基于异佛尔酮-肉桂醛的粘度荧光探针的制备和应用
阅读说明：本技术 基于异佛尔酮-肉桂醛的粘度荧光探针的制备和应用 (Preparation and application of viscosity fluorescent probe based on isophorone-cinnamaldehyde ) 是由 李春艳 廖沁婷 徐芬 于 2021-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及了基于异佛尔酮-肉桂醛的粘度荧光探针的制备和应用,该荧光探针的结构式为：本发明提供了以异佛尔酮、丙二腈、4-(二甲氨基)肉桂醛等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种近红外粘度荧光探针；首先,该荧光探针对粘度表现出很高的灵敏度,粘度增加,荧光强度显著增强；其次,该荧光探针对粘度表现出很高的选择性,不受其他活性氧、活性氮、活性硫以及生物硫醇的干扰；并且,该荧光探针具有较好的光稳定性,在120min持续光照下,荧光强度不变；此外,该荧光探针应用于活细胞内粘度的检测。(The invention relates to preparation and application of a viscosity fluorescent probe based on isophorone-cinnamaldehyde, wherein the structural formula of the fluorescent probe is as follows: the invention provides a preparation method for synthesizing the fluorescent probe by taking isophorone, malononitrile, 4- (dimethylamino) cinnamaldehyde and the like as raw materials; the fluorescent probe is a near-infrared viscosity fluorescent probe; firstly, the fluorescent probe shows high sensitivity to viscosity, the viscosity is increased, and the fluorescence intensity is obviously enhanced; secondly, the fluorescent probe shows high selectivity to viscosity and is free from other active oxygen and active nitrogenActive sulfur and biological thiol interference; in addition, the fluorescent probe has better light stability, and the fluorescence intensity is unchanged under the continuous illumination for 120 min; in addition, the fluorescent probe is applied to the detection of the viscosity in living cells.)
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及基于异佛尔酮-肉桂醛的粘度荧光探针的制备和应用。
背景技术
粘度是生物系统中重要的微环境参数，在信号传递、电子传递以及生物分子间相互作用等方面起着重要作用(R.Kotani,H.Sotome,H.Okajima,S.Yokoyama,Y.Nakaike,A.Kashiwagi,J.Mater.Chem.C,2017,5,5248-5256；E.Schenborn,D.Groskreutz,Mol.Biotechnol.,1999,13,29-44)。细胞内粘度异常可能会使细胞功能遭到破坏，导致多种疾病的产生。研究表明，粘度变化与高血压、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、糖尿病等多种疾病密切相关(M.Kuimova,S.Botchway,A.Parker,M.Balaz,H.Colins,H.Anderson,NatureChem,2009,1,69-73；G.S.Zubenko,U.Kopp,T.Seto,L.L.Firestone,Psychopharmacology,1999,145,175-180；M.Morohoshi,K.Fujisawa,I.Uchimuraa,F.Numano,Diabetes,1996,45,954-959)。鉴于粘度重要的生理及临床意义，精确检测粘度变化是十分有必要的。
近年来，各种测量大体积液体的粘度计得到了很好的发展，如球滴粘度计、活塞粘度计和旋转粘度计。然而，这些测量方法无法检测细胞内的粘度变化(K.Zhou,M.Ren,B.Deng,W.Lin,New J.Chem,2017,41,11207-11511)。荧光成像技术具有高灵敏度、高特异性、对细胞损伤小和操作简单等的优点，成为在生物体内实时检测目标物质最强大的工具之一。到目前为止，已有一些对细胞内粘度成像的荧光探针的报道(J.Yin,P.Min,W Lin,Anal.Chem.,2019,91,8415-8421；S.J.Li,Y.F.Li,H.W Liu,D.Y.Zhou,W.L.Jiang,Ou-Yang,Anal.Chem.,2018,90,9418-9425；Z.Yang,Y.He,J.H.Lee,N.Park,M.Suh,W.H.Chae,J.Am.Chem.Soc.,2013,135,9181-9186)。然而，大多数的荧光材料仍存在发射波长短、高本底荧光等局限性。因此，设计和合成具有长波长和响应倍数高的荧光探针是非常迫切且有意义的。
发明内容
根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种基于异佛尔酮-肉桂醛的近红外粘度荧光探针。
本发明的技术方案是，一种基于异佛尔酮-肉桂醛的粘度荧光探针，其结构式如下：
一种基于异佛尔酮-肉桂醛的粘度荧光探针的制备方法。步骤如下：
1)在50mL圆底烧瓶中，加入15～20mL无水乙醇，接着，将1当量的异佛尔酮和1～1.5当量的丙二腈加入烧瓶混合，再滴加哌啶，在N2保护的条件下，使反应混合物在50～80℃搅拌回流10～14h，停止反应，冷却至室温，倒入盛有70～100g冰水的烧杯中，析出棕黄色固体，静置1～2h，抽滤，干燥，收集到粗产品，用正庚烷重结晶，抽滤，干燥，得到黄棕色固体化合物丙二腈-异佛尔酮(产率60％)。2)在50mL圆底烧瓶中，加入15～25mL无水乙醇，接着，将1当量的上述产品和1～5当量的4-(二甲氨基)肉桂醛混合，在70～90℃的条件下，反应混合物搅拌回流8～15h，停止反应，用减压蒸馏除去溶剂，得到粗产品，再用体积比为1:2～3:1的石油醚/二氯甲烷进行柱层析，除去溶剂后得到红棕色固体，即为所述荧光探针IC-V。
本发明的有益效果是，一种基于异佛尔酮-肉桂醛的粘度荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究该探针的荧光光谱性质。荧光探针本身与水混合在700nm处没有明显的近红外发射峰；探针与甘油混合之后，在700nm处出现了明显的近红外发射峰。并且随着甘油体积增大，粘度增加，探针的近红外荧光强度不断增强。该探针的线性检测范围从1.29cp到545.03cp，这说明该探针可以高灵敏的检测粘度变化。接着，研究探针的紫外吸收光谱。探针本身在500nm处有吸收带；与甘油混合之后，500nm处的吸收峰发生红移且逐渐增大，溶液颜色从粉色变为紫色。然后，研究探针的选择性。考察了探针与活性氧(H2O2,ClO-)，活性氮(NO2 -,NO3 -)，活性硫(HS-,SO3 2-,S2O4 2-,SO4 2-)，常见阳离子(K+,Mg2+,Na+,Fe2+,Zn2+,Ag+,Cu2+,NH4 +)，常见阴离子(Cl-,Br-,I-,CH3COO- ,CO3 2-)(200μM)以及生物硫醇(GSH)的荧光响应情况。结果发现，只有粘度大的甘油能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。最后，研究了pH值对荧光探针测定粘度的影响，当pH值在5.0到8.0之间时，不影响荧光探针对粘度的测定。此外，该荧光探针光稳定性好，荧光强度在120min以内保持稳定。
一种基于异佛尔酮-肉桂醛的粘度荧光探针的应用。在细胞中只加入荧光探针，红色通道几乎没有荧光。细胞用制霉菌素(Nystatin)处理，刺激细胞内粘度升高，然后加入探针，检测到细胞内出现了很强的红色荧光信号。这些结果说明荧光探针能监控细胞内粘度的变化，这为监控人体内和粘度相关病变提供一种可靠的手段。
附图说明
图1为荧光探针的合成路线。
图2为荧光探针在不同粘度溶液中的荧光光谱图。
横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度为10μM，甘油(Gly)浓度分别为：0,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,99％，其粘度值分别为1.05,1.29,1.71,2.37,3.44,5.56,9.02,17.43,40.13,121.91,545.03cp。荧光激发波长为530nm。
图3为荧光探针对于不同粘度的荧光线性响应图。
图4为荧光探针在不同粘度溶液中的紫外可见吸收光谱图。
图5为荧光探针对粘度测定的选择性图。
荧光探针的浓度为10μM，甘油浓度为99％，其它分析物浓度均为200μM。
图6为pH对荧光探针的影响图。
图7为荧光探针连续激光照射时荧光强度随时间变化的关系曲线图。
图8为细胞毒性试验。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。
图9荧光探针与粘度作用的细胞成像图。第一行细胞用探针染色20min。第二行细胞用Nystatin处理30min，然后再用探针染色20min。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。
实施例1：
荧光探针的合成
合成路线如图1。丙二腈-异佛尔酮的合成：在50mL的圆底烧瓶中加入15mL的无水乙醇，再将异佛尔酮(0.95g,6.9mmol)和丙二腈(0.45g,6.9mmol)加入圆底烧瓶进行混合，最后加入10μL哌啶，在60℃下搅拌回流12h，反应过程用N2保护。反应结束后冷却至室温，然后将混合物倒入装有80g冰水的烧杯，析出棕黄色固体，静置1h后进行抽滤，干燥，得到粗产品，接着用正庚烷重结晶，抽滤干燥，得到0.77g黄棕色化合物(产率60％)。
荧光探针(IC-V)的合成：在50mL的圆底烧瓶中加入15mL无水乙醇，再将化合物1(27.9mg,0.15mmol)和4-(二甲氨基)肉桂醛(26.2mg,0.15mmol)加入烧瓶混合，最后滴加0.1mL哌啶和0.1mL乙酸，反应混合物在80℃下搅拌回流12h后停止反应，蒸馏除去溶剂得到粗产品，再用石油醚/二氯甲烷(1:1)作为洗脱剂进行柱层析，解压蒸馏除去溶剂得到31.3mg红棕色固体产物(产率60％)，即为荧光探针。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ7.41(d,J＝8.0Hz,2H),7.02(d,J＝8.0Hz,1H),6.80-6.75(m,3H),6.45(s,2H),6.24(s,1H),3.02(s,6H),2.01(s,4H),1.05(s,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm):δ149.9,140.7,138.8,138.4,129.9,129.4,128.4,127.7,126.8,123.4,123.0,111.4,111.1,76.3,76.6,43.3,39.2,38.3,30.4,28.7.MS(TOF):344.2.
实施例2：
荧光探针和不同粘度溶液配制
探针溶液的制备：称取一定量探针溶解在二甲基亚砜中，配成1×10-4M的探针溶液。不同粘度溶液的配制：向10mL的容量瓶加入1mL的探针溶液，再分别加入不同百分比的甘油(Gly)后，用缓冲溶液进行定容，得到浓度为得到浓度为1.0×10-5mol·L-1的荧光探针和不同粘度的甘油混合待测溶液。
实施例3：
荧光探针与不同粘度溶液作用的荧光光谱的测定
图2为荧光探针与不同粘度溶液作用的荧光光谱，荧光探针浓度为10μM，甘油(Gly)浓度分别为：0,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,99％，于其相对应的粘度为1.05,1.29,1.71,2.37,3.44,5.56,9.02,17.43,40.13,121.91,545.03cp。激发波长固定为530nm，发射波长范围为550～900nm。狭缝宽度为5.0nm/5.0nm，所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图2可以看出，荧光探针本身在近红外(700nm)处没有明显的近红外发射峰；加入甘油溶液之后，在700nm处出现了明显的近红外发射峰。这是因为探针遵循TICT机制，在无粘性或低粘度溶液中自由旋转，被激发的染料通过非辐射跃迁过程返回基态。随着甘油浓度的增加，溶液粘度增加，粘性环境会抑制分子的旋转，阻止激发态分子通过非辐射跃迁到基态，只能通过辐射跃迁才能回到基态，从而探针的近红外分子的荧光强度不断增强。图3为探针对粘度的线性响应图。荧光强度的对数跟粘度的对数呈现线性关系，线性范围是1.29～545.03cp，这说明该探针可以高灵敏的检测粘度。
实施例4：
荧光探针与粘度作用的紫外可见吸收光谱的测定
图4为荧光探针与粘度作用后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为10μM，甘油(Gly)浓度为0％，99％。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦Cary60紫外可见分光光度计。从图4中可以看出，探针本身在510nm处有吸收带；加入甘油溶液之后，吸收峰随着粘度增大而发生红移，且吸收峰强度增大。
实施例5：
荧光探针对粘度测定的选择性
图5为荧光探针对粘度测定的选择性图。考察在浓度为10μM的荧光探针溶液中分别加入缓冲溶液、甘油(Gly,99％)，活性氧(H2O2,ClO-)，活性氮(NO2 -,NO3 -)，活性硫(HS-,SO3 2-,S2O4 2-,SO4 2-)，常见阳离子(K+,Mg2+,Na+,Fe2+,Zn2+,Ag+,Cu2+,NH4 +)，常见阴离子(Cl-,Br-,I-,CH3COO-,CO3 2-)以及生物硫醇(GSH)(200μM)的荧光响应情况。从图5中可以看出，只有粘度能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。这些结果表明，荧光探针对粘度有较好的选择性。
实施例6：
溶液pH值对荧光探针测定粘度的荧光性质的影响
考察pH值对荧光探针测定粘度的荧光光谱的影响，其结果如图6。我们研究的pH范围为3.0～10.0，荧光探针的浓度为10μM。从图中可以看出，荧光探针随着pH的变化，荧光强度基本不变，说明pH对探针本身没有很大的影响。然而，加入甘油溶液之后，在pH在5.0～8.0范围内，荧光强度比值显著增强。综上所述，当pH值在5.0到8.0之间时，不影响荧光探针对粘度的测定，是比较合适的pH值范围，这非常有利于该探针用于实际样品中粘度的测定。
实施例7：
荧光探针与粘度作用的光稳定性测定
我们研究了荧光探针与粘度作用的光稳定性测定，其结果如图7。从图中可以看出，该探针对粘度的响应迅速，并且在接下来的120min连续光照下，荧光强度不发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好，能够满足在实际样品中进行实时监测的要求。
实施例8：
荧光探针在活细胞中的应用
首先，我们做了细胞毒性试验，如图8所示。当加入0～30μM IC-V探针，细胞的成活率均在90％以上。这可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的粘度。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择HeLa细胞进行共聚焦显微成像，结果如图9所示。在第一行的细胞中只加入荧光探针，红色通道几乎没有荧光。文献报道制霉菌素(Nystatin)可以刺激细胞内粘度异常。第二行的细胞用制霉菌素(Nystatin)预先处理30min，刺激细胞内粘度的产生，然后加入探针染色20min，检测到细胞内出现了很强的红色荧光信号。这些结果说明荧光探针能监控细胞内粘度含量的变化，这为监控人体内和粘度异常相关病变提供一种可靠的手段。
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