助用户高效且准确地选择合适的平铺光片，兼顾了校准速度和校准精度，用户友好度较高。

利用校准后的合适的平铺光片，可以执行对样品在固定像平面上的2D成像，也就是第一操作模式。第一操作模式主要用于样品检验。可以由检测子系统(例如但不限于相机)采集给定数量的样品图像，或者以给定的曝光时间持续进行图像采集。通过依次加载离焦相位图，可以在不同的平铺位置平铺光片，其也与相机的曝光同步；具体说来，在每次曝光之前，可以根据设置将新的相位图加载到SLM以对激发光片进行平铺。可以在每个平铺位置曝光以采集该处的原始图像；对于多色成像，当激发光片在像平面上的所有选择的平铺位置处完成平铺和相应图像采集之后，可以替换到下一颜色通道以进行新一轮的光片平铺配合相机曝光的图像采集。在一些实施例中，在成像期间可以移动样品，以实现大面积的样品成像。

在一些实施例中，可以利用样品平移子系统来实现样品在各个方向上的自由平移，样品平移子系统可以作为一个独立的子系统，包括在平铺光片显微镜中。

在一些实施例中，样品平移子系统500可以如图5所示，所述样品平移子系统500可以包括分别在激发光传播(y)方向上移动的第一线性平移台501、在检测光轴(z)方向上移动的第二线性平移台502和在激发光片的延展(x)方向上移动的第三线性平移台503。该样品平移子系统500可以用于在任一操作模式下对样品进行平移。具体说来，例如，在要对样品的各个ROI进行3D成像的情况下(例如第二操作模式、第三操作模式和第四操作模式)，可以利用所述第一线性平移台501、所述第二线性平移台502和所述第三线性平移台503中的至少一个以给定步长将样品移动给定步数，且在样品移动到的每个位置处利用平铺光片对相应ROI成像，直到完成对相应ROI整个体积的3D成像。利用各个平移台能够方便、迅速且灵活地实现任何方向上mm级别的移动，通过在样品移动方向上的各个位置获取ROI的3D图像层，可以通过整合得到相应ROI的整个体积的3D成像。

在一些实施例中，可以分别针对要成像的各个ROI选择检测倍率、合适的平铺光片以及激发物镜，每个ROI则可以利用为其选择的检测倍率、平铺光片和激发物镜来成像。

在第二操作模式下，如图4(c)所示，可以在ROI 1、ROI 2和ROI 3中选择一个ROI进行3D成像。在这种模式下，显微镜可以采用为其选择的激发物镜，例如，为ROI 1选择的是激发光所需要穿透样品深度更浅的右侧的激发物镜，而为ROI 2和ROI 3选择的则是激发光所需要穿透样品深度更浅的左侧的激发物镜，使得在尽量缩短激发光在样品中的传输距离进而减少光衰减的情况下，获取所选择ROI的3D图像层。鉴于所选择ROI在检测光轴上的厚度，可以通过在多个轴向位置上的像平面的成像，来对整个体积的3D成像。具体说来，可以从初始位置开始，在检测光轴方向上利用第二线性平移台502对样品进行扫描，以给定步长扫描给定步数。在每个像平面处，成像过程未依次启用所选择的颜色通道，在各个平铺位置使用平铺的光片，对像平面对应于各个平铺位置的部分一一成像，所采集的各个部分图像可以称为原始图像。在完成当前轴向位置的像平面的成像之后，将样品扫描到下一个轴向位置并重复相同的成像过程，直到完成所选择ROI的整个体积被3D成像，要采集的原始图像的总数等于轴向位置的数量乘以平铺位置的数量，再乘以颜色通道的数量。

在第三操作模式下，如图4(c)所示，可以为多个选择的ROI成像，例如，可以利用为ROI 1、ROI 2和ROI 3分别选择和指定的激发物镜，前后分别对ROI 1、ROI 2和ROI 3进行成像。在成像开始之前，可以确定每个选择的)ROI的横向(例如激发光片的延展方向和/或激发光传播方向，也就是图4(c)中所示的x方向和y方向)的位置和检测光轴方向上的扫描范围，然后按照第二操作模式下的成像过程，为每个选择的ROI取得3D图像层。在完成对当前选择ROI的完整3D体积的成像后，例如可以利用样品平移子系统将样品移动到下一个位置，重复相同的3D成像过程，直到完成对所有选择的ROI完成完整体积的3D成像为止。

在第四操作模式下，可以将较大的样品划分为m×n的ROI阵列，例如图4(d)中所示的4×4的阵列，并且设置遍历通过所有ROI(例如图4(d)中的ROI 1、ROI 2……ROI 16)的平移通路，使得平移通路上的每个ROI与其上游和下游的两个ROI均在空间上相邻，以便减少每次平移的步长以及平移的总距离，从而简化平移操作并提高成像速度。沿着箭头所指示的平移通路，从ROI 1开始，执行在第二操作模式下的成像过程，以取得该ROI I的3D体积的图像。然后，样品被平移到下一个相邻的ROI 2，并重复相同的3D成像过程。如此，重复相同的过程直到完成整个ROI阵列的成像。具体说来，可以对各个ROI指定适合的激发物镜以取得其3D体积图像，并按照各个ROI之间的空间关系来整合各个3D体积图像，即可获得ROI阵列的3D图像。除了ROI的选择方式不同于第三操作模式，整个成像流程与之类似。

如图4(d)所示，为各个ROI动态地选择激发光所需要穿透样品深度更浅的的激发物镜用于成像，对于ROI 1-ROI 8所选择的是右侧的激发物镜以执行右侧照明，而对于ROI9-ROI 16所选择的是左侧的激发物镜以执行左侧照明。在一些实施例中，可以根据ROI阵列的行数和列数以及在x和y方向上的相邻ROI之间的横向平移步长来定义各个ROI。在一些实施例，ROI阵列中的ROI可以被选择为使得相邻ROI之间保持10-15％的重叠，从而被用于不同ROI之间的图像配准。

图6(a)-图6(g)示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜通过向其中的SLM加载各种相位图所能实现的激发光片的调整(包括平铺和校准)效果。

如图6(a)所示，通过向SLM加载相应的调制相位图，可以沿着激发光的传播方向在像平面内平铺光片，其中作为示例，像平面与检测焦平面对准，从而提高成像的分辨率。

如图6(b)所示，通过向SLM加载相应的调制相位图，可以改变平铺光片的几何形状，例如从上方的相对较薄且较短的激发光片改变为较厚且较长的激发光片，使得后者的长度大约为前者的1.5倍。

如图6(c)所示，通过向SLM加载相应的调制相位图，可以校准激发光片的倾斜，以确保校准后的激发光片与检测焦平面对齐。

如图6(d)所示，通过向SLM加载相应的调制相位图，可以校准不同平铺位置处平铺的激发光片在检测光轴方向上的位置，以确保激发光片在不同平铺位置总能够实现对焦。

如图6(e)所示，通过向SLM加载相应的调制相位图，可以校正不同激发波长(例如由于不同颜色通道导致)的激发光片在检测光轴方向上的位置偏差，以确保不同激发波长的激发光片的对焦。

如图6(f)所示，通过向SLM加载相应的调制相位图，可以调整利用不同激发物镜(例如所示的左侧激发物镜和右侧激发物镜)生成的激发光片在检测光轴方向上的位置，以确保通过不同激发物镜产生的激发光片的对焦。

如图6(g)所示，通过向SLM加载相应的调制相位图，可以调整利用不同激发物镜例如所示的左侧激发物镜和右侧激发物镜)生成的激发光片在横向(也就是x和y方向)上的位置，从而确保在使用不同折射率的成像缓冲液时，生成的激发光片的平铺位置均在检测FOV内。

图6(a)-图6(g)基本上涵盖了平铺光片显微镜会遇到的各种校准问题，且都能够通过向SLM加载相应的调制相位图来实现，调制相位图的加载和处理都可以通过软件来实现，而无需引入硬件更改，成本低廉，且操作更简单。

需要对SLM的调制相位图按需进行相应处理来得到相应的调制相位图，以便实现图6(a)-图6(g)中所示的各种校准效果。

图7(a)示出根据本公开实施例的对平铺光片显微镜中的SLM的调制相位图所进行的各种处理的示意图。如图7(a)所示，向SLM加载相应的调制相位图(也就是按需处理后的调制相位图)，也就是对SLM的光学调制平面叠加相位，等效于在入瞳平面(与激发物镜的入瞳共轭的平面)处的照明光波前上叠加相应的相位分布。可以对调制相位图按需进行如下处理：对SLM的光学调制平面施加绕着第一轴倾斜的相位(示意性标识为701)，以便改变激发光片的几何形状，所述第一轴与检测光轴平行(简称为第一处理)；对SLM的光学调制平面施加绕着与第一轴垂直的第二轴倾斜的相位(示意性标识为702)，以便校准激发光片在检测光轴方向上的位置(简称为第二处理)；移动所述调制相位图中的工作图案(示意性标识为704)，以便校准激发光片的倾斜(简称为第三处理)；以及对SLM的光学调制平面叠加球面相位(示意性标识为703)，以便校准激发光片在激发光传播方向上的位置(简称为第四处理)。

通过第一处理后得到的相应的调制相位图如图7(b)和图7(d)所示，通过加载这样的调制相位图，分别可以得到如图7(g)中所示的短且薄的激发光片和图7(i)中所示的长且粗的激发光片。

通过第二处理后得到的相应的调制相位图如图7(e)所示，通过加载这样的调制相位图，可以得到如图7(j)所示的在检测光轴的方向上偏离检测焦平面的激发光片，相应地，通过加载进行逆向的第二处理后的相应调制相位图，也可以将图7(j)所示的激发光片校准为回到检测焦平面。

通过第三处理得到的相应的调制相位图如图7(f)所示，通过加载这样的调制相位图，可以得到如图7(k)所示的相对于检测焦平面倾斜的激发光片，相应地，通过加载进行逆向的第三处理后的相应调制相位图，也可以将

图7(k)所示的倾斜的激发光片校准为与检测焦平面对齐(不再倾斜)。

通过第四处理得到的相应的调制相位图如图7(c)所示，通过加载这样的调制相位图，可以得到如图7(h)所示的在激发光传播方向上移动的激发光片，如此，可以实现在激发光传播方向上的光片平铺，也可以实现在激发光传播方向上的位置校准。

根据本公开各个实施例的控制子系统可以配置为执行如上处理步骤中的任何一种或多种，以经由软件向SLM加载相应的调制相位图，实现上述各种校准效果。

图8(a)示出根据本公开实施例的高斯光片的长度与厚度之间的关系的图示。图8(b)以等高线图示出根据本公开实施例的利用不同的检测数值孔径(NA)和光片厚度的高斯光片所能实现的理论轴向分辨率的图示，根据本公开实施例的利用不同的检测NA和光片长度的高斯光片所实现的轴向分辨率则如图8(c)所示。

图8(d)示出根据本公开实施例的利用2k×2k检测相机和不同的检测NA在奈奎斯特采样像素大小下获得的视场的大小。如图8(d)所示，例如，利用5倍的放大倍数和2k×2k的检测sCMOS相机，视场的大小为2.6毫米。由于像素数量有限，横向像素尺寸小于奈奎斯特采样尺寸，这导致横向分辨率为约2.6μm。在没有平铺的情况下，激发光片需要至少约2.6mm长且约11μm厚，利用0.25的检测NA可以提供约7μm的轴向分辨率。激发光片通过平铺两次，可以是约1.3mm长且约7.5μm厚并且提供约6μm的轴向分辨率。激发光片通过平铺4次，可以是约0.7mm长且约5μm厚，并且提供约4.5μm的轴向分辨率。使用平铺光片显微镜时，可以接收来自用户的预设放大倍率、分辨率和视场的要求，据此并通过参考类似于如图8(a)-图8(d)中所示的预设放大倍数、激发光片的长度、厚度、不同检测NA、轴向分辨率、横向分辨率、视场大小、平铺次数、平铺位置之间的关系图示，来确定所需的所述激发光片的几何形状、平铺次数和平铺位置，并通过向SLM加载相应的相位图予以实现。

图9(a)-图9(d)示出利用不同的激发NA生成的激发光束的横截面强度分布图，其中，图9(a)的NA_OD＝0.075，NA_ID＝0.03，图9(b)的NA_OD＝0.05，NA_ID＝0.02，图9(c)的NA_OD＝0.02，NA_ID＝0，而图9(d)的NA_OD＝0.013，NA_ID＝0

图9(a)-图9(d)中生成的激发光束可分别扫描获得虚拟激发光片，该虚拟激发光片的截面强度分布图分别如图9(e)-图9(h)中所示，强度曲线图分别如图9(i)-图9(l)所示，横截面强度分布图分别如图9(m)-图9(p)所示，其中，图9(q)和图9(r)分别是图9(m)和图9(n)的放大视图。从中可见，不同NA可以获得不同的光片形状和不同的激发光约束能力。

图10(a)-图10(f)示出根据本公开实施例的平铺光片显微镜所获取的与各个平铺位置1、2、3、4、5和6对应的各个独立的3D图像层的图示。

图10(g)示出基于图10(a)-图10(f)所示的各个3D图像层重建所得到的最终的3D图像。在一些实施例中，以将样品由多个ROI构成通过对各个ROI成像随后整合重建以得到样品的图像为例，对所获取的原始图像的处理过程进行具体说明。

可以对各个不同的ROI获取的原始图像执行如下的处理子流程：将每个ROI所获取的原始图像分离到多个3D图像层，使其数量等于平铺位置的数量；在每个分离的3D图像层中确定对应于平铺光片中央位置的区域，由此为该3D图像层计算幅值校准系数曲线；通过将各个分离的3D图像层乘以为其确定的对应的幅值校准系数曲线并求和，来获得ROI的3D图像。

可以重复以上处理子流程，以获得所有ROI的3D图像，然后对所有ROI的3D图像层进行配准和融合，从而获得整个样本体积的3D图像。在一些实施例中，可以在配准和融合之前，先对所获得的所有ROI的3D图像层进行下采样，以加速图像重建过程。

在本公开的各个实施例中结合平铺光片显微镜所描述的使用方法也作为独立的实施例结合于此。下面仅对该使用方法进行扼要说明，在上文中已经详释的细节和有益效果在此不赘述。所述使用方法主要包括：接收来自用户的预设放大倍率，并据此向SLM加载相位图来实现所述激发光片的几何形状、平铺次数和平铺位置。该使用方法可以方便地经由软件来实现。

在一些实施例中，所述使用方法包括：通过向所述SLM加载离焦相位图，实现在SLM的光学调制平面对激发光波前叠加球面相位，从而沿着激发光的传播方向对激发光片进行平铺。

在一些实施例中，所述使用方法包括通过对所述SLM的调制相位图按需执行如下处理步骤中的至少一种来实现相应校准：对SLM的光学调制平面施加绕着第一轴倾斜的相位，以便改变激发光片的几何形状，所述第一轴与检测光轴平行；对SLM的光学调制平面施加绕着与第一轴垂直的第二轴倾斜的相位，以便校准激发光片在检测光轴方向上的位置；移动所述调制相位图中的工作图案，以便校准激发光片的倾斜；以及对SLM的光学调制平面叠加球面相位，以便校准激发光片在激发光传播方向上的位置。

在一些实施例中，所述使用方法还包括：接收来自操作者的确认指令，并响应于该确认指令，停止对所述调制相位图执行处理步骤。

在一些实施例中，所述使用方法还包括：以第一操作模式、第二操作模式、第三操作模式和第四操作模式中的任一种来操作所述平铺光片显微镜，其中，在所述第一操作模式下，使得所述平铺光片显微镜执行对样品任意成像平面上的2D成像；在所述第二操作模式下，使得所述平铺光片显微镜执行对样品的选择的单个关注区域(ROI)的3D成像；在所述第三操作模式下，使得所述平铺光片显微镜执行对样品的选择的多个ROI的3D成像；以及在所述第四操作模式下，使得所述平铺光片显微镜执行对所选择ROI阵列的3D成像。

在一些实施例中，所述平铺光片显微镜包括：在成像室两侧的对称的第一照明路径和第二照明路径，以及所述第一照明路径末端的第一激发物镜和所述第二照明路径末端的第二激发物镜。而所述使用方法还包括：动态地选择所述第一激发物镜和所述第二激发物镜中对需要进行成像的ROI进行成像，激发光所需要穿透样品深度更浅的激发物镜用于该ROI的成像。

在一些实施例中，所述使用方法还包括：选择ROI阵列中的ROI，使得相邻ROI之间保持10-15％的重叠。

此外，尽管已经在本文中描述了示例性实施例，其范围包括任何和所有基于本公开的具有等同元件、修改、省略、组合(例如，各种实施例交叉的方案)、改编或改变的实施例。权利要求书中的元件将被基于权利要求中采用的语言宽泛地解释，并不限于在本说明书中或本申请的实施期间所描述的示例，其示例将被解释为非排他性的。因此，本说明书和示例旨在仅被认为是示例，真正的范围和精神由以下权利要求以及其等同物的全部范围所指示。

以上描述旨在是说明性的而不是限制性的。例如，上述示例(或其一个或更多方案)可以彼此组合使用。例如本领域普通技术人员在阅读上述描述时可以使用其它实施例。另外，在上述具体实施方式中，各种特征可以被分组在一起以简单化本公开。这不应解释为一种不要求保护的公开的特征对于任一权利要求是必要的意图。相反，本公开的主题可以少于特定的公开的实施例的全部特征。从而，以下权利要求书作为示例或实施例在此并入具体实施方式中，其中每个权利要求独立地作为单独的实施例，并且考虑这些实施例可以以各种组合或排列彼此组合。本发明的范围应参照所附权利要求以及这些权利要求赋权的等同形式的全部范围来确定。

以上实施例仅为本公开的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本公开的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。