一种鱼油中二十二碳六烯酸的分离纯化方法
阅读说明：本技术 一种鱼油中二十二碳六烯酸的分离纯化方法 (Method for separating and purifying docosahexaenoic acid in fish oil ) 是由 王希 陶冶 陈强强 郁明钧 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种鱼油中二十二碳六烯酸的分离纯化方法。本发明的鱼油中二十二碳六烯酸的分离纯化方法,包括如下步骤：1)将鱼油粗品进行溶解、过滤,得到鱼油溶液；2)将步骤1)得到的鱼油溶液上样到装有UniSil微球的层析柱中进行层析,采用纯水和有机溶剂作为流动相对鱼油溶液进行洗脱；3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的鱼油溶液,对符合要求的组份液进行汇总,得到纯化的二十二碳六烯酸。本发明的鱼油中二十二碳六烯酸的分离纯化方法,仅需一步层析分离纯化鱼油中DHA,不仅纯度高、收率高且稳定,而且操作简单方便,所用固定相可重复利用,所用流动相量少节约,大大降低了成本。(The invention provides a method for separating and purifying docosahexaenoic acid in fish oil. The method for separating and purifying the docosahexaenoic acid in the fish oil comprises the following steps: 1) dissolving and filtering the crude fish oil product to obtain a fish oil solution; 2) loading the fish oil solution obtained in the step 1) into a chromatographic column filled with UniSil microspheres for chromatography, and eluting the fish oil solution by using pure water and an organic solvent as mobile phases; 3) collecting the fish oil solution with the target peak value after chromatography and elution in the step 2) in sections, and summarizing the component liquid meeting the requirements to obtain the purified docosahexaenoic acid. The method for separating and purifying the docosahexaenoic acid in the fish oil only needs one-step chromatographic separation and purification of the DHA in the fish oil, not only has high purity, high and stable yield, but also has simple and convenient operation, can repeatedly utilize the used stationary phase, saves a small amount of the used mobile phase and greatly reduces the cost.)
技术领域
本发明属于分离纯化技术领域，涉及一种二十二碳六烯酸的分离纯化方法，尤其涉及一种鱼油中二十二碳六烯酸的分离纯化方法。
背景技术
DHA(docosahexaenoicacid，DHA)，二十二碳六烯酸，俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的不饱和脂肪酸，DHA是神经系统细胞生长及维持的一种主要成分，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20％，在眼睛视网膜中所占比例约50％，对胎婴儿智力和视力发育至关重要。好的DHA产品应该具备天然、安全、好吸收的特点，富含多种营养。
其中，DHA的结构式如下所示：
早期研究表明，DHA在自然界通常是以甘油三酯形态存在的。海洋鱼类，某些海藻或低等真菌是DHA的重要来源。以鱼油DHA为例，鱼体内含有的DHA是以甘油三酯形态存在，但含量较低，通常在5％～14％。人类为了获取DHA进行了长期的科学研究和实验。早期市场上的DHA是通过有机溶剂从鱼油或海藻中提取出来的，早期所采用的有机溶剂并没有改变DHA的结构，因此，早期使用有机溶剂所提取的DHA均为天然形态存在的甘油三酯型DHA，但提取效率低下。
为了提高提取效率，获取更高含量和更多的DHA，人们先后发明采用了低温分级法、溶剂提取法、尿素包合法、分子蒸馏法和超临界气体萃取法等方法。以溶剂提取法为例，将乙醇、鱼油及氢氧化钠(NaOH)按一定比例混合，然后加热使鱼油皂化。皂化后的混合液经压滤分别得到皂液及皂粒。皂液在搅拌下加人硫酸(H2SO4)，分离上层粗脂肪酸乙醇混合液，再加热回收乙醇，并反复水洗即得DHA含量较高的精制鱼油。用这种方法提取DHA的效率显著提高，但所得到的DHA不再是天然形态存在的甘油三酯型DHA，而是乙酯型DHA。目前市场上的DHA制品中有很大一部分为乙酯型DHA。
例如CN103864614A公开了一种从微生物发酵生产的DHA油脂中分离纯化DHA的方法，包括如下步骤：(1)取DHA油脂，进行乙酯化；(2)采用尿素包埋-梯度冷冻结晶法对乙酯化的DHA油脂进行初分离；(3)对初分离的脂肪酸乙酯进行分子蒸馏再分离，制备高纯度的DHA乙酯。基于多种分离纯化手段耦合形成的本发明方法明显地提高了DHA纯化，以隐甲藻产的DHA油脂为原料，可制得纯度＞98％的DHA乙酯；以裂殖壶菌产的DHA油脂为原料，可制得DHA乙酯+DPA乙酯＞98％的产品，该方法得到的是乙酯型DHA。
CN1757395A公开了一种纯化海狗油及其制备方法，该方法先将天然海狗油酯化，然后应用多级分子蒸馏纯化技术对酯化海狗油进行纯化并得到了纯化海狗油，所得到的纯化海狗油中的三种ω－3多烯脂肪酸－二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)总含量显著提高，同时海狗油的特异腥味基本被脱除干净，物理性状大为改善。但是，该方法得到的DHA的纯度和收率都有待提高。
因此，提供一种鱼油中二十二碳六烯酸的高效分离纯化方法很有必要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种鱼油中二十二碳六烯酸的分离纯化方法，仅需一步层析纯化即可满足纯度>97％的要求，纯化收率高而稳定，同时本发明分离方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低了生产成本。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种鱼油中二十二碳六烯酸的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)将DHA纯度为65-70％的鱼油粗品进行溶解、过滤，得到DHA的浓度为5-9mg/mL的鱼油溶液；
2)将步骤1)得到的鱼油溶液上样到装有UniSil微球的层析柱中进行层析，采用纯水和有机溶剂作为流动相对鱼油溶液进行洗脱，其中，所述流动相中有机溶剂的体积百分比为85-86％；
3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的鱼油溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化的二十二碳六烯酸。
步骤2)中，所述UniSil微球的型号是C18UniSil微球。C18UniSil微球是一种粒径为10-30μm、孔径为的高分子微球，该微球具有严格控制的粒径大小和孔径结构，为单分散的、具有孔道结构的微球，使其作为色谱填料时具有很好的针对性。优选地，所述C18UniSil微球的粒径为10μm。
步骤2)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或乙腈中的一种；优选为乙醇。
步骤1)中，所述鱼油粗品的DHA纯度为65-70％，例如为65％、66％、67％、68％、69％或70％等；所述鱼油溶液中DHA的浓度为5-9mg/mL，例如为5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL或9mg/mL等。
步骤2)中，所述流动相中，所述纯水与所述有机溶剂的体积比为(14-15):(85-86)。
本发明采用有机溶剂和纯化水作为流动相，仅用8-12个柱体积就可完成DHA的洗脱，因此本过程所用流动相安全、无污染且成本较低，并且使用的流动相量较少，纯化周期比较短。其中，本发明中填料的体积为490mL，即一个柱体积为490mL。
步骤2)中，所述洗脱的具体过程为：采用有机溶剂体积百分比为85-86％的流动相对鱼油溶液进行洗脱，所述洗脱的时间为50-70min，例如洗脱的时间为50min、51min、52min、53min、54min、55min、56min、57min、58min、59min、60min、61min、62min、63min、64min、65min、66min、67min、68min、69min或70min等；所述流动相的流速为70-80mL/min，例如为70mL/min、71mL/min、72mL/min、73mL/min、74mL/min、75mL/min、76mL/min、77mL/min、78mL/min、79mL/min或80mL/min等。
步骤2)上样前还包括对层析柱进行柱前处理的步骤。
所述柱前处理的具体过程为：采用纯乙醇对层析柱进行除杂，再采用有机溶剂体积百分比为85-86％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡。
步骤1)中，所述过滤采用孔径为0.3-0.5μm的滤膜进行过滤，例如滤膜的孔径为0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm或0.5μm等。
作为本发明的优选方案，一种鱼油中二十二碳六烯酸的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)将DHA纯度为65-70％的鱼油粗品进行溶解，采用孔径为0.3-0.5μm的滤膜进行过滤，得到DHA浓度为5-9mg/mL的鱼油溶液；
2)采用纯乙醇对装有C18UniSil微球的层析柱进行除杂，再采用有机溶剂体积百分比为85-86％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡，将步骤1)得到的鱼油溶液上样到经平衡处理的层析柱中进行层析，采用有机溶剂体积百分比为85-86％的流动相对鱼油溶液进行洗脱，所述洗脱的时间为50-70min，所述流动相的流速为70-80mL/min；
3)分段收集经步骤2)层析、洗脱后的目的峰值的鱼油溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化的二十二碳六烯酸。
本发明的目的之二在于提供一种目的之一所述的分离纯化方法得到的二十二碳六烯酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的鱼油中二十二碳六烯酸的分离纯化方法，仅需一步层析分离纯化鱼油中DHA，不仅纯度高、收率高且稳定，而且操作简单方便，所用固定相可重复利用，所用流动相量少节约，采用有机溶剂和纯化水作为流动相，仅用8-12个柱体积就可完成DHA的洗脱，因此本过程所用流动相安全、无污染且成本较低，并且使用的流动相量较少，纯化周期比较短，大大降低了成本。具体的，仅需一步层析纯化即可满足纯度>98％的要求，纯化收率>95％。
附图说明
图1为本发明的实施例1使用的C18UniSil微球的扫描电镜照片；
图2为本发明的实施例1纯化前的鱼油中二十二碳六烯酸(DHA)的气相色谱分析；
图3为本发明的实施例1纯化后的鱼油中二十二碳六烯酸(DHA)的气相色谱分析。
具体实施方式
下面结合附图1-3，并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
如无具体说明，本发明的各种原料均可市售购得，或根据本领域的常规方法制备得到。
实施例1
1)取DHA纯度为68％的鱼油粗品，加入85％乙醇溶液，溶液中DHA含量为7mg/mL；待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用；
2)采用50×250mm的色谱柱，UniSilC18(苏州纳微科技股份有限公司生产，粒径为10μm、孔径为)作为层析柱填料，装柱体积为490mL；对层析柱进行柱前预处理，先用纯乙醇进行除杂，后用乙醇体积百分比为85％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡；然后采用乙醇体积百分比为85％的流动相对鱼油溶液进行洗脱60min，流速控制在75mL/min；
3)分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中DHA的纯度为98.5％，收率为96.5％。
其中，图1为实施例1使用的C18UniSil微球的扫描电镜照片，可以看出C18UniSil微球具有严格控制的粒径大小和孔径结构，为单分散的、具有孔道结构的微球。图2是纯化前的鱼油中二十二碳六烯酸的气相色谱分析，可见有一定的杂质。图3是纯化后的鱼油中二十二碳六烯酸的气相色谱分析，可见杂质非常少，杂峰非常小。
实施例2
1)取DHA纯度为68％的鱼油粗品，加入86％乙醇溶液，溶液中DHA含量为7mg/mL；待溶液澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用；
2)采用50×250mm的色谱柱，UniSilC18(苏州纳微科技股份有限公司生产，粒径为10μm、孔径为)作为层析柱填料，装柱体积为490mL；对层析柱进行柱前预处理，先用高浓度有机相进行除杂，后用乙醇体积百分比为86％的流动相对除杂后的层析柱进行平衡；然后采用乙醇体积百分比为86％的流动相对鱼油溶液进行洗脱60min，流速控制在75ml/min；
3)分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中DHA的纯度为98.45％，收率为95.9％。
实施例3
本实施例与实施例1的区别之处在于，未进行柱前处理，即未对层析柱进行除杂和平衡，其他的与实施例1的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中DHA的纯度为98.35％，收率为95.4％。
实施例4
本实施例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相中的有机溶剂为甲醇，其他的与实施例1的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中DHA的纯度为98.43％，收率为95.1％。
对比例1
本对比例与实施例1的区别之处在于，层析柱中的填充相为市场上非均粒华谱15μmC18，其他的与实施例1的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中DHA的纯度为98.12％，收率为90.1％。
对比例2
本对比例为常规的DHA的纯化方法，直接采用分子精馏法。
馏分中DHA的纯度为80.5％。
对比例3
本对比例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相为纯甲醇，其他的与实施例1的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中DHA的纯度为70％，收率为98％。
对比例4
本对比例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相为中有机溶剂的体积百分比为50％，其他的与实施例1的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中DHA的纯度为98.76％，收率为80％。
对比例5
本对比例与实施例1的区别之处在于，平衡处理和洗脱处理所用的流动相为有机溶剂的体积百分比为95％，其他的与实施例1的均相同。
分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经气相色谱分析，洗脱液中DHA的纯度为97.5％，收率为96.3％。
本发明用于鱼油中二十二碳六烯酸(DHA)的深度精纯，仅需一步层析纯化即可满足DHA纯度>98％的要求，纯化收率>95％而稳定，同时本发明纯化分离方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低了生产成本。
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
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