阅读说明：本技术 一种发酵生产平阳霉素的方法 (Method for producing pingyangmycin by fermentation ) 是由 袁天阳 陈庆源 张海涛 朱颖 禹学军 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种发酵生产平阳霉素的方法。本发明公开了发酵生产平阳霉素的方法,包括将轮枝链霉菌在发酵培养基中进行发酵,在发酵过程中向所述发酵培养基中添加外源前体物得到含平阳霉素的发酵产物,从所述发酵产物中分离得到平阳霉素；其中,所述外源前体物为物质A和/或物质B,所述物质A为腺苷甲硫氨酸或其同类氨基酸衍生物,所述物质B为亚精胺或亚精胺盐。本发明发酵生产平阳霉素方法简单、有效、能够快速提高平阳霉素发酵生产水平,降低生产成本,无需额外对设备与人力,能够大幅度提高平阳霉素工业发酵水平,适合工业化规模生产。(The invention discloses a method for producing pingyangmycin by fermentation. The invention discloses a method for producing pingyangmycin by fermentation, which comprises the steps of fermenting streptomyces verticillata in a fermentation medium, adding an exogenous precursor into the fermentation medium in the fermentation process to obtain a fermentation product containing pingyangmycin, and separating the pingyangmycin from the fermentation product; the exogenous precursor is a substance A and/or a substance B, the substance A is adenosylmethionine or an amino acid derivative of the same type, and the substance B is spermidine or spermidine salt. The method for producing pingyangmycin by fermentation is simple and effective, can quickly improve the fermentation production level of pingyangmycin, reduces the production cost, does not need additional equipment and manpower, can greatly improve the industrial fermentation level of pingyangmycin, and is suitable for industrial mass production.)

一种发酵生产平阳霉素的方法

技术领域

本发明属于发酵工程领域，具体的涉及一种发酵生产平阳霉素的方法。

背景技术

平阳霉素是从轮枝链霉菌发酵产物中发现的具有抗肿瘤活性的单组分糖肽类抗生素，末端胺为亚精胺。平阳霉素是广谱、低毒的抗肿瘤药物。对恶性淋巴瘤、头颈部癌、乳腺癌有良好的疗效。还对无有效药物治疗的肝癌有较满意的疗效。因此提高平阳霉素的在发酵液中的含量、提高生产产量，满足市场需求具有非常重要的意义。

目前国内研究提高平阳霉素的方法主要是围绕菌种选育、优化发酵培养基处方改变发酵工艺，虽然取得了一定的成绩然而工作量巨大、收效甚微工业化生产发酵水平单指平阳霉素单组分目的产物一般为50-80U/ml且发酵生产水平极不稳定。

发明内容

本发明要解决的技术问题为如何提高平阳霉素的产量。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种发酵生产平阳霉素的方法。

本发明发酵生产平阳霉素的方法，包括将轮枝链霉菌(Streptomycesverticillus var.pingyangensis)在发酵培养基中进行发酵，在发酵过程中向所述发酵培养基中添加外源前体物得到含平阳霉素的发酵产物，从所述发酵产物中分离得到平阳霉素；其中，所述外源前体物为物质A和/或物质B，所述物质A为腺苷甲硫氨酸或其同类氨基酸衍生物，所述物质B为亚精胺或亚精胺盐。

上述方法中，所述外源前体物可以以固体或溶液的形式加入到发酵培养基中，在发酵至40-60h时加入，此时，镜检可见菌丝密网形成，当菌丝体出现分化自溶后再加入会影响平阳霉素单组分产生效果。

上述方法中，所述外源前体物的添加量为使得所述外源前体物在发酵培养基中的浓度为0.4g/L～0.6g/L。当所述外源前体物为物质A和物质B时，所述浓度为物质A和物质B的总质量浓度，其中，所述物质A与物质B的质量比为1∶4～1∶6。

上述方法中，所述发酵培养基为不含物质A和/或物质B的发酵培养基。

上述方法中，所述发酵培养基可由以下各质量百分含量的组分组成：淀粉2.5-3.0％、玉米浆2.5-3.5％、黄豆饼粉2.5-3.2％、硫酸铜0.01-0.02％、麦芽糖3.0-3.5％、大豆蛋白胨0.3-0.5％、氯化钠0.3-0.35％、其余为水。

上述方法中，所述发酵的条件如下：

发酵温度：28±2℃；

发酵时间：140-170h；

发酵压力：0.02～0.06Mpa；

空气流量(v/v)：1∶0.6-1；

搅拌转速：50-400rpm；

溶氧控制：发酵时间0-35h溶氧大于等于25％、发酵时间36-120h溶氧大于等于30％、发酵时间121h后大于等于40％；

pH控制：发酵时间0-72h控制至6.90以下，发酵时间72h后控制至7.45以下。

上述方法中，还包括在发酵前，采用种子培养基培养轮枝链霉菌，得到轮枝链霉菌的种子液再移种到发酵培养基中进行发酵。

上述方法中，所述种子培养基由以下各质量百分含量的组分组成：玉米浆1.0～2.0％、淀粉1.0～1.5％、葡萄糖1～1.5％、氯化钠0.2～0.4％、硫酸铜0.01～0.02％、黄豆饼粉1.2～2.0％和余量的水。

上述方法中，所述种子液的接种量为发酵培养基体积的5-50％。

上述方法中，所述采用种子培养基培养轮枝链霉菌的培养的条件为培养温度28℃±2℃、空气流量(v/v)1∶0.8、压力0.06Mpa、转速320rpm±20rpm。

本发明进一步提供了用于生产平阳霉素的试剂盒，含有如下A1)或A2)或A3)或A4)：

A1)轮枝链霉菌和上述发酵培养基；

A2)轮枝链霉菌、上述发酵培养基和上述种子培养基；

A3)轮枝链霉菌、上述发酵培养基和上述外源前体物；

A4)轮枝链霉菌、上述发酵培养基、上述外源前体物和上述种子培养基。

本发明还提供了上述物质A和/或物质B在制备平阳霉素的应用。

本发明进一步还提供了物质A或物质B在提高平阳霉素产量中的应用。

上述应用中，所述提高平阳霉素产量是指利用轮枝链霉菌发酵产生平阳霉素的方法提高平阳霉素产量。

本发明在微生物发酵过程中添加外源前体物(即腺苷甲硫氨酸与亚精胺的复合溶液，复合溶液腺苷甲硫氨酸与亚精胺的质量比为1∶4))能显著提高发酵液中平阳霉素的产量。

本发明发酵生产平阳霉素方法简单、有效、能够快速提高平阳霉素发酵生产水平，降低生产成本，无需额外对设备与人力，能够大幅度提高平阳霉素工业发酵水平，适合工业化规模生产。

附图说明

图1为实施例4中试验组和对照组平阳霉素发酵液液相检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明下述实施例中用到的培养基的配方及制备方法如下：

斜面培养基为高氏改良培养基，各组分的质量百分含量为：可溶性淀粉2.0％、氯化钠0.01％、磷酸氢二钾0.06％、硫酸镁0.06％、葡萄糖0.01％、琼脂2.0％和余量的纯化水，于120℃灭菌30分钟，铺制斜面。

种子培养基：各组分的质量百分含量为：玉米浆2.0％、淀粉1.5％、葡萄糖1％、氯化钠0.2％、硫酸铜0.02％、黄豆饼粉2.0％和余量的纯化水，于120℃灭菌30分钟。

实施例1：摇瓶平阳霉素发酵前体对比

对菌种活化培养、菌体扩培，最后将轮枝链霉菌(北纳工业微生物库的产品，代码为BNCC215870)的种子液移种至发酵培养基进行发酵生产平阳霉素，本实施例分为对照组、试验组1、试验组2、试验组3、试验组4和试验组5，每组设置三次重复，即对照组为D-1、D-2和D-3，试验组1为S-l-1、S-1-2和S-1-3，试验组2为S-1-L-1、S-1-L-2和S-1-L-3，试验组3为S-2-1、S-2-2和S-2-3，试验组4为S-2-L-1、S-2-L-2和S-2-L-3，试验组5为S-3-1、S-3-2和S-3-3，最终试验结果取平均值。

1、前体物溶液和发酵培养基的配制：

配置A1：2.4mg/ml腺苷甲硫氨酸溶液；A2：4.8mg/ml腺苷甲硫氨酸溶液；B1：9.6mg/ml亚精胺溶液；B2：19.2mg/ml亚精胺溶液；C1：2.4mg/ml腺苷甲硫氨酸溶液+9.6mg/ml亚精胺溶液的复合溶液，其中，复合溶液配制：取腺苷甲硫氨酸0.24克和亚精胺0.96克，用灭菌纯化水溶解，用灭菌纯化水定容至100ml水中充分，得到复合溶液，配制好的复合溶液用无菌滤膜除菌过滤。

发酵培养基：各组分的质量百分含量为：淀粉3.0％、玉米浆2.5％、黄豆饼粉2.5％、硫酸铜0.02％、麦芽糖3.0％、大豆蛋白胨0.3％、氯化钠0.35％和余量的纯化水，于120℃灭菌30分钟。

2、菌种活化培养：将低温保藏的轮枝链霉菌菌种转移至新鲜的斜面培养基28℃活化培养7天，得到成熟的孢子；

3、菌体扩培：将成熟的孢子用无菌水刮洗下来制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种至一级母瓶的种子培养基，接种量为种子培养基体积的5％，以28℃±2℃、200rpm条件震荡培养46h，获得菌株种子液；

4、培养发酵：将菌株种子液置于试验组1-5(每组3个)和对照组(每组3个)的摇瓶的发酵培养基，接种量为发酵培养基体积的10％，以28℃±2℃、220rpm条件震荡培养至45h，将A1加入试验组1的三个摇瓶内(1ml/瓶)，将A2加入试验组2的三个摇瓶内(1ml/瓶)，将B1加入试验组3的三个摇瓶内(1ml/瓶)，将B2加入试验组4的三个摇瓶内(1ml/瓶)，将C1加入试验组5的三个摇瓶内(1ml/瓶)，对照组中加入等体积的灭菌纯化水(1ml/瓶)，继续培养至164h，生物测量法检测发酵液中平阳霉素发酵单位(效价)，结果如表1所示，结果显示各外源前体物的效果为C1＞B2＞B1＞A1＞A2，表明外源前体物的种类和浓度对平阳霉素具有重要影响，其中，当外源前体物为腺苷甲硫氨酸和亚精胺，且二者的质量比为1∶4时对平阳霉素的产量影响最大。

表1摇瓶平阳霉素发酵前体添加效果对比

实施例2确定外源前体物添加配比及碳源和氮源对轮枝链霉菌发酵产生平阳霉素目的产物的发酵单位(效价)

1、采用正交实验对发酵中外源前体物添加配比及碳源和氮源等因素的相互交互作进行试验，其中，腺苷甲硫氨酸在发酵培养基中的浓度、亚精胺在发酵培养基中的浓度、麦芽糖占发酵培养基中的质量百分含量和大豆蛋白胨占发酵培养基中的质量百分含量分别设置三个水平，具体见表2。

其中，发酵培养基配制：按表2所述麦芽糖、大豆蛋白胨在发酵培养基的比例配置发酵培养基，其他组分的质量百分含量为淀粉3.0％、玉米浆2.5％、黄豆饼粉2.5％、硫酸铜0.02％、氯化钠0.35％和余量的纯化水，于120℃灭菌30分钟。

按表2中腺苷甲硫氨酸、亚精胺的浓度，称取腺苷甲硫氨酸和亚精胺用灭菌纯化水溶解，用灭菌纯化水定容至100ml水中充分溶解，得到复合溶液，确保复合溶液中每毫升前体量和表2中表述所需浓度一致，前体配制好的复合溶液用无菌滤膜除菌过滤。

2、菌种活化培养：将低温保藏的轮枝链霉菌菌种转移至新鲜的斜面培养基28℃活化培养7天，得到成熟的孢子；

3、菌体扩培：将成熟的孢子用无菌水刮洗下来制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种至一级母瓶的种子培养基，接种量为种子培养基体积的5％，以28℃±2℃、200rpm条件震荡培养46h，获得菌株种子液；

按表2中实验组1-9装入相应质量含量的麦芽糖和大豆蛋白胨的发酵培养基，每组实验组三瓶，发酵培养基的装量30ml/瓶。

4、培养发酵：将菌株种子液置于实验组1-9(每组3瓶)的摇瓶的发酵培养基，接种量为发酵培养基体积的10％，以28℃、220rpm条件震荡培养至40h，按表2中实验组1-9中腺苷甲硫氨酸和亚精胺的浓度添加配制好的外源前体物的复合溶液，继续培养至160h，生物测量法检测平阳霉素单位，各组取均值进行正交运算，结果如表2所示，可看出影响平阳霉素发酵单位的因素为亚精胺＞腺苷甲硫氨酸＞大豆蛋白胨＞麦芽糖，且最佳因素配比为腺苷甲硫氨酸在发酵培养基中的浓度为80mg/L、亚精胺在发酵培养基中的浓度为320mg/L、麦芽糖占发酵培养基中的质量百分含量为3.5％、大豆蛋白胨占发酵培养基中的质量百分含量为0.3％。

后续实施例考虑到C源淀粉的糖化酶解后葡萄糖的增效，麦芽糖可降至为3％使用。

表2正交试验

实施例3摇瓶生产平阳霉素

对菌种活化培养、菌体扩培、最后将轮枝链霉菌(北纳工业微生物库的产品，代码为BNCC215870)的种子液接种至发酵培养基进行发酵生产平阳霉素，对照组和试验组设置三次重复，即对照组为CG-1、CG-2和CG-3，试验组为EG-1、EG-2和EG-3，最终试验结果取平均值，具体实验步骤如下：

1、外源前体物溶液和发酵培养基的配制：

配置2.4mg/ml腺苷甲硫氨酸溶液+9.6mg/ml亚精胺溶液的复合溶液：取腺苷甲硫氨酸0.24克和亚精胺0.96克，用灭菌纯化水溶解，用灭菌纯化水定容至100ml水中充分，得到复合溶液，配制好的复合溶液用无菌滤膜除菌过滤。

发酵培养基：各组分的质量百分含量为：淀粉3.0％、玉米浆2.5％、黄豆饼粉2.5％、硫酸铜0.02％、麦芽糖3.0％、大豆蛋白胨0.3％、氯化钠0.35％和余量的纯化水，于120℃灭菌30分钟。

2、菌种活化培养：将低温保藏的轮枝链霉菌菌种转移至新鲜的斜面培养基28℃活化培养7天，得到成熟的孢子；

3、菌体扩培：将成熟的孢子用无菌水刮洗下来制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种至一级母瓶的种子培养基，接种量为种子培养基体积的5％，以28℃±2℃、200rpm条件震荡培养46h，获得菌株种子液；

4、培养发酵：将菌株种子液至试验组(EG-1、EG-2和EG-3)和对照组(CG-1、CG-2和CG-3)摇瓶的30mL发酵培养基，接种量均为发酵培养基体积的10％，以28℃±2℃、220rpm条件震荡培养至45h，试验组(EG-1、EG-2和EG-3)的发酵培养基中分别加入实施例1制备的腺苷甲硫氨酸与亚精胺的复合溶液(复合溶液中腺苷甲硫氨酸与亚精胺的质量比为1∶4，使得腺苷甲硫氨酸在发酵培养基中的浓度为80mg/L，亚精胺在发酵培养基中的浓度为320mg/L)继续培养至164h，生物测量法测量摇瓶的发酵液中平阳霉素发酵单位(效价)；每组对照组(CG-1、CG-2和CG-3)发酵培养基中加入与复合溶液等体积的灭菌纯化水继续培养至164h，生物测量法测量摇瓶的发酵液中平阳霉素发酵单位(效价)。

生物测量法测量试验组和对照组的摇瓶中平阳霉素发酵单位(效价)，结果如表3所示，试验组与对照组比较平阳霉素发酵单位得到了大幅提高。

表3平阳霉素单位测量结果

实施例4发酵罐生产平阳霉素

1、外源前体物溶液和发酵培养基的配制：

称取腺苷甲硫氨酸3.2克和亚精胺12.8克，用灭菌纯化水溶解，用灭菌纯化水定容至400ml水中充分，得到复合溶液，配制好的复合溶液用无菌滤膜除菌过滤。

发酵培养基：各组分的质量百分含量为：淀粉3.0％、玉米浆2.5％、黄豆饼粉2.5％、硫酸铜0.02％、麦芽糖3.0％、大豆蛋白胨0.3％、氯化钠0.35％和余量的纯化水，于120℃灭菌30分钟。

2、菌种活化培养：将低温保藏的轮枝链霉菌(纳北工业微生物库的产品，代码为BNCC215870)菌种转移至新鲜的斜面培养基28℃活化培养7天。

3、菌体扩培：将生长良好的斜面菌种用挖快法接种于母瓶培养基培养，在28℃、200rpm旋转摇床震荡培养至46h后，继续接种于15L一级罐的种子培养基，接种量为种子培养基体积的1％，以罐温28℃±2℃、流量1∶0.8、罐压0.06Mpa、转速320rpm±20rpm培养46h，获得菌株种子液；

4、培养发酵：将菌株种子液接入试验组和对照组发酵罐的32L发酵培养基中，移种量为发酵培养基体积的25％，移种后的发酵培养液40L，培养至42h，试验组发酵培养基中分别加入步骤1配置的腺苷甲硫氨酸与亚精胺的复合溶液(复合溶液中腺苷甲硫氨酸与亚精胺的质量比为1∶4，使得腺苷甲硫氨酸在发酵培养基中的浓度为80mg/L，亚精胺在发酵培养基中的浓度为320mg/L)继续培养至164h，高效液相法(《中华人民共和国药典》附录)检测发酵罐的发酵液中平阳霉素发酵单位(效价)；对照组发酵培养基滴加与复合溶液等体积的灭菌纯化水继续培养至164h，高效液相法检测发酵罐的发酵液中平阳霉素发酵单位(效价)。

整个发酵过程中其它的发酵条件为罐温28℃±2℃；流量1∶1；罐压0.04Mpa；转速360rpm±20rpm；溶氧控制：发酵时间0-35h溶氧大于等于25％、发酵时间36-120h溶氧大于等于30％、发酵时间121h后大于等于40％；pH控制：发酵时间0-72h控制至6.90以下，发酵时间72h后控制至7.45以下。

结果显示，试验组发酵生产方法所得到平阳霉素发酵单位(效价)为160U/ml，对照组平阳霉素发酵单位(效价)为63.29U/ml，试验组比对照组高出约90.7U/ml，实现了平阳霉素发酵生产高产率化(液相检测如图1所示)。

上述实施例中生物测量法检测发酵液中平阳霉素发酵单位(效价)步骤如下：

一、培养基及缓冲液的制备

3、缓冲液的配制(pH7.8-8.0的磷酸盐缓冲液)：取磷酸氢二钾559.56g与磷酸二氢钾40.86g加适量注射用水溶解，使成2000ml，调节pH值，滤过、煮沸灭菌，或于压力1-1.1kg/cm²下30消毒分钟即得。临用时取上述浓缓冲液1000ml加水4000ml摇匀即得。

二、标准品稀释溶液的制备

1、取出平阳霉素标准品(购自中国药检所)，称取30mg-40mg于干燥的25mg小烧杯中，用灭菌水稀释成每1ml含1000单位，得到1000U/ml标准液。

2、取1000U/ml的标准品溶液1ml于100ml容量瓶中，以pH7.8～8.0的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得10U/ml的标准溶液。

3、将10U/ml的标准溶液按下稀释成1，1.5，2，2.5，3.0，4.0，5.0U/ml浓度的标准品稀释溶液，以2U/ml为中心质量浓度标准品稀释溶液。

三、菌液的制备

1、接种

将枯草杆菌(购自吉林省药检所)接种于菌种斜面培养基，于37℃培养2小时；

将上述培养后的枯草杆菌接种到新的菌种斜面培养基，于37℃恒温箱培养24小时

2、枯草杆菌菌液的制备

用20ml 0.85％生理食盐水刮洗下来已长好的斜面培养基上的枯草杆菌，制成芽孢悬浮液；

将芽孢悬浮液于65℃～70℃保温30分钟，即得枯草杆菌菌液，放入冰箱保存备用。

四、双碟的准备

取菌种斜面培养基，加热融化，加入到84个碟内，水平位置使其凝固，作为底层。

另取生测培养基加热融化，冷却至60℃加入枯草杆菌菌液，摇匀，得到含菌培养基；上述碟内再分别加入5mL含菌培养基，使其在底层上均匀摊布，放置于水平操作台上冷却，待凝固后放入钢管，每碟放4个，用陶瓷盖覆盖备用。

五、检测

1、标准曲线的制备

取上述取备好的双蝶42个，将42个双蝶分成6组，每组7个双碟，以每一稀释度为一组，在每个双碟的4个钢管中间隔的两个中各加入2U/ml的标准品稀释溶液，另外两个滴加等量的该组的标准品稀释溶液，每个钢管加液与小钢管高度相平为宜，用陶瓷盖覆盖，于37℃恒温箱内培养16～18小时。

测量各组2U/ml的标准品稀释溶液和该组的标准品稀释溶液的抑菌圈直径，分别计算平均值，再计算所述有双碟中2U/ml的标准品稀释溶液抑菌圈直径的总平均值，作为修正值。

不同标准品稀释溶液的抑菌圈直径按下式进行修正：

Aa＝Ba-B+A

其中，Aa该组的标准品稀释溶液被修正后的抑菌圈直径；Ba为修正值；B为该组的2U/ml的标准品稀释溶液抑菌圈直径的平均值；A为该组的标准品稀释溶液的抑菌圈直径的平均值

以各组的标准品稀释溶液的浓度为纵坐标，以该组的标准品稀释溶液被修正后的抑菌圈直径为横坐标，绘制标准曲线，得到的发酵单位(效价)对照如表4所示。

表4效价对照表

差数(+)	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7	0.8	0.9	1.0
											效价(U/ml)	0.525	0.555	0.585	0.615	0.645	0.68	0.715	0.75	0.785	0.825
差数(+)	1.1	1.2	1.3	1.4	1.5	1.6	1.7	1.8	1.9	2.0
											效价(U/ml)	0.87	0.92	0.965	1.02	1.07	1.13	1.18	1.25	1.31	1.37
差数(-)	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7	0.8	0.9	1.0
											效价(U/ml)	0.475	0.45	0.43	0.41	0.39	0.37	0.35	0.335	0.317	0.3
差数(-)	1.1	1.2	1.3	1.4	1.5	1.6	1.7	1.8	1.9	2.0
											效价(U/ml)	0.285	0.27	0.258	0.246	0.234	0.222	0.211	0.201	0.191	0.182

注：“差值”表示标准品抑菌圈直径减去样品抑菌圈直径。

2、样品的滴定

每个样品设置三个重复，根据试验组和对照组的个数取对应数目的双碟，在每个双碟的4个钢管中间隔的两个中各加入2U/ml的标准品稀释溶液，另外两个滴加等量的适当稀释一定倍数的试验组或对照组的发酵液，每个钢管加液与钢管高度相平为宜，用陶瓷盖覆盖，于37℃恒温箱内培养16～18小时。

测量各组2U/ml的标准品稀释溶液和该组的发酵液的抑菌圈直径，分别计算平均值，再计算所述有双碟中2U/ml的标准品稀释溶液抑菌圈直径的总平均值，作为修正值。

按照上述标准曲线的制备方法求得修正值后，将发酵液的抑菌圈直径的平均值修正，再从标准曲线中查出标准品溶液的效价，从而得出稀释一定倍数的发酵液中平阳霉素的效价，进一步换算成每毫升发酵液中平阳霉素的发酵单位。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。