阅读说明：本技术 全长启动子质粒pgl3-trem-1的构建方法、其调控方法及其转录因子的筛选方法 (Construction method of full-length promoter plasmid PGL3-TREM-1, regulation and control method thereof and screening method of transcription factor thereof ) 是由 段练 高文曦 朱丹丹 沈培 张天宇 段义农 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供全长启动子质粒PGL3-TREM-1的构建方法,包括以下过程：收集小鼠肝脏组织,抽提小鼠肝脏组织的DNA,并以所抽取的DNA为模板及根据TREM-1启动子特异性引物进行PCR,获得的PCR产物连接至PGL3-Basic载体,连接产物转化至DH5α感受态细胞,获得的阳性克隆进行酶切、PCR及测序鉴定,对所构建的PGL3-TREM-1进行活性鉴定,PGL3-TREM-1构建成功。本发明还提供全长启动子质粒PGL3-TREM-1的调控方法,根据调控需求选择以后抑制方法或增强方法；本发明的实施例另外还提供全长启动子质粒PGL3-TREM-1的转录因子的筛选方法。(The invention provides a construction method of a full-length promoter plasmid PGL3-TREM-1, which comprises the following steps: collecting mouse liver tissues, extracting DNA of the mouse liver tissues, carrying out PCR by using the extracted DNA as a template and a specific primer according to a TREM-1 promoter, connecting an obtained PCR product to a PGL3-Basic vector, transforming the connected product to a DH5 alpha competent cell, carrying out enzyme digestion, PCR and sequencing identification on the obtained positive clone, carrying out activity identification on the constructed PGL3-TREM-1, and successfully constructing the PGL 3-TREM-1. The invention also provides a regulation and control method of the full-length promoter plasmid PGL3-TREM-1, and a subsequent inhibition method or an enhancement method is selected according to regulation and control requirements; the embodiment of the invention also provides a screening method of the transcription factor of the full-length promoter plasmid PGL 3-TREM-1.)

全长启动子质粒PGL3-TREM-1的构建方法、其调控方法及其转 录因子的筛选方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及全长启动子质粒PGL3-TREM-1的构建方法、其调控方法及其转录因子的筛选方法。

背景技术

巨噬细胞极化过程涉及多种细胞因子和受体，其中髓系细胞触发受体（triggering receptor expressed on myeloid cells, TREM）是近年来引起人们关注的一类分子。TREMs是一类隶属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，主要包括TREM-1和TREM-2等，在炎症和免疫调节中发挥重要作用。研究表明，TREM-1信号通路的激活能够促进单核细胞分泌TNF-α、IL-8等促炎因子，在炎症反应的触发和放大过程中起着重要作用。同时，TREM-1介导的信号转导都能够促进巨噬细胞向M1极化，也就是说TREM-1具有使巨噬细胞从M2型向M1型极化的能力。血吸虫病肝纤维化发展过程中，巨噬细胞从M1逐渐向M2期转化，研究表明，曼氏血吸虫感染进程中脾脏巨噬细胞TREM-1表达持续增加，感染后第5周达到高峰，其后逐步下降。TREM-1在血吸虫病肝纤维化进程中的表达变化机制，未见报道；血吸虫病主要表现为以虫卵为中心的炎性肉芽肿形成以及肝纤维化形成，研究表明血吸虫肝纤维化的发生和发展与血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）密切相关，SEA 作为一种混合蛋白，其组分蛋白尤其P40 蛋白对肝脏巨噬细胞的调控机制的研究尤为重要，而其重组蛋白rSjP40对巨噬细胞中TREM-1表达的调控机制，也尚未见报道。

发明内容

本发明提供全长启动子质粒PGL3-TREM-1的构建方法、其调控方法及其转录因子的筛选方法。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供全长启动子质粒PGL3-TREM-1的构建方法，其特征在于，包括以下过程：收集小鼠肝脏组织，抽提小鼠肝脏组织的DNA，并以所抽取的DNA为模板及根据序列号：ENSMUSG00000042265的序列所设计的TREM-1启动子特异性引物进行PCR，获得的PCR产物连接至PGL3-Basic载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得的阳性克隆进行酶切、PCR及测序鉴定，对所构建的PGL3-TREM-1进行活性鉴定，PGL3-TREM-1构建成功。

进一步的，所述全长启动子质粒PGL3-TREM-1的活性鉴定包括以下过程：将PGL3-TREM-1质粒转染至RAW264.7细胞，荧光素酶活性检测试剂盒检测PGL3-TREM-1启动子活性。

本发明的实施例另外提供全长启动子质粒PGL3-TREM-1的调控方法，其特征在于，根据调控需求选择抑制方法或增强方法，具体包括，a. 抑制方法：将PGL3-TREM-1质粒转染至RAW264.7细胞，并经rSjP40处理，荧光素酶活性检测试剂盒检测PGL3-TREM-1启动子活性，PGL3-TREM-1启动子活性降低；b. 增强方法：将PGL3-TREM-1质粒转染至RAW264.7细胞，经作为作为阳参的LPS刺激后，荧光素酶活性检测试剂盒检测PGL3-TREM-1启动子活性，PGL3-TREM-1启动子活性增强。

本发明的实施例另外还提供全长启动子质粒PGL3-TREM-1的转录因子的筛选方法，其特征在于，包括以下过程：

（1）根据生物信息学分析显示PGL3-TREM-1质粒所包含的启动子区域上，存在转录因子FOXO3a结合位点；

（2）利用CHIP实验，确认PGL3-TREM-1启动子能够与转录因子FOXO3a结合；

（3）PGL3-TREM-1质粒为模板，利用特异性截短引物进行PCR，获得的PCR产物连接至PGL3-Basic载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得的阳性克隆进行酶切、PCR及测序鉴定后命名为PGL3-TREM-1A和PGL3-TREM-1B；其中PGL3-TREM-1A为去除一个FOXO3a结合位点的截短启动子质粒，PGL3-TREM-1B为去除两个FOXO3a结合位点的截短启动子质粒；

（4）将获得的PGL3-TREM-1A和PGL3-TREM-1B质粒分别转染至RAW264.7细胞，并经rSjP40处理，荧光素酶活性检测试剂盒检测PGL3-TREM-1A和PGL3-TREM-1B启动子活性；结果显示rSjP40不能抑制RAW264.7细胞中PGL3-TREM-1A和PGL3-TREM-1B启动子活性；

（5）转录因子FOXO3a能够增强PGL3-TREM-1启动子活性。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

本发明的全长启动子质粒PGL3-TREM-1的构建方法、其调控方法及其转录因子的筛选方法，其中构建方法所构建的PGL3-TREM-1及其截短启动子质粒，能够用于TREM-1参与血吸虫病巨噬细胞极化调控机制的研究，并能够用于重组蛋白rSjP40参与巨噬细胞极化调控机制的研究，为进一步研究血吸虫病肝纤维化发生发展机制奠定基础。

附图说明

图1为本发明的实施例中全长启动子质粒PGL3-TREM-1的活性统计图。

图2为本发明的实施例中FOXO3a与全长启动子质粒PGL3-TREM-1的-1598~-1605区域结合图。

图3为本发明的实施例中FOXO3a与全长启动子质粒PGL3-TREM-1的-1333~-1339区域结合图。

图4为本发明的实施例中rSjP40对PGL3-TREM-1及FOXO3a结合位点截短后的启动子活性影响图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

全长启动子质粒PGL3-TREM-1的构建方法，包括以下过程：收集小鼠肝脏组织，抽提小鼠肝脏组织的DNA，并以所抽取的DNA为模板及根据序列号：ENSMUSG00000042265的序列所设计的TREM-1启动子特异性引物进行PCR，获得的PCR产物连接至PGL3-Basic载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得的阳性克隆进行酶切、PCR及测序鉴定，对测序鉴定后的PGL3-TREM-1进行活性鉴定，PGL3-TREM-1构建成功。

进一步的实施例中，所述全长启动子质粒PGL3-TREM-1的活性鉴定包括以下过程：将PGL3-TREM-1质粒转染至RAW264.7细胞，荧光素酶活性检测试剂盒检测PGL3-TREM-1启动子活性。在本发明中，将构建的PGL3-TREM-1启动子转染至RAW264.7巨噬细胞，荧光素酶报告系统检测启动子活性，可以发现与PGL3-Basic相比，PGL3-TREM-1启动子活性增强，PGL3-TREM-1启动子构建成功。

全长启动子质粒PGL3-TREM-1的调控方法，具体包括：a. 抑制方法：将PGL3-TREM-1质粒转染至RAW264.7细胞，并经rSjP40处理，荧光素酶活性检测试剂盒检测PGL3-TREM-1启动子活性，PGL3-TREM-1启动子活性降低；b. 增强方法：将PGL3-TREM-1质粒转染至RAW264.7细胞，经作为作为阳参的LPS刺激后，荧光素酶活性检测试剂盒检测PGL3-TREM-1启动子活性，PGL3-TREM-1启动子活性增强；具体检测结构如图1所示，将构建的PGL3-TREM-1启动子转染至RAW264.7巨噬细胞，荧光素酶报告系统检测启动子活性，可以发现与PGL3-Basic相比，PGL3-TREM-1启动子活性增强；PGL3-TREM-1启动子质粒可以应用于rSjP40处理的RAW263.7细胞，在rSjP40处理的RAW263.7细胞中，rSjP40能够抑制RAW264.7细胞中PGL3-TREM-1启动子活性；而加入阳参的LPS刺激后，PGL3-TREM-1启动子活性增强。

全长启动子质粒PGL3-TREM-1的转录因子的筛选方法，包括以下过程：

（1）根据生物信息学分析显示PGL3-TREM-1质粒所包含的启动子区域上，存在转录因子FOXO3a结合位点；

（2）利用CHIP实验，确认PGL3-TREM-1启动子能够与转录因子FOXO3a结合；

（3）PGL3-TREM-1质粒为模板，利用特异性截短引物进行PCR，获得的PCR产物连接至PGL3-Basic载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得的阳性克隆进行酶切、PCR及测序鉴定后命名为PGL3-TREM-1A和PGL3-TREM-1B；其中PGL3-TREM-1A为去除一个FOXO3a结合位点的截短启动子质粒，PGL3-TREM-1B为去除两个FOXO3a结合位点的截短启动子质粒；如图2和图3所示。

（4）将获得的PGL3-TREM-1A和PGL3-TREM-1B质粒分别转染至RAW264.7细胞，并经rSjP40处理，荧光素酶活性检测试剂盒检测PGL3-TREM-1A和PGL3-TREM-1B启动子活性；结果显示rSjP40不能抑制RAW264.7细胞中PGL3-TREM-1A和PGL3-TREM-1B启动子活性；

（5）转录因子FOXO3a能够增强PGL3-TREM-1启动子活性。

如图4所示，在rSjP40处理的RAW263.7细胞中，rSjP40能够抑制RAW264.7细胞中PGL3-TREM-1启动子活性，对PGL3-TREM-1A以及PGL3-TREM-1B启动子活性没有影响，说明rSjP40通过FOXO3a转录因子调控TREM-1启动子活性，也说明这三种质粒可以应用于针对FOXO3a转录因子调控TREM-1启动子活性。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。