阅读说明：本技术 利用了atp的物质的制造方法 (Method for producing substance using ATP ) 是由 松井美里 伊藤纪幸 八十原良彦 于 2018-04-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种利用了ATP的新型的物质制造方法。本发明的制造方法是利用ATP制造物质的方法,该制造方法与ATP再生反应相互关联,所述ATP再生反应使2型多聚磷酸盐激酶和多聚磷酸与由ATP生成的ADP发生反应而再生ATP,其中,该制造方法中利用的ATP包含通过与该制造方法相互关联的该ATP再生反应所再生的ATP,作为该2型多聚磷酸盐激酶的底物,使用包含48％以上的聚合度15以上的多聚磷酸的多聚磷酸混合物。(The present invention provides a novel method for producing a substance using ATP. The production method of the present invention is a method for producing a substance using ATP, the production method being associated with an ATP regeneration reaction in which ATP is regenerated by reacting type 2 polyphosphate kinase and polyphosphate with ADP generated from ATP, wherein the ATP used in the production method includes ATP regenerated by the ATP regeneration reaction associated with the production method, and a polyphosphate mixture including polyphosphate having a polymerization degree of 15 or more of 48% or more is used as a substrate for the type 2 polyphosphate kinase.)

利用了ATP的物质的制造方法

技术领域

本发明涉及利用了ATP的新型物质制造方法。

背景技术

谷胱甘肽是由L-半胱氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸这3个氨基酸构成的肽，不仅存在于人体，还存在于其它动物、植物、微生物等多数生物体内。另外，谷胱甘肽具有消除活性氧的作用、解毒作用、氨基酸代谢等功能，对于生物体是重要的化合物。

谷胱甘肽在生物体内以还原型谷胱甘肽(以下有时也称为“GSH”)或氧化型谷胱甘肽(以下有时也称为“GSSG”)的任一种形态存在，所述还原型谷胱甘肽是L-半胱氨酸残基的硫醇基被还原的SH形态，所述氧化型谷胱甘肽是L-半胱氨酸残基的硫醇基被氧化而在2分子谷胱甘肽之间形成了二硫键的形态。

作为谷胱甘肽的制造方法，已知在L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸及表面活性剂、有机溶剂的存在下，使用将γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶重组而生产得到的大肠埃希氏菌、酿酒酵母的菌体作为酶源的酶法等(专利文献1及2)。另外，最近申请人公开了一种氧化型谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：由L-谷氨酸和L-胱氨酸制造氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸，接着由氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸制造氧化型谷胱甘肽的工序(专利文献3)。

作为与谷胱甘肽合成相关的酶，已知有使L-谷氨酸与L-半胱氨酸结合而生成γ-谷氨酰半胱氨酸的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(以下，有时也称为“GSHI”)、和使γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸结合而生成还原型谷胱甘肽的谷胱甘肽合成酶(以下，有时也称为“GSHII”)。另外，已知GSHI及GSHII也可以分别以L-胱氨酸、氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸为底物进行利用，在该情况下，作为各酶反应的产物，分别合成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸、氧化型谷胱甘肽(专利文献3)。另外，还已知兼具GSHI及GSHII两者的功能的双功能谷胱甘肽合成酶(以下，有时也称为“GSHF”)(专利文献3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭60-27396号公报

专利文献2：日本特开昭60-27397号公报

专利文献3：国际公开第2016/002884号公报

发明内容

发明要解决的课题

然而，GSHI、GSHII、GSHF等消耗三磷酸腺苷(以下，有时也称为“ATP”)作为其活性的能源。因此，为了保持制造谷胱甘肽的反应，需要从外部提供ATP、或者将作为ATP的消耗产物的二磷酸腺苷(以下，有时也称为“ADP”)再次转化为ATP。

这里，在从外部提供ATP的情况下，会产生高成本，因此正在研究将ADP再次转化为ATP的ATP再生体系的利用。

在ATP再生体系中，作为将ADP转化为ATP的酶，已知有2型多聚磷酸盐激酶，该酶具有以偏磷酸等作为底物将ADP转化为ATP的功能。

但是，在包含ATP再生体系作为物质制造的一个工序的制造方法、例如氧化型谷胱甘肽的制造方法中，为了获得从原料转化为最终产物(例如，氧化型谷胱甘肽)的高转化率，要求对ATP再生体系的进一步改进。

鉴于上述情况，本发明的目的在于提供利用了ATP的新型的物质制造方法。

解决课题的方法

本发明人等为了实现上述目的而进行了深入研究，结果首次发现，通过使用包含高聚合度多聚磷酸的混合物作为2型多聚磷酸盐激酶的底物，可以获得对氧化型谷胱甘肽的高转化率，从而完成了本发明。

即，本发明的一个方式为一种物质的制造方法，其是利用ATP制造物质的方法，该制造方法与ATP再生反应相互关联，所述ATP再生反应使2型多聚磷酸盐激酶和多聚磷酸与由ATP生成的ADP发生反应而再生ATP，其中，该制造方法中利用的ATP包含通过与该制造方法相互关联的该ATP再生反应所再生的ATP，作为该2型多聚磷酸盐激酶的底物，使用包含48％以上的聚合度15以上的多聚磷酸的多聚磷酸混合物。

发明的效果

根据本发明的一个方式，可以廉价且高转化率地进行利用ATP的物质制造。

附图说明

图1是示出了多聚磷酸混合物的聚合度的分析结果的图。

图2是对多聚磷酸混合物比较了因制备后的放置期间不同而引起的聚合度变动的图。

图3是示出了氧化型谷胱甘肽的制造过程中多聚磷酸混合物的消耗的变动的图。

具体实施方式

以下，对本发明的一个实施方式进行详细说明。需要说明的是，在本说明书中，以参考的形式援引本说明书中记载的全部学术文献及专利文献。

在本说明书中使用的情况下，用语“基因”可以与“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”交换使用，是指核苷酸的聚合物。这里，基因可以以DNA的形态(例如，cDNA或基因组DNA)、或RNA(例如，mRNA)的形态存在。DNA或RNA可以是双链，也可以是单链。单链DNA或RNA可以是编码链(正义链)，也可以是非编码链(反义链)。另外，基因可以化学合成，也可以改变密码子选择(Codon usage)以提高编码的蛋白质的表达。只要是编码相同氨基酸的密码子彼此，也可以进行取代。

另外，用语“蛋白质”可以与“肽”或“多肽”交换使用。在本说明书中使用的情况下，碱基及氨基酸的表示适当使用IUPAC及IUB规定的1字母表示或3字母表示。

〔物质的制造方法〕

在本发明的一个实施方式中，提供一种物质的制造方法，其是利用ATP制造物质的方法，该制造方法与ATP再生反应相互关联，所述ATP再生反应使2型多聚磷酸盐激酶和多聚磷酸与由ATP生成的ADP发生反应而再生ATP，其中，该制造方法中利用的ATP包含通过与该制造方法相互关联的该ATP再生反应所再生的ATP，作为该2型多聚磷酸盐激酶的底物，使用包含48％以上的聚合度15以上的多聚磷酸的多聚磷酸混合物。

本发明的一个实施方式基于首次发现的以下见解，即，在利用ATP制造物质的方法中，通过使用包含一定量以上的特定聚合度、尤其是高聚合度的多聚磷酸的多聚磷酸混合物作为2型多聚磷酸盐激酶的底物对ATP进行再生，可以高转化率地进行使用了该ATP的物质制造。因此，在本发明的一个实施方式中，通过在ATP再生反应中使用包含一定量以上的高聚合度多聚磷酸的多聚磷酸混合物，可以廉价且高转化率地制造物质。

以下，对本发明的各构成进行详细说明。

＜1.多聚磷酸混合物＞

在本发明的一个实施方式中，优选使用2型多聚磷酸盐激酶和作为该2型多聚磷酸盐激酶的底物的多聚磷酸混合物，所述多聚磷酸混合物包含48％以上的聚合度15以上的多聚磷酸。在本发明的一个实施方式中，通过使用上述的包含一定量以上的高聚合度多聚磷酸的多聚磷酸混合物，可以廉价且高转化率地制造物质。

在本说明书中，“多聚磷酸”是指磷酸聚合而成的磷酸的聚合物，例如为下式1所示的化合物。

化学式1

在本说明书中，“偏磷酸”是指具有磷酸的链状聚合物结构及环状结构的化合物。“偏磷酸”不仅有例如上述式1所示的化合物(相当于“磷酸的链状聚合物结构”)，还具有下式2所示的化合物(相当于“环状结构”)。

化学式2

在本说明书中，“多聚磷酸混合物”是指上述“多聚磷酸”及“偏磷酸”中的任一者、或者包含两者的集合体。“多聚磷酸混合物”中包含的“多聚磷酸”和/或“偏磷酸”的比率只要起到本申请发明的效果即可，没有特别限定。

需要说明的是，由于“多聚磷酸”及“偏磷酸”可以混合存在，因此难以严格区分。因此，在本说明书中，“多聚磷酸”及“偏磷酸”没有严格区分，记载为“多聚磷酸”时包含“偏磷酸”，记载为“偏磷酸”时包含“多聚磷酸”。

在本发明的一个实施方式中，多聚磷酸混合物包含48％以上的聚合度15以上的多聚磷酸，优选包含50％以上的聚合度15以上的多聚磷酸。

另外，在本发明的另一个实施方式中，多聚磷酸混合物包含31％以上的聚合度20以上的多聚磷酸，优选包含32％以上的聚合度20以上的多聚磷酸。

另外，在本发明的另一个实施方式中，多聚磷酸混合物包含4％以上的聚合度36以上的多聚磷酸，优选包含5％以上的聚合度36以上的多聚磷酸。

另外，在本发明的另一个实施方式中，多聚磷酸混合物包含2％以上的聚合度43以上的多聚磷酸，另外，在本发明的另一个实施方式中，多聚磷酸混合物包含2％以上的聚合度50以上的多聚磷酸。

本发明中的多聚磷酸的聚合度可以通过后述的实施例中记载的方法进行测定。另外，包含一定量以上的上述那样的高聚合度多聚磷酸的多聚磷酸混合物示例在后述的实施例中(参照实施例1、4等)。

＜2.2型多聚磷酸盐激酶(PPK2)＞

在本发明的一个实施方式中，提供一种物质的制造方法，其中，2型多聚磷酸盐激酶为选自以下的至少一种：来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的2型多聚磷酸盐激酶(以下，也称为“PNDK”)、来自Synechococcus sp.PCC6312株的2型多聚磷酸盐激酶(以下，也称为“Sy PPK2”)、来自有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)的2型多聚磷酸盐激酶(以下，也称为“CE PPK2”)、来自耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)的2型多聚磷酸盐激酶(以下，也称为“KR PPK2”)、来自Pannonibacter indicus的2型多聚磷酸盐激酶(以下，也称为“PI PPK2”)、来自抗辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)K1株的2型多聚磷酸盐激酶(以下，也称为“DR PPK2”)、来自Gulbenkiania indica的2型多聚磷酸盐激酶(以下，也称为“GI PPK2”)、来自变金黄节杆菌(Arthrobactor aurescens)TC1的2型多聚磷酸盐激酶(以下，也称为“AA PPK2”)、来自脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)ATCC25259株的2型多聚磷酸盐激酶(以下，也称为“TD PPK2”)、以及来自荧光假单胞菌的2型多聚磷酸盐激酶(以下，也称为“PF PPK2”)。

多聚磷酸盐激酶(以下，有时也称为“PPK”)可分类为进行可逆反应的2种酶(1型多聚磷酸盐激酶(以下，有时也称为“PPK1”)及2型多聚磷酸盐激酶(以下，有时也称为“PPK2”))。已知，PPK1在将ATP分解为ADP和多聚磷酸(以下，有时也称为“PolyP”)的反应中是优势的，PPK2在将ADP与PolyP结合而生成ATP的反应中是优势的。

从催化剂反应的观点考虑，PPK2可进一步分为3类。类别I的PPK2催化将ADP与PolyP结合而生成ATP的反应，可以示例出PNDK等。另外，类别II的PPK2催化将单磷酸腺苷(以下，有时也称为“AMP”)与PolyP结合而生成ATP的反应，可以示例出多聚磷酸依赖性AMP转移酶(PAP)等。此外，类别III的PPK2是具有催化上述类别I及类别II这2种反应的具有双功能的酶。可以示例出来自Meiothermus ruber的PPK2等。

本申请发明人等为了探索新型PPK2而进行了深入研究，结果是成功地鉴定了具有将ADP与PolyP结合而转化为ATP的活性的、分类为类别I或类别III的8种新型PPK2。因此，除了目前已知的PPK2及DR PPK2以外，还可以适当选择上述8种PPK2催化ATP再生反应。

需要说明的是，在本发明的一个实施方式中，作为2型多聚磷酸盐激酶，当然可以选择目前已知的PPK2。

以下，对上述的PPK2(即，PNDK、DR PPK2及8种新型PPK2)进行详细说明。

PNDK是来自铜绿假单胞菌的2型多聚磷酸盐激酶，由全长357氨基酸残基构成(序列号1)。

Sy PPK2是来自Synechococcus sp.PCC6312株的2型多聚磷酸盐激酶，由全长296氨基酸残基构成(序列号2)。

CE PPK2是来自有效棒杆菌的2型多聚磷酸盐激酶，由全长351氨基酸残基构成(序列号3)。

KR PPK2是来自耐辐射动球菌的2型多聚磷酸盐激酶，由全长296氨基酸残基构成(序列号4)。

PI PPK2是来自Pannonibacter indicus的2型多聚磷酸盐激酶，由全长367氨基酸残基构成(序列号5)。

DR PPK2是来自抗辐射奇异球菌K1株的2型多聚磷酸盐激酶，由全长266氨基酸残基构成(序列号6)。

GI PPK2是来自Gulbenkiania indica的2型多聚磷酸盐激酶，由全长350氨基酸残基构成(序列号7)。

AA PPK2是来自变金黄节杆菌TC1的2型多聚磷酸盐激酶，由全长314氨基酸残基构成(序列号8)。

TD PPK2是来自脱氮硫杆菌ATCC25259株的2型多聚磷酸盐激酶，由全长269氨基酸残基构成(序列号9)。

PF PPK2是来自荧光假单胞菌的2型多聚磷酸盐激酶，由全长362氨基酸残基构成(序列号10)。

在上述10种PPK2中，为了在大肠杆菌中表达而进行了密码子最优化的碱基序列如下所述：PNDK(序列号11)、Sy PPK2(序列号12)、CE PPK2(序列号13)、KR PPK2(序列号14)、PI PPK2(序列号15)、DR PPK2(序列号16)、GI PPK2(序列号17)、AA PPK2(序列号18)、TDPPK2(序列号19)、以及PF PPK2(序列号20)。

由于PNDK具有37℃的最佳温度(Motomura et al.,Applied and EnvironmentalMicrobiology,volume 80,number 8,2602-2608,2014)，因此，在使用PNDK时，可以在较低的温度(即，温和的条件下)下进行反应。因此，从该观点考虑，作为本发明的一个实施方式中的PPK2，优选为PNDK。

另外，如上所述，PNDK是来自铜绿假单胞菌的PPK2。因此，只要是来自分类为假单胞菌(Pseudomonas)属的微生物种的PPK2，就可以具有与上述的PNDK相同的优点。因此，作为本发明的一个实施方式的PPK2，优选为来自分类为假单胞菌属的微生物种的PPK2。

作为分类为假单胞菌属的微生物种，除了上述的铜绿假单胞菌及荧光假单胞菌以外，还可以列举例如以下的物种：草酸假单胞菌(Pseudomonas oxalaticus)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stuzeri)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chloraphis)、核黄素假单胞菌(Pseudomonas riboflavina)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、Pseudomonas sp.K-9、微小假单胞菌(Pseudomonasdiminuta)、泡囊假单胞菌(Pseudomonas vesicularis)、香石竹假单胞菌(Pseudomonascaryophylli)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacian)、抗微生物假单胞菌(Pseudomonasantimicrobica)、苗床假单胞菌(Pseudomonas plantarii)、海科假单胞菌(Pseudomonasmarina)、睾酮假单胞菌(Pseudomonas testosterone)、柳叶刀形假单胞菌(Pseudomonaslanceolate)、食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovorans)、红白假单胞菌(Pseudomonasrubrisubalbicans)、黄假单胞菌(Pseudomonas flava)、帕氏假单胞菌(Pseudomonaspalleronii)、类黄假单胞菌(Pseudomonas pseudoflava)、螺纹假单胞菌(Pseudomonastaeniospiralis)、航海假单胞菌(Pseudomonas nautica)、懒惰假单胞菌(Pseudomonasiners)、嗜中温假单胞菌(Pseudomonas mesophilica)、假单胞菌(Pseudomonas radiora)、玫瑰色假单胞菌(Pseudomonas rhodos)、多氏假单胞菌(Pseudomonas doudoroffii)、嗜糖污泥单胞(Pelomonas saccharophila)、嗜松香烷假单胞菌(Pseudomonasabietaniphila)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、嗜碱假单胞菌(Pseudomonasalcaliphila)、耳假单胞菌(Pseudomonas auricularis)、产氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans)、巴利阿里岛假单胞菌(Pseudomonas balearica)、绿针假单胞菌产金色亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciens)、绿针假单胞菌绿针亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.chlororaphis)、香茅醇假单胞菌(Pseudomonascitronellolis)、乳脂色假单胞菌(Pseudomonas cremoricolorata)、变黄假单胞菌(Pseudomonas flavescens)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)、盖氏假单胞菌(Pseudomonas gessardii)、印度假单胞菌(Pseudomonas indica)、日本假单胞菌(Pseudomonas japonica)、Pseudomonas jianii、晋州假单胞菌(Pseudomonas jinjuensis)、浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)、孟氏假单胞菌(Pseudomonas mandelii)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、米氏假单胞菌(Pseudomonas migulae)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)、硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)、硝基还原假单胞菌耐热亚种(Pseudomonas nitroreducens subsp.thermotolerans)、嗜油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)、栖麦假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、副黄假单胞菌(Pseudomonas parafulva)、Pseudomonas pavonaceae、穿孔素假单胞菌(Pseudomonaspertucinogena)、香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、食爬虫假单胞菌(Pseudomonas reptilivora)、食树脂假单胞菌(Pseudomonas resinovorans)、Pseudomonas sp.、秸秆色假单胞菌(Pseudomonas straminea)、燕麦假单胞菌(Pseudomonas striafaciens)、产蓝假单胞菌(Pseudomonas syncyanea)、成黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)、托拉斯假单胞菌(Pseudomonas tolaasii)、丰田假单胞菌(Pseudomonas toyotomiensis)、皮氏假单胞菌(Pseudomonas pickettii)、刺状假单胞菌(Pseudomonas echinoides)、少动假单胞菌(Pseudomonas paucimobilis)、嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、食丁酸假单胞菌(Pseudomonas butanovora)。

在本发明的一个实施方式中，PPK2可以以活细胞的状态直接使用具有PPK2活性的生物的细胞，也可以以虽然死亡但未损伤的上述细胞的形式使用，还可以以从上述细胞分离、纯化出的蛋白质的形式使用。这里，具有PPK2活性的蛋白质的纯化程度没有特别限定，可以是粗纯化。可以是具有PPK2活性的细胞的冷冻干燥菌体、丙酮干燥菌体、或者他们的粉碎物，还可以将多肽自身或菌体直接固定。

优选不使用具有PPK2活性的活细胞。更优选不使用具有PPK2活性的活细胞及未损伤的死亡细胞。

在本发明的一个实施方式中，上述10种PPK2可以是具有PPK2活性的蛋白质，所述蛋白质由在(a)序列号1～10中记载的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或添加了1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成。

上述(a)的蛋白质是具有序列号1～10所示的氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的突变体、衍生物、变体、等位基因、同源物、直向同源物、部分肽、或与其它蛋白质/肽的融合蛋白等，只要编码具有PPK2活性的蛋白质即可，其具体序列没有限定。这里，任选缺失、取代或添加的氨基酸的数量只要不失去上述功能即可，没有限定，可以是能够通过部位特异性诱变法等公知的导入法进行缺失、取代或添加的程度的数量，优选为5氨基酸以内，更优选为3氨基酸以内(例如，3、2或1氨基酸)。另外，在说明书中，“突变”主要是指通过部位特异性诱变法等人工导入的突变，但也可以是天然存在的相同的突变。

取代的氨基酸残基优选被保存了氨基酸支链性质的其它氨基酸取代。例如，作为氨基酸支链的性质，可以列举：疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族支链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羟基支链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子支链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸及酰胺支链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱基支链的氨基酸(R、K、H)、具有含芳香族支链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号内均为氨基酸的单字母表示)。具有通过对某氨基酸序列实施1个或多个氨基酸残基的缺失、添加和/或其它氨基酸的取代而进行修饰而得到的氨基酸序列的多肽保持其生物学活性。另外，突变后的氨基酸残基更优选突变为尽可能具有共同性质的氨基酸残基。

在本说明书中，“在功能上同等”是指，对象蛋白质具有与目标蛋白质同等(相同和/或类似)的生物学功能、生化学功能。生物学性质可以包括表达的部位的特异性、表达量等。导入了突变的蛋白质是否具有希望的功能，可以通过以下方式判断：获得导入编码该蛋白质的基因并使其表达的转化体，对于该转化体是否能够由ADP及PolyP生成ATP进行调查。

在本发明的一个实施方式中，上述10种PPK2可以是具有PPK2活性的蛋白质，所述蛋白质由与(b)序列号1～10中记载的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列构成。

上述(b)的蛋白质是指与序列号1～10所示的具有氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的突变体、衍生物、变体、等位基因、同源物、直向同源物、部分肽、或与其它蛋白质/肽的融合蛋白等，只要编码具有PPK2活性的蛋白质即可，其具体序列没有限定。

氨基酸序列的同源性是指，在氨基酸序列整体(或表达功能所需要的区域)中至少具有80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上(例如，95％、96％、97％、98％、99％以上)的序列同一性。氨基酸序列的同源性可以利用BLASTN(核酸水平)、BLASTX(氨基酸水平)的程序(Altschul et al.J.Mol.Biol.,215:403-410,1990)来确定。该程序基于Karlin及Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264-2268,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877,1993)。在利用BLASTN分析碱基序列时，参数设为例如score＝100、wordlength＝12。另外，在利用BLASTX分析氨基酸序列的情况下，参数设为例如score＝50、wordlength＝3。另外，在使用Gapped BLAST程序分析氨基酸序列的情况下，可以如Altschul等(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)记载的那样进行。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方式是公知的。为了以最佳的状态对比较对象的碱基序列或氨基酸序列进行比对，可以允许添加或缺失(例如，间隙等)。

在本说明书中，“同源性”是指性质类似的氨基酸残基数的比例(homology、positive等)，更优选为相同氨基酸残基数的比例、即同一性(identity)。需要说明的是，对于氨基酸的性质，如上所述。

在本发明的一个实施方式中，上述10种PPK2可以是由(c)序列号11～20中记载的碱基序列构成的基因所编码的蛋白质。

对于上述(c)的蛋白质，序列号11～20分别表示编码由序列号1～10所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因的碱基序列(Open Reading Frame：ORF)。

另外，在本发明的一个实施方式中，上述10种PPK2可以是在由(c)序列号11～20中记载的碱基序列构成的基因所编码的蛋白质中，其碱基序列为了提高宿主细胞内的表达等而进行了适当修饰的PPK2。为了提高PPK2在宿主细胞内的表达，可以是N末端侧被切断，或者在除此以外的任意部位被切断。另外，还可以为了相同的目的而对密码子进行了最优化。

作为碱基序列的修饰的一例，可以举出如后述的实施例3所示将野生型PNDK的N末端侧81氨基酸切断、并将第82位的丙氨酸取代为作为起始密码子的甲硫氨酸的修饰等。另外，可以举出如后述的实施例2所示从天然的PF PPK2中除去氨基酸N末端侧1～85并导入P86M突变的修饰、除去N末端侧1～86并导入G87M突变的修饰等。

作为得到上述基因/蛋白质的方法，可以使用通常进行的多核苷酸修饰方法。即，通过对具有蛋白质的遗传信息的多核苷酸的特定碱基进行取代、缺失、***和/或添加，可以制备具有希望的重组蛋白质的遗传信息的多核苷酸。作为修饰多核苷酸的碱基的具体方法，可以列举例如：使用市售的试剂盒(KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit(东洋纺)、Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit(Clontech)、QuickChange SiteDirected Mutagenesis Kit(Stratagene)等)、或者利用聚合酶链式反应法(polymerasechain reaction：PCR)。这些方法是本领域技术人员公知的。

另外，上述基因可以仅由编码上述蛋白质的多核苷酸构成，也可以添加有其它的碱基序列。作为添加的碱基序列，没有特别限定，可以列举编码标记(例如，组氨酸标签、Myc标签或FLAG标签等)、融合蛋白(例如，链霉亲和素、细胞色素、GST、GFP或MBP等)、启动子序列、以及信号序列(例如，内质网转移信号序列(小胞体移行シグナル配列)及分泌序列等)的碱基序列等。添加这些碱基序列的部位没有特别限定，例如，可以是被翻译的蛋白质的N末端，也可以是C末端。

＜3.PPK2基因＞

在本发明的一个实施方式中，提供一种编码上述蛋白质的PPK2基因。

PPK2基因可以是由天然的序列构成的核苷酸，也可以是由经过人工修饰的序列构成的核苷酸，优选为由在使其表达的宿主(例如，大肠杆菌)中进行了密码子最优化的序列构成的核苷酸。

＜4.载体＞

在本发明的一个实施方式中，提供包含＜3.PPK2基因＞项中记载的基因的载体。作为本载体，为了制备转化体，在宿主细胞内不仅包含用于表达上述基因的表达载体，还包含用于生产重组蛋白的载体。

作为成为上述载体的母体的基材载体，可以使用通常使用的各种载体。可以用于例如质粒、噬菌体或粘粒等，可以根据导入的细胞或导入方法而适当选择。即，载体的具体种类没有特别限定，可以适当选择能够在宿主细胞中表达的载体。根据宿主细胞的种类，为了可靠地表达上述基因，可以选择适当的启动子序列，使用将其和上述基因导入各种质粒等而成的质粒作为表达载体。所述表达载体可以利用例如噬菌体载体、质粒载体、病毒载体、逆转录病毒载体、染色体载体、附加体载体及来自病毒的载体(例如，细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体要素及病毒(例如，杆状病毒、乳多空病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假性狂犬病毒、疱疹病毒、慢病毒及逆转录病毒))以及来自于它们的组合的载体(例如，粘粒及噬菌体)。

优选在细菌中的使用的载体中可以包含例如：pQE30、pQE60、pQE70、pQE80及pQE9(可以由Qiagen获得)；pTipQC1(可以由Qiagen或Hokkaido System Science获得)、pTipRT2(由Hokkaido System Science获得)；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A及pNH46A(由Stratagene获得)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540及pRIT5(由Addgene获得)；pRSF(由MERCK等获得)；以及pAC(由Nippon Gene获得)。特别是在大肠杆菌的情况下，例如，可以修饰pUCN18(pUC18可以由Takara Bio公司获得)来制造)，可以列举：pSTV28(可以由Takara Bio公司获得)、pUCNT(国际公开第94/03613号公报)等。

另外，上述基因的***物优选可操作地连接于适当的启动子。作为其它适当的启动子，可以利用本领域技术人员已知的启动子，没有特别限定，可以列举例如：lacUV5启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lpp启动子、tufB启动子、recA启动子、pL启动子、lacI启动子、lacZ启动子、T3启动子、T5启动子、T7启动子、gap启动子、OmpA启动子、SV40初期启动子及后期启动子、以及逆转录病毒LTR的启动子。

上述载体优选进一步包含用于转录起始、转录终止的部位、以及在转录区域中用于翻译的核糖体结合部位。由载体构建物表达的成熟转录物的编码部分在要翻译的多肽的起始包含转录起始AUG，而且在终止的适当位置包含终止密码子。

作为导入载体的宿主，没有特别限定，可以优选使用各种细胞。作为适当的宿主的代表例，可以列举：细菌、酵母、丝状菌、植物细胞、动物细胞等，特别优选为大肠杆菌。用于上述宿主细胞的适当的培养培养基及条件可以利用本领域公知的培养基及条件。

将上述载体导入宿主细胞的方法、即转化方法没有特别限定，可以优选使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、阳离子脂质体介导的转染、电穿孔、转导或感染等现有公知的方法。这样的方法记载于Davis等的Basic Methods InMolecular Biology(1986)的大量的标准研究室操作手册。

＜5.转化体＞

在本发明的一个实施方式中，提供包含＜3.基因＞项中记载的基因或＜4.载体＞项中记载的重组载体的转化体。这里，“包含基因或载体”是指通过公知的基因工学方法(基因操作技术)可表达地导入对象细胞(宿主细胞)内。另外，上述“转化体”不仅包括细胞、组织、器官，还包括生物个体。

作为本转化体的制备方法(生产方法)，可以举出对上述的载体进行转化的方法。另外，成为转化对象的生物也没有特别限定，可以举出以上述宿主细胞示例出的各种生物。

作为在本发明的一个实施方式中使用的宿主细胞，只要是能够表达导入的基因或载体中包含的基因所编码的蛋白质的细胞即可，没有特别限定。作为可以用作宿主细胞的微生物，可以列举：埃希杆菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、沙雷菌(Serratia)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链球菌(Streptococcus)属、乳酸杆菌(Lactobacillus)属等细菌、红球菌(Rhodococcus)属、链霉菌(Streptomyces)属等放线菌、酵母菌(Saccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、子囊菌酵母(Yarrowia)属、毛孢子菌(Trichosporon)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、毕赤酵母(Pichia)属、念珠菌(Candida)属等酵母、链孢霉菌(Neurospora)属、曲霉菌(Aspergillus)属、头孢霉(Cephalosporium)属、及木霉(Trichoderma)属等霉菌。另外，除微生物以外，还可以利用植物细胞、动物细胞等作为宿主细胞。其中，从导入及表达效率的观点考虑，优选为细菌，特别优选为大肠杆菌。

〔利用了ATP的物质制造〕

在本发明的一个实施方式中，利用了ATP的物质制造只要是消耗来自ATP的能量来制造物质的方法即可，没有特别限定。作为利用了ATP的物质制造，可以列举例如：氧化型谷胱甘肽的制造、还原型谷胱甘肽的制造、S-腺苷甲硫氨酸的制造、糖磷酸的制造、乙酰辅酶A的制造、丙酰辅酶A的制造、氧化荧光素的制造、鸟苷3’-二磷酸5’-三磷酸的制造、5-磷酸核糖-1-焦磷酸的制造、酰基辅酶A的制造、生物素辅酶A的制造、氨酰-tRNA的制造、环状RNA的制造、L-天冬酰胺的制造、L-天冬氨酸的制造、糖核苷酸的制造、3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸的制造等。关于利用ATP生成物质的酶反应，本领域技术人员也可以通过检索例如KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)而容易地理解除上述以外的反应。

以下，作为利用了ATP的物质制造的代表例，对＜1.氧化型谷胱甘肽的制造方法＞及＜2.还原型谷胱甘肽的制造方法＞进行说明。

＜1.氧化型谷胱甘肽的制造方法＞

在本发明的一个实施方式中，提供包括以下(1)及(2)的工序的物质制造方法。

(1)使L-谷氨酸与L-胱氨酸反应而制造氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的工序、以及

(2)使上述(1)中得到的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸反应而制造氧化型谷胱甘肽的工序。

本发明的一个实施方式中的氧化型谷胱甘肽的制造方法优选为国际公开第2016/002884号公报中记载的方法。

在本发明的一个实施方式中，上述工序(1)例如以下式表示。

化学式3

在上述工序(1)中，通过在GSHI和ATP的存在下使L-胱氨酸与L-谷氨酸反应，生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。

上述工序(1)中使用的GSHI只要具有上述的活性即可，没有特别限定。GSHI的来源没有特别限定，可以使用来自微生物、动物、植物等的GSHI。优选为来自微生物的GSHI，特别优选为来自大肠埃希氏菌(Escherichia coli)等肠内细菌、棒状细菌、嗜热菌/耐热菌、嗜冷菌/耐冷菌、嗜酸菌/耐酸菌、嗜碱菌/耐碱菌、甲基营养菌、耐卤菌、硫细菌、耐辐射菌等细菌、酵母等真核微生物等的GSHI。

另外，在本发明的一个实施方式中，上述工序(2)可以通过例如下式表示。

化学式4

另一方面，在上述工序(2)中，通过在GSHII和ATP的存在下使氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸反应，生成氧化型谷胱甘肽。

上述工序(2)中使用的GSHII只要具有上述的活性即可，没有特别限定。GSHII的来源没有特别限定，可以使用来自微生物、动物、植物等的GSHII。优选为来自微生物的GSHII，特别优选为来自大肠埃希氏菌(Escherichia coli)等肠内细菌、棒状细菌、嗜热菌/耐热菌、嗜冷菌/耐冷菌、嗜酸菌/耐酸菌、嗜碱菌/耐碱菌、甲基营养菌、耐卤菌、硫细菌、耐辐射菌等细菌、酵母等真核微生物等的GSHII。

在本发明的一个实施方式中，可以使用GSHF来代替上述GSHI及GSHII中的任一者或两者。GSHF是兼具GSHI及GSHII这两种酶所具有的功能的双功能谷胱甘肽合成酶，可以用作GSHI及GSHII的替代，没有特别限定。GSHF的来源没有特别限定，可以使用来自微生物、动物、植物等的GSHF。优选为来自微生物的GSHF，特别优选为来自大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)等肠内细菌、棒状细菌、嗜热菌/耐热菌、嗜冷菌/耐冷菌、嗜酸菌/耐酸菌、嗜碱菌/耐碱菌、甲基营养菌、耐卤菌、硫细菌、耐辐射菌、乳酸菌等细菌、酵母等真核微生物等的GSHF。此外，优选来自于选自以下菌中至少1种的GSHF：例如，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、猪链球菌(Streptococcus suis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、戈氏链球菌(Streptococcus gordonii)、***链球菌(Streptococcus uberis)等链球菌(Streptococcus)属细菌；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)等乳杆菌(Lactobacillus)属细菌；嗜冷脱硫枝条菌(Desulfotalea psychrophila)等脱硫枝条菌(Desulfotalea)属细菌；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)等梭菌(Clostridium)属细菌；无害李斯特氏菌(Listeriainnocua)、单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)等李斯特氏菌(Listeria)属细菌；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、意大利肠球菌(Enterococcus italicus)等肠球菌(Enterococcus)属细菌；多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)等巴斯德氏菌(Pasteurella)属细菌；产琥珀酸曼海姆氏菌(Mannheimia succiniciprodecens)等曼海姆氏菌(Mannheimia)属细菌；以及、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)等嗜血杆菌(Haemophilus)属细菌；产琥珀酸放线杆状菌(Actinobacillus succinogenes)、胸膜肺炎放线杆状菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)等放线杆状菌(Actinobacillus)属细菌；蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)等芽孢杆菌(Bacillus)属细菌。

在本发明的一个实施方式中，上述10种PPK2与选自γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHI)、谷胱甘肽合成酶(GSHII)及双功能谷胱甘肽合成酶(GSHF)中的至少一种相互关联而发挥作用。

上述10种PPK2与选自GSHI、GSHII及GSHF中的至少一种的组合只要能够以高转化率制造氧化型谷胱甘肽即可，没有特别限定，可以使用任意组合。另外，分别与GSHI、GSHII及GSHF组合的PPK2可以是不同种类，也可以是相同种类。

在本发明的一个实施方式中，PPK2、GSHI、GSHII及GSHF可以以活细胞的状态直接使用各种具有酶活性的生物的细胞，也可以以虽然死亡但未受损伤的上述细胞的形态使用，也可以以上述各种酶存在于细胞外的形态、具体而言以上述生物的细胞的粉碎物的形态使用，还可以以从上述细胞中分离、纯化出的蛋白质的形态使用。优选不使用具有PPK2活性的活细胞。更优选不使用具有PPK2活性的活细胞及未损伤的死亡细胞。

在本发明的一个实施方式中，从对氧化型谷胱甘肽的转化率的观点考虑，多聚磷酸混合物优选在工序(1)及(2)这两个工序中使用(即，添加)，也可以仅在工序(1)及(2)中的一个工序中使用。

＜2.还原型谷胱甘肽的制造方法＞

在本发明的一个实施方式中，提供包括以下的(1)及(2)的工序的物质制造方法。

(1)使L-谷氨酸与L-半胱氨酸反应，制造γ-谷氨酰半胱氨酸的工序、以及

(2)使上述(1)中得到的γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸反应，制造还原型谷胱甘肽的工序。

本发明的一个实施方式的还原型谷胱甘肽的制造方法优选为WO2016/017631中记载的方法。WO2016/017631中记载了为了防止还原型谷胱甘肽的氧化而在氮气氛围中进行反应，但还原型谷胱甘肽的制造并不限定于氮气氛围中的反应。

在本发明的一个实施方式中，上述工序(1)以例如下式表示。

化学式5

在上述工序(1)中，通过在GSHI和ATP的存在下使L-半胱氨酸与L-谷氨酸反应，生成γ-谷氨酰半胱氨酸。

上述工序(1)中使用的GSHI只要具有上述的活性即可，没有特别限定。GSHI的来源没有特别限定，可以使用来自微生物、动物、植物等的GSHI。优选为来自微生物的GSHI，特别优选为来自大肠埃希氏菌(Escherichia coli)等肠内细菌、棒状细菌等细菌、酵母等真核微生物等的GSHI。

另外，在本发明的一个实施方式中，上述工序(2)以例如下式表示。

化学式6

另一方面，在上述工序(2)中，通过在GSHII和ATP的存在下使γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸反应，生成还原型谷胱甘肽。

上述工序(2)中使用的GSHII只要具有上述的活性即可，没有特别限定。GSHII的来源没有特别限定，可以使用来自微生物、动物、植物等的GSHII。优选为来自微生物的GSHII，特别优选为来自大肠埃希氏菌(Escherichia coli)等肠内细菌、棒状细菌等细菌、酵母等真核微生物等的GSHII。

在本发明的一个实施方式中，可以使用GSHF来代替上述GSHI及GSHII中的任一者或两者。GSHF的功能、来源等与＜1.氧化型谷胱甘肽的制造方法＞中的记载相同。

在本发明的一个实施方式中，上述10种PPK2与选自γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHI)、谷胱甘肽合成酶(GSHII)及双功能谷胱甘肽合成酶(GSHF)中的至少一种相互关联而发挥作用。

上述10种PPK2与选自GSHI、GSHII及GSHF中的至少一种的组合只要能够以高转化率制造还原型谷胱甘肽即可，没有特别限定，可以使用任意组合。另外，分别与GSHI、GSHII及GSHF组合的PPK2可以是不同种类，也可以是相同种类。

在本发明的一个实施方式中，PPK2、GSHI、GSHII及GSHF可以以活细胞的状态直接使用各种具有酶活性的生物的细胞，也可以以虽然死亡但未受损伤的上述细胞的形态使用，也可以以上述各种酶存在于细胞外的形态、具体而言以上述生物的细胞的粉碎物的形态使用，还可以以从上述细胞中分离、纯化出的蛋白质的形态使用。优选不使用具有PPK2活性的活细胞。更优选不使用具有PPK2活性的活细胞及未损伤的死亡细胞。

在本发明的一个实施方式中，从对还原型谷胱甘肽的转化率的观点考虑，多聚磷酸混合物优选在工序(1)及(2)这两个工序中使用(即，添加)，也可以仅在工序(1)及(2)中的一个工序中使用。

即，本发明的一个方式包含以下的发明。

〔1〕一种物质的制造方法，其是利用ATP制造物质的方法，

该制造方法与ATP再生反应相互关联，所述ATP再生反应使2型多聚磷酸盐激酶和多聚磷酸与由ATP生成的ADP发生反应而再生ATP，其中，

该制造方法中利用的ATP包含通过与该制造方法相互关联的该ATP再生反应所再生的ATP，作为该2型多聚磷酸盐激酶的底物，使用包含48％以上的聚合度15以上的多聚磷酸的多聚磷酸混合物。

〔2〕根据〔1〕中记载的物质的制造方法，其中，所述多聚磷酸混合物包含50％以上的聚合度15以上的多聚磷酸。

〔3〕根据〔1〕或〔2〕中记载的物质的制造方法，其中，所述2型多聚磷酸盐激酶为选自以下的至少一种：

来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的2型多聚磷酸盐激酶、来自Synechococcus sp.PCC6312株的2型多聚磷酸盐激酶、来自有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)的2型多聚磷酸盐激酶、来自耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)的2型多聚磷酸盐激酶、来自Pannonibacter indicus的2型多聚磷酸盐激酶、来自抗辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)K1株的2型多聚磷酸盐激酶、来自Gulbenkiania indica的2型多聚磷酸盐激酶、来自变金黄节杆菌(Arthrobactor aurescens)TC1的2型多聚磷酸盐激酶、来自脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)ATCC25259株的2型多聚磷酸盐激酶、以及来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的2型多聚磷酸盐激酶。

〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项记载的物质的制造方法，其中，所述2型多聚磷酸盐激酶与选自γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶及双功能谷胱甘肽合成酶中的至少一种相互关联而发挥功能。

〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项记载的物质的制造方法，其中，所述物质的制造方法是氧化型谷胱甘肽的制造方法或还原型谷胱甘肽的制造方法。

〔6〕根据〔5〕中记载的物质的制造方法，所述物质的制造方法是氧化型谷胱甘肽的制造方法，该方法包括以下的(1)及(2)的工序：

(1)使L-谷氨酸与L-胱氨酸反应而制造氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的工序、以及

(2)使上述(1)中得到的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸反应而制造氧化型谷胱甘肽的工序。

此外，上述各项目中记载的内容在其它项目中也可以适当引用。另外，本发明并不限定于上述的各实施方式，可以在权利要求所示的范围进行各种变更，将不同的实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含于本发明的技术范围。以下，通过实施例对本发明进一步详细地进行说明，但本发明并不仅限定于这些实施例。

实施例

〔参考例1〕多聚磷酸盐激酶用表达载体的构建

基于国际公开第2006/080313号公报中记载的信息，通过Eurofin Genomics公司化学合成了将来自于Pseudomonas aeruginosa的聚磷酸激酶(NCBI Reference Sequence：WP＿023109529)(氨基酸序列：序列号1、碱基序列：序列号11)的N末端侧81氨基酸切断、且对将编码使第82位的丙氨酸取代为作为起始密码子的甲硫氨酸的多肽的基因进行了与大肠杆菌宿主对应的密码子最优化而成的基因序列在5’端添加了NdeI位点、在3’端添加了EcoRI位点的序列。用NdeI及EcoRI消化该基因，并***于质粒pUCN18(通过利用PCR法将pUC18(Takara Bio公司制造)的第185位的T修饰为A来破坏NdeI位点、并进一步通过将第471-472位的GC修饰为TG而新导入了NdeI位点的质粒)的lac启动子下游的NdeI识别位点与EcoRI识别位点之间，构建了重组载体pPPK。

〔参考例2〕表达多聚磷酸盐激酶的重组生物的制备

使用参考例1中构建的重组载体pPPK对E.coli HB101感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了重组生物E.coli HB101(pPPK)。另外，使用pUCN18对E.coliHB101感受态细胞(Takara Bio公司制造)进行转化，得到了重组生物E.coli HB101(pUCN18)。

〔参考例3〕重组生物中的多聚磷酸盐激酶基因的表达

将参考例2中得到的2种重组生物(E.coli HB101(pUCN18)、E.coli HB101(pPPK)接种于含有200μg/ml氨苄西林的2×YT培养基(1.6％胰蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％氯化钠、pH7.0)5ml，在37℃下振荡培养24小时。对于上述培养中得到的各培养液通过离心分离收集菌体，使其悬浮于1ml的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制造)将其破碎后，通过离心分离去除菌体残渣，得到了无细胞提取液。

使用这些无细胞提取液测定了多聚磷酸盐激酶活性。对于多聚磷酸盐激酶活性而言，在50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中添加5mM偏磷酸钠(和光纯药株式会社制造)、10mMADP二钠盐(Oriental Yeast公司制造)、70mM硫酸镁(和光纯药株式会社制造)、以及无细胞提取液，在30℃下进行5分钟的反应，通过HPLC分析对生成的ATP进行了定量。在该反应条件下，将1分钟生成1μmol的ATP的酶活性定义为1U。其结果是，对于E.coliHB101(pUCN18)，ATP生成活性为5U/mL以下。

〔参考例4〕多聚磷酸盐激酶的制备

将参考例2中得到的E.coli HB101(pPPK)接种于含有200μg/ml氨苄西林的2×YT培养基(1.6％胰蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％NaCl、pH7.0)50ml，在37℃下振荡培养24小时。用参考例3中记载的方法测定酶活性，酶活性为120U/mL。接着，通过离心分离收集菌体，使其悬浮于2.5ml的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，将进行了超声波破碎的液体作为酶液。

〔制造例1〕氧化型谷胱甘肽的制造

通过(A)由L-谷氨酸和L-胱氨酸制造氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的工序、以及(B)从氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸制造氧化型谷胱甘肽的工序这两个工序，进行了氧化型谷胱甘肽的制造(通过将国际公开第2016/002884号公报的＜实施例1＞中记载的方法进行了部分改变而得到的方法，进行了氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的制造)。

＜工序(A)＞

将0.3629g的L-谷氨酸钠一水合物(2.15mmol)、0.3113g的L-胱氨酸二盐酸盐(0.99mmol)、0.7079g的硫酸镁七水合物、0.0583g的ATP(0.11mmol)、0.8g的偏磷酸钠、12g的蒸馏水混合，用0.8g的15重量％氢氧化钠水溶液将pH调整至7.5。向该溶液添加2g的来自大肠杆菌K12株的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHI)酶液、并添加多聚磷酸盐激酶酶液，使得反应液中的总PPK2活性为20U/mL，开始进行反应。反应温度为30℃，进行了6～8小时的反应。

需要说明的是，基于国际公开第2016/002884号公报的实验1及实验4分别进行了上述GSHI酶液的制备。

另外，通过与参考例1～4相同的方法制备了上述多聚磷酸盐激酶酶液。

＜工序(B)＞

接着，向上述反应液添加0.19g的甘氨酸(2.53mmol)、2g的谷胱甘肽合成酶液、给定量的多聚磷酸盐激酶酶液、0.21g的硫酸镁七水合物、0.04g的ATP、0.92g的偏磷酸钠水溶液(36.2wt％)，开始进行反应。此时，用1.1g的15重量％氢氧化钠水溶液将pH调整至7.5。反应温度为30℃，进行了8小时的反应。然后，使反应停止，对反应液进行了分析。

需要说明的是，上述GSHII使用了日本特愿2016-214073中记载的修饰型谷胱甘肽合成酶(V260A)。

另外，通过与参考例1～4相同的方法制备了上述多聚磷酸盐激酶酶液。

〔实施例1〕使用了多聚磷酸混合物的氧化型谷胱甘肽的制造

制备了多种在ATP再生体系中成为2型多聚磷酸盐激酶的底物的多聚磷酸混合物，进行了氧化型谷胱甘肽的制造。基于该技术领域中通常的方法进行多聚磷酸的合成，并将其混合，由此进行了多聚磷酸混合物的制备。另外，基于制造例1的方法进行了氧化型谷胱甘肽的制造。

其结果是发现了，在使用了特定的多聚磷酸混合物的情况下，氧化型谷胱甘肽的转化率增高。

然后，对于转化为氧化型谷胱甘肽的转化效率增高的多聚磷酸混合物进行了多聚磷酸的聚合度的分析。分析条件如下所示。

＜分析条件＞

·离子色谱仪

·型号：Thermo Fisher Scientific制造的ICS-2100

·色谱柱：IonPac AG11，AS11(4mm×250mm)

·洗脱液：KOH梯度

·洗脱液流量：1.0mL/分

·进样量：25μL

·柱温：35℃

·检测器：电导率检测器

通过将全部峰的面积之和设为100％，计算出各峰的面积的比例，进行各聚合度的含量的计算。

其结果是，多聚磷酸混合物内的高聚合度的多聚磷酸的分布如下所述(参照图1)。

·聚合度15以上的多聚磷酸为48％以上。

·聚合度20以上的多聚磷酸为31％以上。

·聚合度36以上的多聚磷酸为4％以上。

·聚合度43以上的多聚磷酸为2％以上。

·聚合度50以上的多聚磷酸为2％以上。

因此可知，在使用了这样的包含一定量以上的高聚合度多聚磷酸的多聚磷酸混合物作为基于PPK2的ATP再生体系的底物的情况下，能够以高转化率制造氧化型谷胱甘肽。

〔实施例2〕新型多聚磷酸盐激酶的酶活性

数据库检索的结果是，对于推测具有多聚磷酸盐激酶活性的以下8种多聚磷酸盐激酶及已知的DR PPK2，通过与参考例1～4相同的方法制备多聚磷酸盐激酶酶液，并通过与参考例3相同的方法测定了酶活性。

·来自Synechococcus sp.PCC6312的PPK2(Sy PPK2)：序列号2

·来自有效棒杆菌的PPK2(CE PPK2)：序列号3

·来自耐辐射动球菌的PPK2(KR PPK2)：序列号4

·来自Pannonibacter indicus的PPK2(PI PPK2)：序列号5

·来自抗辐射奇异球菌K1株的PPK2(DR PPK2)：序列号6

·来自Gulbenkiania indica的PPK2(GI PPK2)：序列号7

·来自变金黄节杆菌TC1的PPK2(AA PPK2)：序列号8

·来自脱氮硫杆菌ATCC25259株的PPK2(TD PPK2)：序列号9

·来自荧光假单胞菌的PPK2(PF PPK2)(使用从天然的PF PPK2(序列号10)中除去氨基酸N末端侧1～85并导入了P86M突变而得到的PPK2、以及除去N末端侧1～86并导入了G87M突变而得到的PPK2)

其结果是可知，上述8种新型多聚磷酸盐激酶全部具有酶活性。另外，对于已知的DR PPK2，确认了具有酶活性。

PI PPK2的酶活性为138U/mL，可知比PNDK(120U/mL(参照参考例4))高。

需要说明的是，与使用刚刚制备后的多聚磷酸混合物溶液进行与上述相同的实验的情况(将其设为100％)相比，使用制备后于室温下放置了13天的多聚磷酸混合物溶液进行与上述相同的实验的情况显示出73％的PI PPK2酶活性。

〔实施例3〕使用了各种多聚磷酸混合物的氧化型谷胱甘肽的制造

基于制造例1的方法进行了氧化型谷胱甘肽的制造。

多聚磷酸盐激酶使用了以下3种多聚磷酸盐激酶(工序(A)及工序(B)之间使用相同种类的酶)。

·来自铜绿假单胞菌的PPK2(PNDK)(使用将野生型PNDK(序列号1)的N末端侧81氨基酸切断、并将第82位的丙氨酸取代成作为起始密码子的甲硫氨酸而得到的蛋白质)

·来自Pannonibacter indicus的PPK2(PI PPK2)

·来自Synechococcus sp.PCC6312株的PPK2(Sy PPK2)

另外，在以下的表1所示的条件下，分别对PNDK、PI PPK2及Sy PPK2进行了实验。基于各培养液的酶活性，通过添加一定量的培养液(菌体)来调整反应液中的酶活性。

[表1]

工序(B)中的多聚磷酸盐激酶酶液的添加量为反应液中的PPK2活性达到表2中记载的值的量。

[表2]

将基于以上所述进行了氧化型谷胱甘肽的制造的结果示于以下的表3。

[表3]

实验名称	氧化型谷胱甘肽转化率(％)
		实验A	99
实验B	63
		实验C	99.5
实验D	99.6
		实验E	99.8
实验F	99.9
		实验G	57
实验H	44
		实验I	71
实验J	22

根据上述结果可知，在使用了任意多聚磷酸盐激酶的情况下，使用保存期间长的偏磷酸水溶液时，对氧化型谷胱甘肽的转化率均降低(PNDK：实验A与实验B的比较，PIPPK2：实验C～F与实验G～H的比较，Sy PPK2：实验I与实验J的比较)。

即，与使用了保存期间短的偏磷酸水溶液的情况相比，使用了保存期间长的偏磷酸水溶液的情况下，得到了不仅反应液中的PPK2酶活性高、而且对氧化型谷胱甘肽的转化率低的结果(PNDK：实验A与实验B的比较，PI PPK2：实验F与实验G的比较，Sy PPK2：实验I与实验J的比较)。可以推测这是由于，在实验B、G、J中，虽然反应体系中的PPK2活性充足，但成为多聚磷酸盐激酶的底物的偏磷酸在保存期间被分解而不足。

〔实施例4〕多聚磷酸混合物的组成(聚合度)的变动(1)

根据实施例3的结果，为了对多聚磷酸混合物的组成随保存期间变化的情况进行研究，进行了以下的实验。

具体而言，在偏磷酸钠中添加水，制备了50w/v％的偏磷酸钠作为样品1。在制备样品1起13天后，另行制备了50w/v％的偏磷酸钠(样品2)。在制备样品2的当天，对于样品1及样品2中含有的偏磷酸的聚合度进行了分析。分析条件如下所述。

＜分析条件＞

·离子色谱仪

·型号：Thermo Fisher Scientific制造的ICS-2100

·色谱柱：IonPac AG11，AS11(4mm×250mm)

·洗脱液：KOH梯度

·洗脱液流量：1.0mL/分

·进样量：25μL

·柱温：35℃

·检测器：电导率检测器

将结果示于图2。根据图2可知，与制备后立即进行了分析的样品2相比，制备后放置了13天的样品1的高聚合度偏磷酸减少。该结果表明，将偏磷酸的水溶液在常温下预先放置时，高聚合度的偏磷酸被分解。

另外，将本结果及实施例3的结果组合可知，为了利用多聚磷酸盐激酶高效地进行从ADP至ATP的转化反应，不仅需要使多聚磷酸盐激酶的酶活性足够，而且需要使成为其底物的偏磷酸处于适当的状态(即，存在高聚合度的偏磷酸)。

〔实施例5〕多聚磷酸混合物的组成(聚合度)的变动(2)

为了对氧化型谷胱甘肽的制造过程中多聚磷酸混合物的组成(聚合度)变动进行研究，进行了以下的实验。

具体而言，进行与实施例3的实验G相同的实验，将工序(a)及工序(b)的各工序刚刚结束后的反应液回收，对包含的多聚磷酸的组成(聚合度)进行了研究。基于实施例4中记载的方法进行了组成(聚合度)的分析。

另外，作为PPK2消耗前的(使用前的)多聚磷酸混合物，使用了实施例4的样品2(刚刚制备后的多聚磷酸混合物)。

将结果示于图3。在图3中，(a)示出了刚刚制备后的多聚磷酸混合物的组成(聚合度)，(b)示出了工序(A)结束后的多聚磷酸混合物的组成(聚合度)，(c)示出了工序(B)结束后的多聚磷酸混合物的组成(聚合度)。

该结果表明，基于PPK2的ATP再生反应优先使用高聚合度的多聚磷酸。

工业实用性

本发明能够廉价且高转化率地进行利用了ATP的物质制造，因此可以用于氧化型谷胱甘肽的制造、还原型谷胱甘肽的制造等领域。

序列表

<110> 株式会社钟化（KANEKA CORPORATION）

<120> 利用了ATP的物质的制造方法

<130> B170312

<150> JP 2017-091451

<151> 2017-05-01

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 357

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 1

Met Ser Glu Glu Pro Thr Val Ser Pro Pro Ser Pro Glu Gln Pro Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Lys Pro Ala Arg Pro Ala Ala Arg Arg Ala Pro Arg

20 25 30

Lys Pro Ala Thr Arg Arg Pro Arg Val Ala Ser Pro Ala Gln Lys Ala

35 40 45

Arg Glu Glu Ile Gln Ala Ile Ser Gln Lys Pro Val Ala Leu Gln Val

50 55 60

Ala Ser Ala Pro His Gly Ser Ser Glu Asp Ser Thr Ser Ala Ser Leu

65 70 75 80

Pro Ala Asn Tyr Pro Tyr His Thr Arg Met Arg Arg Asn Glu Tyr Glu

85 90 95

Lys Ala Lys His Asp Leu Gln Ile Glu Leu Leu Lys Val Gln Ser Trp

100 105 110

Val Lys Glu Thr Gly Gln Arg Val Val Val Leu Phe Glu Gly Arg Asp

115 120 125

Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Met Glu His Leu Asn

130 135 140

Pro Arg Gly Ala Arg Ile Val Ala Leu Glu Lys Pro Ser Ser Gln Glu

145 150 155 160

Gln Gly Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Ile Gln His Leu Pro Thr Ala

165 170 175

Gly Glu Met Val Phe Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val

180 185 190

Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Ser Pro Leu Gln Tyr Leu Glu Phe Met

195 200 205

Arg Gln Ala Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu Thr Asn Ser Gly Ile Leu

210 215 220

Leu Phe Lys Tyr Trp Phe Ser Val Ser Arg Glu Glu Gln Leu Arg Arg

225 230 235 240

Phe Ile Ser Arg Arg Asp Asp Pro Leu Lys His Trp Lys Leu Ser Pro

245 250 255

Ile Asp Ile Lys Ser Leu Asp Lys Trp Asp Asp Tyr Thr Ala Ala Lys

260 265 270

Gln Ala Met Phe Phe His Thr Asp Thr Ala Asp Ala Pro Trp Thr Val

275 280 285

Ile Lys Ser Asp Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Asn Cys Ile Arg His

290 295 300

Phe Leu His Ser Leu Asp Tyr Pro Asp Lys Asp Arg Arg Ile Ala His

305 310 315 320

Glu Pro Asp Pro Leu Leu Val Gly Pro Ala Ser Arg Val Ile Glu Glu

325 330 335

Asp Glu Lys Val Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Gly His Ala Asn

340 345 350

Leu Asp Ile Pro Ala

355

<210> 2

<211> 296

<212> PRT

<213> Synechococcus sp.

<400> 2

Met Ala Glu Leu Asp Ile Thr Ala Ala Pro Leu Glu Ala Gln Thr Glu

1 5 10 15

Gly Pro Gly Lys Lys Lys Lys Ala Lys Asp Lys Lys Lys Ala Leu Pro

20 25 30

Glu Thr Pro Lys Pro Ser Lys Leu Asp Arg Asp Phe Tyr Asp Lys Glu

35 40 45

Leu Ala Arg Leu Gln Val Glu Leu Val Lys Met Gln Tyr Trp Val Lys

50 55 60

His Ala Gly Leu Lys Ile Val Ile Ile Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala

65 70 75 80

Gly Lys Gly Gly Met Ile Lys Arg Ile Ser Ala Pro Leu Asn Pro Arg

85 90 95

Gly Cys Arg Ile Val Ala Leu Gly Thr Pro Ser Asp Arg Glu Lys Thr

100 105 110

Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Val Glu His Leu Pro Gly Ala Gly Glu

115 120 125

Ile Val Met Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Trp

130 135 140

Val Met Gly Phe Cys Thr Glu Ala Gln Tyr Asn Glu Phe Met Asp Ser

145 150 155 160

Cys Pro Gln Phe Glu Arg Met Leu Val Lys Ser Gly Ile Ile Leu Ile

165 170 175

Lys Tyr Trp Phe Ser Val Ser Asp Asp Glu Gln Glu Arg Arg Phe Gln

180 185 190

Ala Arg Ile Leu Glu Pro Ala Lys Arg Trp Lys Ile Ser Pro Met Asp

195 200 205

Ile Glu Ser Arg Asp Arg Trp Val Asp Tyr Ser Lys Ala Lys Asp Ala

210 215 220

Met Leu Ala His Thr Asn Ile Pro Glu Ala Pro Trp Phe Thr Val Glu

225 230 235 240

Ala Asp Asp Lys Arg Arg Ala His Leu Asn Cys Ile Ser His Leu Leu

245 250 255

Ser Lys Ile Pro Tyr Glu Asp Ile Thr Pro Pro Ala Ile Asp Leu Pro

260 265 270

Pro Arg Arg Pro Ala Pro Glu Asp Tyr Val Arg Pro Pro Ile Asn Glu

275 280 285

Gln Phe Phe Val Pro Ser Ile Tyr

290 295

<210> 3

<211> 351

<212> PRT

<213> 有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)

<400> 3

Met Asn Lys Met Glu Asn Ala Pro Met Pro Thr Phe Gly Lys Glu Leu

1 5 10 15

Pro Lys Leu Asp Asn Lys Ala Tyr Lys Lys Glu Leu Lys Arg Leu Gln

20 25 30

Ala Glu Leu Val Glu Met Gln Gln Trp Val Val Glu Thr Gly Thr Arg

35 40 45

Val Val Ile Val Met Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Ser Ala

50 55 60

Ile Lys Arg Ile Thr Gln Tyr Leu Asn Pro Arg Thr Ala Arg Ile Glu

65 70 75 80

Ala Leu Pro Thr Pro Thr Ser Arg Glu Lys Gly Gln Trp Tyr Phe Gln

85 90 95

Arg Tyr Val Glu Lys Leu Pro Ala Ala Gly Glu Ile Val Ile Phe Asp

100 105 110

Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Cys

115 120 125

Thr Ser Gln Glu Tyr Arg Arg Phe Leu His Gln Ala Pro Ile Phe Glu

130 135 140

Arg Leu Leu Val Glu Asp Gly Ile His Leu Arg Lys Tyr Trp Phe Ser

145 150 155 160

Val Ser Asp Glu Glu Gln Leu Ala Arg Phe His Ser Arg Leu Ser Asp

165 170 175

Pro Leu Arg Arg Trp Lys Leu Ser Thr Ile Asp Leu His Ser Ile Thr

180 185 190

Arg Trp Glu Asp Tyr Ser Arg Ala Lys Asp Glu Met Phe Ile His Thr

195 200 205

Asp Ile Pro Ser Ala Pro Trp Tyr Thr Val Glu Ser Glu Glu Lys Lys

210 215 220

Arg Ser Arg Ile Asn Val Ile Ser His Ile Leu Ser Thr Ile Pro Tyr

225 230 235 240

Glu Lys Ile Asp Arg Pro Leu Pro Glu Ile Pro Glu Arg Pro Val Arg

245 250 255

Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Pro Pro Arg Asn Glu Phe Arg Tyr Val Pro

260 265 270

Asp Val Ala Ala Cys Leu Glu Glu His Arg Val Ala Ala Ala Arg Glu

275 280 285

Lys Ala Lys Ala Glu Ala Lys Ala Arg Glu Glu Ala Glu Arg Ala Leu

290 295 300

Ala Ala Glu Lys Val Lys Ala Ala Lys Lys Ala Lys Lys Ile Arg Lys

305 310 315 320

Ala Gln Lys Ala Lys Ala Ala Lys Lys Ala Lys Lys Ala Ala Gly Lys

325 330 335

Ala Lys Ala Val Lys Lys Thr Gly Lys Ser Gly Lys Gly Gly Lys

340 345 350

<210> 4

<211> 296

<212> PRT

<213> 耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)

<400> 4

Met Pro His Val Gln Leu Thr Pro Asp Leu Gly Met Thr Val Arg Asp

1 5 10 15

Asp Glu Asp Glu Pro Glu Leu Leu Thr Pro Asp Gly Asn Val Val Asp

20 25 30

Thr Trp Arg Glu Asp Tyr Pro Tyr Asp Glu Arg Leu Asp Arg Lys Glu

35 40 45

Tyr Asp Ala Glu Lys Arg Leu Leu Gln Ile Glu Leu Leu Lys Leu Gln

50 55 60

Arg Trp Leu Lys Ala Ser Gly Glu Arg Ile Val Val Leu Cys Glu Gly

65 70 75 80

Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Met Glu His

85 90 95

Leu Asn Pro Arg Gly Ala Arg Val Val Ala Leu Glu Lys Pro Ser Glu

100 105 110

Arg Glu Ser Thr Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Val Gln His Leu Pro

115 120 125

Ala Ala Gly Glu Phe Val Leu Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala

130 135 140

Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Ala Ser Pro Ala Glu Tyr Asp Arg

145 150 155 160

Phe Val Ala Gln Ala Pro Leu Phe Glu Lys Met Leu Val Asp Asp Gly

165 170 175

Ile His Leu Val Lys Phe Trp Phe Ser Val Thr Arg Ala Glu Gln Arg

180 185 190

Thr Arg Phe Leu Ile Arg Gln Ile Asp Pro Val Arg Gln Trp Lys Leu

195 200 205

Ser Pro Met Asp Leu Glu Ser Leu Asp Arg Trp Asp Glu Tyr Thr Ala

210 215 220

Ala Lys Glu Ala Met Phe Ala Thr Thr Asp Thr Asp Val Ala Pro Trp

225 230 235 240

Thr Val Val Lys Thr Asn Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Ala Ala Met

245 250 255

Arg His Val Leu Ala Arg Phe Asp Tyr Asp Gly Lys Asp Pro Glu Val

260 265 270

Val Gly Val Pro Asp Pro Leu Leu Val Val His Ala Arg Thr Ile Leu

275 280 285

Glu Ala Asp Arg Arg Pro Ala Ser

290 295

<210> 5

<211> 367

<212> PRT

<213> Pannonibacter indicus

<400> 5

Met Asp Asp Arg Thr Val Thr Arg Lys Pro Arg Gly Thr Arg Pro Ala

1 5 10 15

Pro Ala Ala Asp Ala Val Leu Pro Val Thr Ala Asp Ser Ala Glu Ala

20 25 30

Glu Ala Thr Pro Ser Gly Val Ala Glu Thr Pro Ala Glu Ala Val Thr

35 40 45

Ala Pro Gln Pro Gly Thr Glu Pro Val Ala Ala Pro Glu Ala Ala Leu

50 55 60

Glu Pro Ala Ile Ala Pro Val Ala Ala Ala Pro Arg Lys Thr Leu Ala

65 70 75 80

Glu Met Arg His Asp Pro Ala Ala Ile His Glu Leu Phe Glu Ser Gly

85 90 95

Lys Tyr Pro Tyr Ala Thr Pro Met Arg Arg Ala Pro Tyr Glu Gln Arg

100 105 110

Lys Ala Lys Leu Gln Ala Glu Leu Leu Lys Ala Gln Arg Trp Ile Lys

115 120 125

Glu Thr Gly Gln Arg Val Val Ile Leu Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala

130 135 140

Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Met Glu His Leu Asn Pro Arg

145 150 155 160

Gly Ala Thr Val Val Ala Leu Gln Lys Pro Thr Glu Gln Glu Ala Ser

165 170 175

Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Ile Asn His Leu Pro Ser Gly Gly Glu

180 185 190

Met Val Leu Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Arg

195 200 205

Val Met Gly Phe Cys Ser Ala Ser Gln Tyr Leu Glu Phe Met Arg Gln

210 215 220

Cys Pro Glu Ile Glu Arg Met Met Val Arg Asp Gly Ile Arg Leu Phe

225 230 235 240

Lys Tyr Trp Phe Ser Val Ser Arg Glu Glu Gln Arg Arg Arg Phe Met

245 250 255

Glu Arg Gln Thr Asp Pro Leu Lys Gln Trp Lys Leu Ser Pro Ile Asp

260 265 270

Ile Ala Ser Leu Asp Lys Trp Asp Asp Tyr Thr Glu Ala Lys Glu Ala

275 280 285

Met Phe Phe Tyr Thr Asp Thr Ala Asp Ala Pro Trp Thr Ile Val Lys

290 295 300

Ser Asp Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Asn Cys Met Glu His Phe Leu

305 310 315 320

His Ser Leu Pro Tyr Pro Asp Lys Asp Ile His Leu Val Gly Val Pro

325 330 335

Asp Pro Leu Ile Val Gly Ala Ala His His Val Ile Ser His Asp Thr

340 345 350

His Ile Leu Gly Lys Ala Leu His Pro Glu Met Lys Pro Ala Gly

355 360 365

<210> 6

<211> 266

<212> PRT

<213> 抗辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)

<400> 6

Met Asp Ile Asp Asn Tyr Arg Val Lys Pro Gly Lys Arg Val Lys Leu

1 5 10 15

Ser Asp Trp Ala Thr Asn Asp Asp Ala Gly Leu Ser Lys Glu Glu Gly

20 25 30

Gln Ala Gln Thr Ala Lys Leu Ala Gly Glu Leu Ala Glu Trp Gln Glu

35 40 45

Arg Leu Tyr Ala Glu Gly Lys Gln Ser Leu Leu Leu Ile Leu Gln Ala

50 55 60

Arg Asp Ala Ala Gly Lys Asp Gly Ala Val Lys Lys Val Ile Gly Ala

65 70 75 80

Phe Asn Pro Ala Gly Val Gln Ile Thr Ser Phe Lys Gln Pro Ser Ala

85 90 95

Glu Glu Leu Ser His Asp Phe Leu Trp Arg Ile His Gln Lys Ala Pro

100 105 110

Ala Lys Gly Tyr Val Gly Val Phe Asn Arg Ser Gln Tyr Glu Asp Val

115 120 125

Leu Val Thr Arg Val Tyr Asp Met Ile Asp Asp Lys Thr Ala Lys Arg

130 135 140

Arg Leu Glu His Ile Arg His Phe Glu Glu Leu Leu Thr Asp Asn Ala

145 150 155 160

Thr Arg Ile Val Lys Val Tyr Leu His Ile Ser Pro Glu Glu Gln Lys

165 170 175

Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu Asp Asn Pro Gly Lys His Trp Lys Phe

180 185 190

Asn Pro Gly Asp Leu Lys Asp Arg Ser Asn Trp Asp Lys Phe Asn Asp

195 200 205

Val Tyr Glu Asp Ala Leu Thr Thr Ser Thr Asp Asp Ala Pro Trp Tyr

210 215 220

Val Val Pro Ala Asp Arg Lys Trp Tyr Arg Asp Leu Val Leu Ser His

225 230 235 240

Ile Leu Leu Gly Ala Leu Lys Asp Met Asn Pro Gln Phe Pro Ala Ile

245 250 255

Asp Tyr Asp Pro Ser Lys Val Val Ile His

260 265

<210> 7

<211> 350

<212> PRT

<213> Gulbenkiania indica

<400> 7

Met Asn Glu Lys Pro Leu Ile Pro Ala Pro Thr Asp Glu Thr Ala Ala

1 5 10 15

Ser Ser Glu Gln Ala Ala Pro Asp Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ser

20 25 30

Ala Arg Ser Ala Arg Ser Arg Arg Arg Arg Pro Pro Thr Glu Thr Ser

35 40 45

Lys Ala His Asp Glu Ser Val Gln Ala Ile Glu Ala Ala Gln Pro Gly

50 55 60

Pro Val Ala Leu Glu Val Ala Leu Ala Pro Gly Gly Ser Thr Glu Asp

65 70 75 80

Ser Thr Thr Ala Pro Leu Pro Ala Cys Tyr Pro Tyr Arg Thr Arg Met

85 90 95

Arg Arg Pro Glu Tyr Glu Arg Leu Lys Ala Glu Leu Gln Ile Glu Leu

100 105 110

Leu Lys Val Gln Asn Trp Ile Lys Glu Thr Gly Gln Arg Val Ile Val

115 120 125

Leu Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg

130 135 140

Phe Met Glu His Leu Asn Pro Arg Gly Ala Arg Val Val Ala Leu Glu

145 150 155 160

Lys Pro Thr Glu Val Glu Arg Gly Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Ile

165 170 175

Gln His Phe Pro Thr Ala Gly Glu Ile Val Phe Phe Asp Arg Ser Trp

180 185 190

Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Thr Pro Asn

195 200 205

Glu Tyr Leu Glu Phe Met Arg Gln Ala Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu

210 215 220

Val Asn Ser Gly Ile Arg Leu Phe Lys Phe Trp Phe Ser Val Ser Arg

225 230 235 240

Glu Glu Gln Leu Arg Arg Phe Ile Ala Arg Arg Asp Asp Pro Leu Lys

245 250 255

His Trp Lys Leu Ser Pro Ile Asp Ile Gln Ser Leu Asp Lys Trp Asp

260 265 270

Glu Tyr Thr Ala Ala Lys Gln Ser Met Phe Phe His Thr Asp Thr Ala

275 280 285

Asp Ala Pro Trp Thr Val Ile Lys Ser Asp Asp Lys Lys Arg Ala Arg

290 295 300

Ile Asn Cys Ile Arg His Phe Leu His Gln Leu Pro Tyr Pro Asp Lys

305 310 315 320

Asn Pro Arg Val Ala Cys Gln Pro Asp Pro Leu Leu Val Gly Asn Ala

325 330 335

Ser Lys Val Leu Glu Pro His Glu Thr Gln Val Leu Thr Phe

340 345 350

<210> 8

<211> 314

<212> PRT

<213> 变金黄节杆菌(Arthrobactor aurescens)

<400> 8

Met Thr Glu Ala Ser Pro Ser Ser Pro Thr Gly Thr Ser Leu Asp Asp

1 5 10 15

Trp Trp Val Arg Asp Asn Leu Arg Glu Thr Ile Asp His Leu Val Glu

20 25 30

Leu Gly Tyr Thr Ile Ser Gly Gly Gln Gly Glu Asp Pro Asp Leu Ile

35 40 45

Asp Pro Gly Gly Ser Ala Val Glu Thr Trp Asn Glu Asp Tyr Pro Tyr

50 55 60

Gln Gln Arg Met Thr Arg Asp Glu Tyr Glu Ile Glu Lys Tyr Arg Leu

65 70 75 80

Gln Ile Glu Leu Leu Lys Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Asp Leu Gly Leu

85 90 95

Lys His Val Ile Val Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly

100 105 110

Thr Ile Lys Arg Phe Thr Glu His Leu Asp Pro Arg Ser Ala Arg Thr

115 120 125

Val Ala Leu Ala Lys Pro Ser Asp Arg Glu Gln Gly Gln Trp Tyr Phe

130 135 140

Gln Arg Tyr Ile Gln Gln Phe Pro Thr Ala Gly Glu Ile Val Met Phe

145 150 155 160

Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Asn Val Glu Arg Val Met Gly Phe

165 170 175

Cys Thr Asp Asp Glu Tyr Asp Thr Phe Met Gly Gln Ala Pro Val Phe

180 185 190

Glu Lys Met Leu Val Asp Ala Gly Ile His Val Thr Lys Phe Trp Phe

195 200 205

Ser Val Thr Arg Gln Glu Gln Arg Thr Arg Phe Ala Ile Arg Gln Ile

210 215 220

Asp Pro Val Arg Arg Trp Lys Leu Ser Pro Met Asp Leu Ala Ser Leu

225 230 235 240

Asp Arg Trp Asp Glu Tyr Thr Asp Ala Lys Glu Arg Thr Phe Leu His

245 250 255

Thr Asp Ser Asp His Ala Pro Trp Ile Thr Ile Lys Ser Asn Asp Lys

260 265 270

Lys Arg Ala Arg Ile Asn Ala Met Arg Tyr Phe Leu Asn Gln Phe Asp

275 280 285

Tyr Glu Asp Lys Asp Thr Ser Val Val Tyr Asp Ala Asp Pro Leu Ile

290 295 300

Leu Arg Arg Gly Arg Asp Ala Val Gly Asp

305 310

<210> 9

<211> 269

<212> PRT

<213> 脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)

<400> 9

Met Lys Pro Arg Asp Thr Arg Val Lys Pro Gly Ser Arg Val Ser Leu

1 5 10 15

Ala Asp Trp His Thr Asp Gly Asp Ala Phe Val Gly Lys Asp Lys Ala

20 25 30

Ala Ser Met Ala Arg Leu Asp Asp Asp Arg Val Arg Leu Glu Glu Leu

35 40 45

Gln Glu Leu Leu Tyr Ala Glu Gly Lys His Arg Leu Leu Val Val Leu

50 55 60

Gln Ala Met Asp Thr Ala Gly Lys Asp Ser Thr Ile Arg His Val Phe

65 70 75 80

Arg Gly Val Asp Pro Leu Gly Val Arg Val Ala Asn Phe Gly Val Pro

85 90 95

Ser Thr His Glu Leu Arg His Asp Tyr Leu Trp Arg Val His Pro His

100 105 110

Val Pro Ala Ser Gly Glu Ile Ala Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu

115 120 125

Asp Val Leu Val Pro Arg Val Asn Gly Ala Ile Gly His Ala Glu Cys

130 135 140

Glu Arg Arg Tyr Arg Gln Ile Asn Asp Phe Glu Arg Met Leu Ser Glu

145 150 155 160

Thr Gly Thr Thr Ile Arg Lys Phe Tyr Leu His Ile Ser Lys Asp Glu

165 170 175

Gln Lys Lys Arg Leu Glu Ala Arg Arg Asp Thr Pro Lys Lys Arg Trp

180 185 190

Lys Phe Gln Pro Gly Asp Leu Ala Val Arg Ala Gln Trp Asp Asp Tyr

195 200 205

Arg Ala Ala Tyr Asp Ala Leu Leu Ser Ala Thr Ser Thr Arg His Ala

210 215 220

Pro Trp His Val Val Pro Ala Asp Asp Lys Leu Ala Arg Asn Leu Ile

225 230 235 240

Val Ser Ala Leu Leu Ile Glu Ala Leu Glu Gly Leu Asp Met Arg Tyr

245 250 255

Pro Glu Pro Val Ala Gly Val Ala Gly Thr Pro Ile Ile

260 265

<210> 10

<211> 362

<212> PRT

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)

<400> 10

Met Ser Glu Glu Ser Thr Ala Leu Pro Leu Pro Pro Ala Pro Val Gln

1 5 10 15

Lys Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Ala Ser Thr Lys Ala Ala Pro Arg

20 25 30

Lys Ala Ala Thr Pro Arg Pro Arg Arg Pro Arg Thr Thr Lys Ala Ala

35 40 45

Pro Val Lys Ala Ala Glu Ala Glu Ile Ser Ala Ile Ser Gln Lys Pro

50 55 60

Met Ala Leu Gln Val Ala Asn Ala Pro Arg Gly Ser Asn Glu Asp Ser

65 70 75 80

Val Ser Ala Ala Leu Pro Gly Asn Tyr Pro Tyr Arg Asn Arg Met Arg

85 90 95

Arg Ala Glu Tyr Glu Lys Ala Lys Asn Glu Leu Gln Ile Glu Leu Leu

100 105 110

Lys Val Gln Ser Trp Val Lys Glu Thr Gly Gln Arg Ile Val Val Leu

115 120 125

Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe

130 135 140

Met Glu His Leu Asn Pro Arg Gly Ala Arg Ile Val Ala Leu Glu Lys

145 150 155 160

Pro Ser Glu Gln Glu Lys Gly Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Ile Gln

165 170 175

His Leu Pro Thr Ala Gly Glu Met Val Phe Phe Asp Arg Ser Trp Tyr

180 185 190

Asn Arg Ala Gly Val Glu Arg Val Met Glu Phe Cys Ser Pro Leu Gln

195 200 205

Tyr Leu Glu Phe Met Arg Gln Thr Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu Cys

210 215 220

Asn Ser Gly Ile Leu Met Phe Lys Phe Trp Phe Ser Val Asn Arg Glu

225 230 235 240

Glu Gln Leu Arg Arg Phe Ile Ser Arg Arg Asp Asp Pro Leu Lys His

245 250 255

Trp Lys Leu Ser Pro Ile Asp Ile Lys Ser Leu Asp Lys Trp Asp Glu

260 265 270

Tyr Thr Ala Ala Lys Gln Ala Met Phe Phe His Thr Asp Thr Ala Asp

275 280 285

Ala Pro Trp Thr Val Ile Lys Ser Asp Asp Lys Lys Arg Ala Arg Ile

290 295 300

Asn Cys Ile Arg His Phe Leu His Glu Leu Asp Tyr Pro Gly Lys Asp

305 310 315 320

Leu Lys Val Ala His Ala Pro Asp Pro Leu Leu Val Gly Arg Ala Ser

325 330 335

Arg Gly Leu Glu Glu Asp Glu Arg Thr Gln Ala Gln Ala Ala Thr Asp

340 345 350

Ala Gly Ala Thr Lys Leu Ala Leu Ser Ala

355 360

<210> 11

<211> 1074

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 11

atgagcgaag aacccactgt cagtcccccc tcccccgagc aacccgccgc gcagccggcc 60

aagccggccc ggccagccgc ccgccgcgcc ccgcgcaagc cggcgacccg ccgcccgcga 120

gtggccagcc cggcgcagaa ggcccgcgag gagatccagg caatcagcca gaagccggtg 180

gccctgcagg tcgccagtgc gccccacggc agcagcgagg acagcacctc ggcgagcctg 240

ccggcgaact atccctatca cacgcggatg cgccgcaacg agtacgagaa ggccaagcac 300

gacctgcaga tcgaactgct caaggtgcag agctgggtga aggagaccgg ccagcgcgtg 360

gtggtcctgt tcgaaggccg cgacgccgcc ggcaagggcg gcaccatcaa gcgcttcatg 420

gaacacctga acccgcgcgg cgcgcggatc gtagccttgg agaaaccgtc ctcccaggag 480

cagggccagt ggtatttcca gcgctacatc caacatctgc ccaccgccgg cgagatggtc 540

ttcttcgacc gctcctggta caaccgcgcc ggcgtcgagc gggtcatggg cttctgttcg 600

ccgctgcaat acctggagtt catgcgccag gcgccggagc tggagcgcat gctcaccaac 660

agcggcatcc tgctgttcaa gtactggttc tcggtgagcc gcgaggaaca actgcggcgc 720

ttcatctcgc gccgcgacga tccgctcaag cactggaagc tgtcgcccat cgacatcaag 780

tctctggaca agtgggacga ctacaccgcc gccaagcagg cgatgttctt ccataccgac 840

accgccgacg cgccgtggac ggtcatcaag tccgacgaca agaagcgcgc gcgactcaac 900

tgcatccgcc acttcctgca ctcgctggac tacccggaca aggaccggcg catcgcccat 960

gagcccgacc cgttgctggt ggggccggcc tcgcgggtga tcgaggagga cgagaaggtc 1020

tacgccgagg cggccgccgc gccgggccac gcgaacctgg atatcccggc ctga 1074

<210> 12

<211> 903

<212> DNA

<213> Synechococcus sp.

<400> 12

catatggccg agctggacat tactgcggca ccgttagagg cccaaaccga aggtcccggc 60

aagaagaaaa aagcgaaaga taagaagaaa gcgttgccgg aaaccccgaa accgtccaaa 120

ctggatcggg atttctacga caaagaactg gcacgccttc aggtagaact ggtgaaaatg 180

cagtactggg tgaaacacgc tggcttaaaa atcgtgatta tctttgaagg tcgtgatgca 240

gctggcaaag ggggaatgat caaacgcatt tcagcgccgt tgaatccgcg tggatgtcgc 300

attgtggctc tgggtactcc aagtgatcgc gagaaaacgc agtggtactt tcagcgctat 360

gtcgagcatc tacctggtgc aggcgaaata gtcatgttcg atcgtagctg gtacaatagg 420

gcaggtgtgg aatgggtgat gggcttttgc accgaagcgc agtataacga gttcatggat 480

agttgtccac agtttgagcg tatgctggtc aaatccggga taatcctgat taagtactgg 540

tttagcgttt cggatgacga acaagaacgc cgctttcaag ctcgcattct ggaaccggcc 600

aaacgctgga agatctctcc gatggacatc gaatcacggg atcgttgggt tgactattcg 660

aaagccaaag atgccatgct tgcgcatacc aatattccgg aagccccatg gtttacggtt 720

gaagcggacg ataaacgacg tgcgcatctg aactgcatct ctcacttact cagcaaaatc 780

ccgtatgagg acattacacc tcccgccatt gatctcccac cgcgtagacc tgcgcctgaa 840

gattatgtac gtccgccgat taacgaacag ttcttcgttc ccagcatcta ttaataagaa 900

ttc 903

<210> 13

<211> 1068

<212> DNA

<213> 有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)

<400> 13

catatgaata aaatggaaaa cgctccgatg ccgacgtttg gcaaagaact gcccaaactg 60

gacaacaaag cgtacaaaaa ggagctcaaa cgtctgcaag cagagctggt ggaaatgcag 120

caatgggttg tggaaacggg tactcgcgtc gtgattgtga tggaaggtcg agatgcggcc 180

ggaaaaggct ccgcgattaa gcgcatcacc cagtacctga atccgcgtac agcccgtatt 240

gaggcattac cgactcctac ctctcgcgaa aaaggtcagt ggtatttcca gaggtatgta 300

gagaagttac ctgctgcggg tgagattgtg atctttgatc gcagctggta caatcgcgcc 360

ggcgttgaac gtgttatggg cttttgcacg agtcaggaat atcgccgctt tttgcatcag 420

gcaccgatct tcgaacgctt gttagtcgaa gatggcatac atctccgcaa gtattggttc 480

tctgtatcgg atgaagaaca acttgcccgc tttcatagcc ggctgagtga tccgctgcgt 540

cgttggaaac tgtcgacgat agatctgcac agcattaccc gttgggagga ctactcacgt 600

gcgaaagacg agatgttcat tcacaccgat attcccagcg caccatggta tacagtggaa 660

tcggaggaga aaaaacgcag tcgcatcaac gtaattagcc acatcctttc aaccattccg 720

tacgagaaga ttgaccgtcc gttgccggaa atcccagaac gcccagtgcg ggaaggggag 780

tatatccgtc cacctcggaa cgaatttcgc tatgtcccgg atgttgccgc ttgtctggaa 840

gaacatcgag ttgcagcagc gcgtgaaaaa gcaaaagcag aagctaaagc aagagaagaa 900

gcggaacgtg cgctagccgc ggaaaaagtg aaagcggcca aaaaggcgaa aaagatccgt 960

aaagcccaga aggccaaagc tgcgaaaaaa gccaaaaaag ctgccggtaa ggcgaaagcg 1020

gtcaaaaaaa ccggcaaatc cgggaaaggc ggaaaataat aagaattc 1068

<210> 14

<211> 903

<212> DNA

<213> 耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)

<400> 14

catatgccgc atgttcagtt gactccggat ctgggtatga cagttcgcga tgatgaggat 60

gaacctgaac tgcttacgcc agatggcaac gtggtagata cctggcgcga agattacccg 120

tacgacgaac gtctggatcg taaggagtat gatgccgaga aacgtctgct gcaaatcgag 180

ttgctcaaac ttcagcgttg gttgaaagcc tctggtgaac gcatcgtagt gctttgcgaa 240

ggacgcgacg ctgcgggcaa aggcggcacg atcaaacgtt tcatggaaca cctgaatccg 300

cgtggtgccc gggtagttgc actggagaaa ccgtcggaac gtgaaagcac ccagtggtac 360

tttcagcgct atgtccagca cttacccgca gctggcgagt ttgtgctgtt cgatcggagc 420

tggtataatc gcgctggtgt agaacgtgtc atgggttttg cgagtcccgc agaatacgac 480

cgcttcgttg cccaagcccc gttattcgag aaaatgctcg ttgatgatgg gattcacctg 540

gtgaagttct ggttttccgt gactcgcgcg gaacaacgta cccgctttct gattcgccag 600

attgacccgg tgcgccagtg gaaactgtca ccaatggacc tggaaagcct ggaccgctgg 660

gatgaatata ccgcggcgaa agaagcgatg tttgccacca ccgatacgga tgtggcaccg 720

tggacagtcg tcaagaccaa cgacaagaaa cgcgcacgtt tagcggcaat gcgccatgtc 780

ttagcgcgct ttgactatga tgggaaagac ccagaagtgg tgggagttcc ggaccctctg 840

ctggtggttc atgctcggac gattctcgaa gcggatcgtc gccctgcctc gtaatgagaa 900

ttc 903

<210> 15

<211> 1116

<212> DNA

<213> Pannonibacter indicus

<400> 15

catatggacg accgtaccgt gacccgcaaa ccacgcggaa cacggccagc accagctgcg 60

gatgccgtgt tgccggtgac cgccgatagc gccgaagctg aagcgacccc tagcggcgtt 120

gctgaaacgc cggcggaggc agtgactgca ccgcaacctg ggacagaacc ggtcgccgct 180

cctgaagccg cgttagaacc ggcgattgcc cctgttgcag cagcaccccg caaaaccctg 240

gctgaaatgc gccatgatcc ggcggcgatt cacgaactgt ttgagtctgg caagtatccg 300

tatgcgaccc cgatgcgtcg cgctccgtat gaacagcgca aagcgaaact ccaagccgaa 360

ctgctgaaag cccaacggtg gatcaaagaa acgggtcaac gcgtggtcat cctgttcgag 420

ggccgtgatg cggcgggcaa aggtgggacc atcaaacgct ttatggagca tctgaatccc 480

cgtggtgcaa ctgtggttgc gttacagaaa cccacggaac aggaagccag ccagtggtac 540

tttcagcgtt acattaacca tctcccgtca ggcggtgaaa tggtcctgtt tgaccgttcg 600

tggtacaatc gggcaggagt tgagcgcgta atgggctttt gcagtgcgtc gcagtatctc 660

gagtttatgc gtcaatgtcc ggaaattgag cgcatgatgg tccgtgatgg gattcgcctg 720

tttaagtact ggttcagcgt gagtcgcgaa gaacagcgtc gccgtttcat ggagcgtcag 780

accgatccgt tgaagcagtg gaagttatca ccaatcgata ttgcctccct ggataaatgg 840

gatgattaca ccgaagcgaa agaagccatg ttcttctata cggacacagc cgacgcgccg 900

tggactatcg tgaaatccga cgataagaaa cgcgcgcgcc tgaactgcat ggagcacttc 960

cttcattctc ttccgtatcc cgacaaagac attcacctgg ttggtgtacc agatcctttg 1020

atcgtaggtg cagctcatca cgtcatttcg cacgatacgc atattctggg caaagccctg 1080

catccggaaa tgaaaccggc aggctaatga gaattc 1116

<210> 16

<211> 813

<212> DNA

<213> 抗辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)

<400> 16

catatggata tcgacaacta tcgcgtgaaa cctggtaaac gggtgaaact gtcggattgg 60

gcaacgaacg atgatgcagg cttgtccaaa gaagaaggtc aggcacaaac ggccaaactt 120

gcgggtgaat tggctgaatg gcaggaacgc ctttatgcgg aaggcaagca aagtttactg 180

ctgattctgc aagcacgcga tgcggctggg aaagatggtg ccgttaagaa ggtgattggc 240

gcgtttaacc ctgccggagt tcagatcacc agcttcaaac agccgagtgc ggaagaactg 300

tcacatgact tcttatggcg cattcatcag aaagctcccg cgaaagggta cgtaggcgta 360

tttaaccgtt ctcagtatga agatgtcttg gttactcgcg tctatgacat gatcgatgac 420

aagaccgcta aacgtcgcct ggagcatatt cggcactttg aggaactgct gacggataat 480

gccacacgta tcgtgaaagt ctacctccat attagcccgg aagagcagaa agagcgtctg 540

caagcccgtc ttgacaatcc gggaaaacac tggaaattta acccaggcga cctgaaagac 600

cgctccaatt gggacaaatt caacgatgtc tacgaggatg cgctgactac ctctaccgat 660

gatgcgccgt ggtatgtagt gccagcagat cgcaaatggt atcgtgactt agtgctctcg 720

catattctgc tgggtgccct caaggatatg aatccgcagt ttcccgcgat cgattacgac 780

ccgagcaaag ttgtgattca ctgataagaa ttc 813

<210> 17

<211> 1056

<212> DNA

<213> Gulbenkiania indica

<400> 17

atgaacgaaa aaccgctgat tccggccccg accgatgaaa ccgcggccag cagcgaacag 60

gccgcaccgg ataccccggc ggccgcggcc gcgagcgccc gtagcgcgcg cagccgtcgc 120

cgtcgcccgc cgaccgaaac cagcaaagcc catgatgaaa gcgtgcaggc gattgaagcg 180

gcccagccgg gtccggtggc cctggaagtt gcactggccc cgggcggtag caccgaagat 240

agcaccaccg ccccgctgcc ggcgtgctat ccgtatcgta cccgtatgcg tcgtccggaa 300

tatgaacgcc tgaaagcgga actgcaaatt gaactgctga aagttcagaa ctggattaaa 360

gaaaccggcc agcgcgtgat cgttctgttt gaaggtcgcg atgccgcggg taaaggcggc 420

accatcaaac gttttatgga acatctgaat ccgcgtggcg cccgtgtggt tgcgctggaa 480

aaaccgaccg aagtggaacg cggccagtgg tattttcagc gttatattca gcattttccg 540

accgccggcg aaatcgtgtt tttcgatcgt agctggtata accgcgcggg cgtggaacgt 600

gttatgggtt tttgtacccc gaatgaatat ctggaattta tgcgccaggc cccggaactg 660

gaacgtatgc tggtgaacag cggtattcgc ctgtttaaat tttggtttag cgttagccgt 720

gaagaacagc tgcgtcgctt tatcgcgcgt cgcgatgatc cgctgaaaca ttggaaactg 780

agcccgattg atatccagag cctggataaa tgggatgaat ataccgccgc gaaacagagc 840

atgtttttcc ataccgatac cgccgatgcg ccgtggaccg tgattaaaag cgatgataaa 900

aaacgtgcgc gcattaattg catccgccat tttctgcatc agctgccgta tccggataaa 960

aacccgcgtg ttgcctgtca gccggacccg ctgctggttg gcaatgcgag caaagttctg 1020

gaaccgcatg aaacccaggt tctgaccttt taataa 1056

<210> 18

<211> 948

<212> DNA

<213> 变金黄节杆菌(Arthrobactor aurescens)

<400> 18

atgaccgaag cgagcccgag cagcccgacc ggcaccagcc tggatgattg gtgggttcgt 60

gataacctgc gcgaaaccat tgatcatctg gtggaactgg gctataccat cagcggcggt 120

cagggtgaag atccggatct gattgatccg ggcggtagcg ccgttgaaac ctggaatgaa 180

gattatccgt atcagcagcg tatgacccgc gatgaatacg aaatcgaaaa ataccgcctg 240

caaatcgaac tgctgaaatt tcagtattgg ggccaggatc tgggtctgaa acatgtgatt 300

gtttttgaag gtcgtgatgc ggccggtaaa ggcggcacca tcaaacgttt taccgaacat 360

ctggacccgc gtagcgcccg taccgttgcc ctggcaaaac cgagcgatcg cgaacagggc 420

cagtggtatt ttcagcgtta tattcagcag tttccgaccg cgggtgaaat cgtgatgttt 480

gatcgtagct ggtataaccg cgccaatgtg gaacgtgtta tgggcttttg caccgatgat 540

gaatatgata cctttatggg tcaggcgccg gtgtttgaaa aaatgctggt tgatgccggt 600

atccatgtga ccaaattttg gtttagcgtt acccgccagg aacagcgtac ccgctttgcg 660

attcgtcaga tcgatccggt gcgtcgctgg aaactgagcc cgatggatct ggcgagcctg 720

gatcgctggg atgaatatac cgatgccaaa gaacgtacct ttctgcatac cgatagcgat 780

catgccccgt ggattaccat caaaagcaac gataaaaaac gtgcgcgcat taacgccatg 840

cgctattttc tgaaccagtt cgattacgaa gataaagata ccagcgtggt ttatgatgcc 900

gatccgctga ttctgcgtcg cggtcgtgat gcagtgggtg attaataa 948

<210> 19

<211> 813

<212> DNA

<213> 脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)

<400> 19

atgaaaccgc gtgatacccg cgtgaaaccg ggcagccgtg ttagcctggc ggattggcat 60

accgatggcg atgcctttgt gggtaaagat aaagcggcca gcatggcgcg tctggatgat 120

gatcgtgttc gcctggaaga actgcaagaa ctgctgtatg ccgaaggcaa acatcgcctg 180

ctggttgtgc tgcaagcgat ggataccgcc ggtaaagata gcaccattcg tcatgtgttt 240

cgcggcgttg atccgctggg tgtgcgcgtt gcgaactttg gcgtgccgag cacccatgaa 300

ctgcgtcatg attatctgtg gcgtgtgcat ccgcatgttc cggccagcgg tgaaattgcc 360

atctttaacc gtagccatta tgaagatgtg ctggttccgc gcgttaatgg cgcgattggt 420

catgccgaat gcgaacgtcg ctatcgtcag atcaatgatt ttgaacgtat gctgagcgaa 480

accggcacca ccatccgtaa attctatctg catatcagca aagatgaaca gaaaaaacgt 540

ctggaagcgc gtcgcgatac cccgaaaaaa cgctggaaat ttcagccggg tgatctggcc 600

gtgcgtgcac agtgggatga ttatcgtgcc gcctatgatg ccctgctgag cgcaaccagc 660

acccgtcatg ccccgtggca tgtggttccg gcggatgata aactggcccg caacctgatt 720

gtgagcgcgc tgctgatcga agccctggaa ggtctggata tgcgctatcc ggaaccggtg 780

gcgggcgttg cgggcacccc gattatctaa taa 813

<210> 20

<211> 1092

<212> DNA

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)

<400> 20

atgagcgaag aaagcaccgc cctgccgctg ccgccggcac cggtgcagaa agcgccggcc 60

agcaccagcc cggcgagcac caaagcggcg ccgcgtaaag ccgcaacccc gcgtccgcgt 120

cgcccgcgta ccaccaaagc ggccccggtt aaagcggccg aagcggaaat tagcgccatc 180

agccagaaac cgatggccct gcaagtggcc aatgccccgc gtggcagcaa tgaagatagc 240

gttagcgcgg ccctgccggg taactatccg tatcgtaatc gtatgcgtcg tgcggaatat 300

gaaaaagcca aaaacgaact gcaaattgaa ctgctgaaag tgcagagctg ggttaaagaa 360

accggccagc gcatcgtggt tctgtttgaa ggtcgcgatg cggccggtaa aggcggcacc 420

attaaacgct ttatggaaca tctgaatccg cgtggcgcgc gtattgtggc cctggaaaaa 480

ccgagcgaac aggaaaaagg ccagtggtat tttcagcgtt atattcagca tctgccgacc 540

gcgggcgaaa tggtgttttt cgatcgtagc tggtataacc gcgccggtgt ggaacgtgtt 600

atggaatttt gcagcccgct gcaatatctg gaatttatgc gccagacccc ggaactggaa 660

cgtatgctgt gtaacagcgg tattctgatg ttcaaattct ggttcagcgt gaatcgcgaa 720

gaacagctgc gtcgctttat cagccgtcgc gatgatccgc tgaaacattg gaaactgagc 780

ccgattgata tcaaaagcct ggataaatgg gatgaatata ccgcggccaa acaggcgatg 840

tttttccata ccgataccgc ggatgccccg tggaccgtta tcaaaagcga tgataaaaaa 900

cgtgcgcgca ttaattgcat ccgccatttt ctgcatgaac tggattatcc gggcaaagat 960

ctgaaagtgg cccatgcgcc ggacccgctg ctggttggcc gtgccagccg cggtctggaa 1020

gaagatgaac gtacccaggc acaggccgca accgatgccg gtgcaaccaa actggccctg 1080

agcgcataat aa 1092