阅读说明：本技术 一种tpp线粒体靶向虾青素乳液及其制备方法 (TPP mitochondrion targeted astaxanthin emulsion and preparation method thereof ) 是由 谭明乾 张雪迪 铁珊珊 李佳璇 崔国馨 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种TPP线粒体靶向虾青素乳液,包括组分：酪蛋白0.5～1mg/mL,中链甘油三酯0.1～0.2mL/mL,二甲基亚砜0.02～0.04mL/mL,三苯基溴化磷0.025～0.05mg/mL,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.025～0.05mg/mL,N-羟基琥珀酰亚胺0.01～0.025mg/mL,虾青素0.05～0.1mg/mL,余量为水；所述乳液的制备中,使用酪蛋白对虾青素进行包埋,并对乳液表面进行三苯基溴化磷修饰,所得乳液能靶向分布于线粒体；本发明实现了对营养素包埋的同时,使其靶向定位,发挥生物活性,避免外界环境对其生物活性的干扰破坏。(The invention discloses a TPP mitochondrion targeted astaxanthin emulsion, which comprises the following components: 0.5-1 mg/mL casein, 0.1-0.2 mL/mL medium chain triglyceride, 0.02-0.04 mL/mL dimethyl sulfoxide, 0.025-0.05 mg/mL triphenyl phosphonium bromide, 0.025-0.05 mg/mL 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethyl carbodiimide hydrochloride, 0.01-0.025 mg/mL N-hydroxysuccinimide, 0.05-0.1 mg/mL astaxanthin and the balance of water; during the preparation of the emulsion, casein is used for embedding astaxanthin, triphenyl phosphonium bromide modification is carried out on the surface of the emulsion, and the obtained emulsion can be distributed on mitochondria in a targeted manner; the invention realizes the embedding of the nutrient, simultaneously leads the nutrient to be targeted and positioned, exerts the bioactivity and avoids the interference and damage of the external environment to the bioactivity.)

一种TPP线粒体靶向虾青素乳液及其制备方法

技术领域

本发明涉及食品及保健食品技术领域，具体涉及一种TPP线粒体靶向虾青素乳液及其制备方法。

背景技术

虾青素为萜烯类不饱和化合物，是最常见的类胡萝卜素之一，其分布于虾、蟹、鱼、藻体、酵母、甲壳动物和鸟类的羽毛中。虾青素多以酯化态为主，但在肌肉、血浆和内脏器官中的虾青素则以游离态为主。由于虾青素分子含有长的共轭不饱和双键结构，使其具有较强的生物活性，包括抗氧化作用、抗脂质过氧化活性、抗炎、预防心血管疾病和免疫调节作用等。但自身易受到光、热、氧及pH等环境因素的破坏而丧失生物活性，生物利用率低。

食品中的功能因子(例如：类胡萝卜素、黄酮类、植物甾醇、多不饱和脂肪以及油溶性维生素等)易受到光照、pH、温度等外界环境的影响而破坏其生物活性。因此，需要构建能够稳定功能因子生物活性的传递系统是非常必要的。乳液作为功能因子的传递系统起着关键的作用，其实现了对功能因子的保护、传递及控释作用。常见的乳液类型包括传统乳液、Pickering乳液、多重乳液、多层乳液以及基于乳液的固体脂质颗粒和水凝胶填充颗粒等。传统方式构建的乳液虽提升了功能因子的稳定性，但并不能实现靶向定位释放功能，使得功能因子不能够高效集中分布于作用位点，降低功能因子的效价。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺点，通过三苯基溴化磷(TPP)修饰以实现虾青素乳液的在体外的靶向递送效应，促进虾青素充分的进入细胞内部进而发挥其生物功效，实现生物活性物质定点定位释放、可控效应。

为实现上述目的，本发明提供一种TPP线粒体靶向虾青素乳液，包括下述组分：酪蛋白0.5～1mg/mL，MCT(中链甘油三酯)0.1～0.2mL/mL，DMSO(二甲基亚砜)0.02～0.04mL/mL，TPP(三苯基溴化磷)0.025～0.05mg/mL，EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)0.025～0.05mg/mL，NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)0.01～0.025mg/mL，虾青素0.05～0.1mg/mL，余量为水。

优选方式下，所述TPP线粒体靶向虾青素乳液，包括下述组分：酪蛋白1mg/mL，MCT(中链甘油三酯)0.1mL/mL，DMSO(二甲基亚砜)0.04mL/mL，TPP(三苯基溴化磷)0.025mg/mL，EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)0.025mg/mL，NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)0.015mg/mL，虾青素0.05mg/mL，余量为水。

一种TPP线粒体靶向虾青素乳液的制备方法，包括如下步骤：

S1、制备酪蛋白乳液：称取酪蛋白溶解于去离子水中，使酪蛋白终浓度为0.5mg/mL～1mg/mL，得到酪蛋白水溶液；向酪蛋白水溶液中加入MCT(中链甘油三酯)，搅拌混匀，得混合液；取所述混合液超声破碎，超声频率为600～800W，超声时长为7～15min，温度为20～30℃，得酪蛋白乳液；其中，所述酪蛋白水溶液与MCT的体积比为9:1～4:1；

S2、制备TPP羧基活化液：将DMSO(二甲基亚砜)用去离子水稀释成体积分数为5％的DMSO溶液；在室温避光条件下，取TPP(三苯基溴化磷)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)充分溶解在体积分数为5％的DMSO溶液中，500～1000rpm搅拌10～15h，再加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)在500～1000rpm搅拌4～6h，得TPP羧基活化液；

其中，所述TPP羧基活化液中，TPP(三苯基溴化磷)浓度为2.5～5mg/mL、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)的浓度为2.5～5mg/mL、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的浓度为1～2.5mg/ml；

S3、制备担载虾青素的酪蛋白乳液：取虾青素溶解于MCT中，虾青素的浓度为(W/V)0.5mg/mL～1mg/mL，得担载虾青素的MCT油相；将所述担载虾青素的MCT油相加入到步骤S1所述的酪蛋白乳液中，搅拌混匀；再进行超声破碎处理，超声频率为600～800W，超声时长为7～15min，温度为20～30℃，制得担载虾青素的酪蛋白乳液；其中，所述酪蛋白乳液和担载虾青素的MCT油相的体积比为9:1～4:1；

S4、制备TPP线粒体靶向虾青素乳液：取步骤S3所述担载虾青素的酪蛋白乳液与步骤S2所述的TPP羧基活化液按照体积比为100:1～50:1混合，500～1000rpm搅拌2～5h，得TPP线粒体靶向虾青素乳液；

所述TPP线粒体靶向虾青素乳液包括组分：酪蛋白0.5～1mg/mL，中链甘油三酯0.1～0.2mL/mL，二甲基亚砜0.02～0.04mL/mL，三苯基溴化磷0.025～0.05mg/mL，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.025～0.05mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺0.01～0.025mg/mL，虾青素0.05～0.1mg/mL，余量为水。

优选方式下，步骤S1所述搅拌混匀为500～1000rpm搅拌30～60min；所述酪蛋白水溶液的制备方法为，取酪蛋白溶解于去离子水中，于40℃、搅拌30min使其溶解，使得酪蛋白的终浓度为0.5～1mg/mL。

优选方式下，步骤S3所述搅拌混匀为500～1000rpm搅拌15～30min。

优选方式下，所述TPP线粒体靶向虾青素乳液的制备方法，包括如下步骤：

S1、制备酪蛋白乳液：称取酪蛋白溶解于去离子水中，使得酪蛋白的终浓度为1mg/mL，于40℃水浴锅内充分溶解30min，得酪蛋白水溶液；向所述酪蛋白水溶液中逐滴加入MCT(中链甘油三酯)，在800rpm条件下充分搅拌30min，充分搅拌后对乳液进行超声破碎处理，超声频率为700W，超声时长为7min，温度为25℃，制得酪蛋白乳液；其中，所述酪蛋白水溶液与MCT的体积比例为9:1；

S2、制备TPP羧基活化液：本步骤在室温避光条件下进行；将DMSO(二甲基亚砜)用去离子水稀释成体积分数为5％的DMSO溶液；取TPP(三苯基溴化磷)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)充分溶解在体积分数为5％的DMSO溶液中，在800rpm条件下搅拌充分反应15h，得TPP与EDC的反应液；再将NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)加入到所述TPP与EDC的反应液中，在800rpm条件下搅拌充分反应5h，得TPP羧基活化液；

其中，所述TPP羧基活化液中TPP(三苯基溴化磷)浓度为2.5mg/mL、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)浓度为2.5mg/mL、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的浓度为1.5mg/mL；

S3、制备担载虾青素的酪蛋白乳液：取0.5mg虾青素溶解于1mL的MCT中，虾青素的浓度为(W/V)0.5mg/mL，得担载虾青素的MCT油相；将所述担载虾青素的MCT油相加入到其9倍体积的步骤S1所述的酪蛋白乳液中，在800rpm条件下充分搅拌30min；再进行超声破碎处理，超声频率为700W，超声时长为7min，温度为25℃，制得担载虾青素的酪蛋白乳液；

S4、制备TPP线粒体靶向虾青素乳液：取步骤S3所述的担载虾青素的酪蛋白乳液及步骤S2所述的TPP羧基活化液按照体积比为100:1混合，在600rpm条件下搅拌3h，得TPP线粒体靶向虾青素乳液。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种TPP线粒体靶向虾青素乳液的制备方法，通过TPP线粒体靶向分子的修饰作用，构建一种具有靶向特性的乳液体系。本发明构建的TPP线粒体靶向虾青素乳液具有分布靶向性，促进虾青素生物活性的高效发挥；TPP线粒体靶向虾青素乳液能够明显的降低RAW264.7细胞内活性氧水平；TPP线粒体靶向虾青素乳液对RAW264.7巨噬细胞活力的促进作用优于虾青素。

附图说明

图1为对比例1中酪蛋白乳液与TPP修饰的酪蛋白乳液动态光散射图。

图2为对比例1中酪蛋白乳液激光共聚焦明场图。

图3为对比例1中TPP修饰的酪蛋白乳液激光共聚焦明场图。

图4为对比例1中酪蛋白乳液冷场扫描电镜图(×30.0K)。

图5为对比例1中TPP修饰的酪蛋白乳液冷场扫面电镜图(×30.0K)。

图6为对比例2中担载虾青素的酪蛋白乳液在NRK细胞的荧光分布图。

图7为对比例2中TPP线粒体靶向虾青素乳液在NRK细胞的荧光分布图。

图8为对比例2中担载虾青素的酪蛋白乳液在RAW264.7巨噬细胞的荧光分布图。

图9为对比例2中TPP线粒体靶向虾青素乳液在RAW264.7巨噬细胞的荧光分布图。

图10为对比例2中担载虾青素的酪蛋白乳液在RAW264.7巨噬细胞线粒体的荧光分布图。

图11为对比例2中TPP线粒体靶向虾青素乳液在RAW264.7巨噬细胞线粒体的荧光分布图。

图12为过氧化氢处理RAW264.7巨噬细胞产生活性氧的荧光倒置图。

图13为实施例1中担载虾青素的酪蛋白乳液对过氧化氢处理后的RAW264.7巨噬细胞产生活性氧的荧光倒置图。

图14为实施例1中TPP线粒体靶向虾青素乳液对过氧化氢处理后的RAW264.7巨噬细胞产生活性氧的荧光倒置图。

图15为实施例1中样品(A)、样品(B)和样品(C)三种样品液对RAW264.7巨噬细胞的MTT结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明作进一步说明。

一种TPP线粒体靶向虾青素乳液的制备方法，包括如下步骤：

S1、制备酪蛋白乳液：称取酪蛋白溶解于去离子水中，使酪蛋白终浓度为0.5mg/mL～1mg/mL，得到酪蛋白水溶液；向酪蛋白水溶液中加入MCT(中链甘油三酯)，500～1000rpm搅拌15～30min，得混合液；取所述混合液超声破碎，超声频率为600～800W，超声时长为7～15min，温度为20～30℃，得酪蛋白乳液；其中，所述酪蛋白水溶液与MCT的体积比为9:1～4:1；

S2、制备TPP羧基活化液：将DMSO(二甲基亚砜)用去离子水稀释成体积分数为5％的DMSO溶液；在室温避光条件下，取TPP(三苯基溴化磷)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)充分溶解在体积分数为5％的DMSO溶液中，500～1000rpm搅拌10～15h，再加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)在500～1000rpm搅拌4～6h，得TPP羧基活化液；

其中，所述TPP羧基活化液中，TPP(三苯基溴化磷)浓度为2.5～5mg/mL、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)的浓度为2.5～5mg/mL、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的浓度为1～2.5mg/mL；

S3、制备担载虾青素的酪蛋白乳液：取虾青素溶解于MCT中，虾青素的浓度为(W/V)0.5mg/mL～1mg/mL，得担载虾青素的MCT油相；将所述担载虾青素的MCT油相加入到步骤S1所述的酪蛋白乳液中，500～1000rpm搅拌15～30min；再进行超声破碎处理，超声频率为600～800W，超声时长为7～15min，温度为20～30℃，制得担载虾青素的酪蛋白乳液；其中，所述酪蛋白乳液和担载虾青素的MCT油相的体积比为9:1～4:1；

S4、制备TPP线粒体靶向虾青素乳液：取步骤S3所述的担载虾青素的酪蛋白乳液及步骤S2所述的TPP羧基活化液按照体积比为100:1～50:1混合，500～1000rpm搅拌2～5h，得TPP线粒体靶向虾青素乳液。

所述TPP线粒体靶向虾青素乳液由W水相，O油相，TPP靶向构建而成的(O/W)水包油型乳液。以MCT(中链甘油三酯)作为乳液的油相，酪蛋白和纯水作为水相，TPP(三苯基溴化磷)作为靶向物质与酪蛋白共价结合。

实施例1：

一种TPP线粒体靶向虾青素乳液，包括下述组分：酪蛋白1mg/mL，MCT(中链甘油三酯)0.1mL/mL，DMSO(二甲基亚砜)0.04mL/mL，TPP(三苯基溴化磷)0.025mg/mL，EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)0.025mg/mL，NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)0.015mg/mL，虾青素0.05mg/mL，余量为水。

所述TPP线粒体靶向虾青素乳液的制备方法，包括如下步骤：

S1、制备酪蛋白乳液：称取酪蛋白溶解于去离子水中，使得酪蛋白的终浓度为1mg/mL，于40℃水浴锅内充分溶解30min，得酪蛋白水溶液；向所述酪蛋白水溶液中逐滴加入MCT(中链甘油三酯)，在800rpm条件下充分搅拌30min，充分搅拌后对乳液进行超声破碎处理，超声频率为700W，超声时长为7min，温度为25℃，制得酪蛋白乳液；其中，所述酪蛋白水溶液与MCT的体积比例为9:1；

S2、制备TPP羧基活化液：本步骤在室温避光条件下进行；将DMSO(二甲基亚砜)用去离子水稀释成体积分数为5％的DMSO溶液；取TPP(三苯基溴化磷)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)充分溶解在体积分数为5％的DMSO溶液中，在800rpm条件下搅拌充分反应15h，得TPP与EDC的反应液；再将NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)加入到所述TPP与EDC的反应液中，在800rpm条件下搅拌充分反应5h，得TPP羧基活化液；

其中，所述TPP羧基活化液中TPP(三苯基溴化磷)浓度为2.5mg/mL、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)浓度为2.5mg/mL、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的浓度为1.5mg/mL；

S3、制备担载虾青素的酪蛋白乳液：取0.5mg虾青素溶解于1mL的MCT中，虾青素的浓度为(W/V)0.5mg/mL，得担载虾青素的MCT油相；将所述担载虾青素的MCT油相加入到其9倍体积的步骤S1所述的酪蛋白乳液中，在800rpm条件下充分搅拌30min；再进行超声破碎处理，超声频率为700W，超声时长为7min，温度为25℃，制得担载虾青素的酪蛋白乳液；

S4、制备TPP线粒体靶向虾青素乳液：取步骤S3所述的担载虾青素的酪蛋白乳液及步骤S2所述的TPP羧基活化液按照体积比为100:1混合，在600rpm条件下搅拌3h，得TPP线粒体靶向虾青素乳液。

对比例1

一种TPP修饰的酪蛋白乳液的制备方法，包括如下步骤：

S1、制备酪蛋白乳液：称取酪蛋白溶解于去离子水中，使得酪蛋白的终浓度为1mg/mL，于40℃水浴锅内充分溶解30min，得酪蛋白水溶液；向所述酪蛋白水溶液中逐滴加入MCT(中链甘油三酯)，在800rpm条件下充分搅拌30min，充分搅拌后对乳液进行超声破碎处理，超声频率为700W，超声时长为7min，温度为25℃，制得酪蛋白乳液；其中，所述酪蛋白水溶液与MCT的体积比例为9:1；

S2、制备TPP羧基活化液：本步骤在室温避光条件下进行；将DMSO(二甲基亚砜)用去离子水稀释成体积分数为5％的DMSO溶液；取TPP(三苯基溴化磷)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)充分溶解在体积分数为5％的DMSO溶液中，在800rpm条件下搅拌充分反应15h，得TPP与EDC的反应液；再将NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)加入到所述TPP与EDC的反应液中，在800rpm条件下搅拌充分反应5h，整个反应体系在室温避光条件下进行，得TPP羧基活化液；

其中，所述TPP羧基活化液中TPP(三苯基溴化磷)浓度为2.5mg/mL、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)浓度为2.5mg/mL、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的浓度为1.5mg/mL；

S3、制备TPP修饰的酪蛋白乳液：取步骤S2所述的TPP羧基活化液与步骤S1所述的酪蛋白乳液按体积比为1:100的比例混合，在600rpm的搅拌条件下充分反应3h，得TPP修饰的酪蛋白乳液。

对比例2

一种TPP线粒体靶向虾青素乳液的制备方法，包括如下步骤：

S1、制备酪蛋白乳液：称取酪蛋白溶解于去离子水中，使得酪蛋白的终浓度为1mg/mL，于40℃水浴锅内充分溶解30min，得酪蛋白水溶液；向所述酪蛋白水溶液中逐滴加入MCT(中链甘油三酯)，在800rpm条件下充分搅拌30min，充分搅拌后对乳液进行超声破碎处理，超声频率为700W，超声时长为7min，温度为25℃，制得酪蛋白乳液；其中，所述酪蛋白水溶液与MCT的体积比例为9:1；

S2、制备TPP羧基活化液：本步骤在室温避光条件下进行；将DMSO(二甲基亚砜)用去离子水稀释成体积分数为5％的DMSO溶液；取TPP(三苯基溴化磷)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)充分溶解在体积分数为5％的DMSO溶液中，在800rpm条件下搅拌充分反应15h，得TPP与EDC的反应液；再将NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)加入到所述TPP与EDC的反应液中，在800rpm条件下搅拌充分反应5h，得TPP羧基活化液；

其中，所述TPP羧基活化液中TPP(三苯基溴化磷)浓度为2.5mg/mL、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)浓度为2.5mg/mL、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的浓度为1.5mg/mL；

S3、制备担载虾青素的酪蛋白乳液：取0.5mg虾青素溶解于1mL的MCT中，虾青素的浓度为(W/V)0.5mg/mL，向MCT中加入0.1mg尼罗红，对MCT进行荧光标记，得担载虾青素的MCT油相；将所述担载虾青素的MCT油相加入到其9倍体积的步骤S1所述的酪蛋白乳液中，在800rpm条件下充分搅拌30min；再进行超声破碎处理，超声频率为700W，超声时长为7min，温度为25℃，制得担载虾青素的酪蛋白乳液；

S4、制备TPP线粒体靶向虾青素乳液：取步骤S3所述的担载虾青素的酪蛋白乳液及步骤S2所述的TPP羧基活化液按照体积比为100:1混合，在600rpm条件下搅拌3h，得TPP线粒体靶向虾青素乳液。

对比例2和实施例1所述TPP线粒体靶向虾青素乳液的制备方法，区别仅在于，对比例2向步骤S3所述担载虾青素的MCT油相加入尼罗红，除尼罗红外，所述TPP线粒体靶向虾青素乳液的其余各组分含量完全相同，对比例2加入尼罗红的是对MCT进行荧光标记，用于细胞实验，对所述TPP线粒体靶向虾青素乳液能够进入细胞并靶向作用于线粒体进行验证。

一、取对比例1步骤S1所述的“酪蛋白乳液”及步骤S3所述的“TPP修饰的酪蛋白乳液”进行动态光散射分析，测定乳液粒径的分布情况。图1为动态光散射结果，酪蛋白乳液粒径集中分布在371nm，TPP修饰的酪蛋白乳液粒径集中分布在527nm。TPP羧基活化液加入酪蛋白乳液后与酪蛋白发生化学反应及静电结合作用促使乳液颗粒之间发生交联，使得乳液颗粒镶嵌于交联体内部，导致乳液粒径变大。图2与图3分别为“酪蛋白乳液”与“TPP修饰的酪蛋白乳液”的激光共聚焦明场图片，图2表明酪蛋白乳液颗粒分散性好，未发生交联；图3TPP修饰的酪蛋白乳液显示出乳液颗粒的交联现象，粒径大于酪蛋白乳液，说明TPP的修饰促使乳液发生交联。图4和图5分别为“酪蛋白乳液”与“TPP修饰的酪蛋白乳液”的冷场扫描电镜图，图4结果表明酪蛋白乳液成均匀细小的球状乳液颗粒，颗粒之间还存在酪蛋白形成的丝状网络结构，说明酪蛋白作为一种优良的表面活性剂能够充分的将MCT包裹于内部，呈现球状的乳液颗粒；在同等倍数下观察发现TPP修饰的酪蛋白乳液的粒径明显大于酪蛋白乳液，并发生乳液交联现象，说明TPP修饰到酪蛋白乳液表面。

二、分别取NRK大鼠肾源细胞或RAW264.7小鼠源单核巨噬细胞按下述方法进行细胞实验：以1×10⁵细胞/mL接种1mL于12孔板中，于37℃5％CO₂细胞培养箱静置孵育12h，待完全贴壁后加入待测试样50uL，并于37℃5％CO₂细胞培养箱静置孵育10h；其中，所述待测试样为对比例2步骤S3所述的“担载虾青素的酪蛋白乳液”或步骤S4所述的“TPP线粒体靶向虾青素乳液”；培养基为含有体积分数10％胎牛血清和1％商品化抗生素(青霉素和链霉素混合液；SV30010；北京宝希迪有限公司。)的DMEM培养基。图6和图7分别为“担载虾青素的酪蛋白乳液”及“TPP线粒体靶向虾青素乳液”静置孵育NRK细胞的荧光倒置图像。结果表明，NRK细胞经TPP线粒体靶向虾青素乳液静置孵育后在NRK细胞内部呈现的荧光现象更为明显，说明经过TPP修饰后，乳液更容易进入细胞内部，提升虾青素的生物利用度，粒径的大小并不是影响NRK细胞摄取TPP线粒体靶向虾青素乳液的决定性因素。图8和图9分别为“担载虾青素的酪蛋白乳液”及“TPP线粒体靶向虾青素乳液”静置孵育RAW264.7巨噬细胞的荧光倒置图像。结果显示，TPP线粒体靶向虾青素乳液在RAW264.7巨噬细胞内呈现的荧光现象更为明显，这与对NRK细胞孵育的结果一致。说明虾青素经酪蛋白包埋后增大其在培养基的溶解性，增大其扩散能力；经TPP靶向修饰后更明显的富集于细胞内部，更易发挥虾青素的生物功效，提升生物利用度。

三、RAW264.7巨噬细胞以1×10⁶细胞/mL接种2mL于6孔板中，静置于37℃5％CO₂细胞培养箱内培养，待12h贴壁完全后，加入待测试样100uL于37℃5％CO₂细胞培养箱静置孵育6h，孵育结束后加入2μL(10mM)罗丹明123染料标记定位线粒体30min；其中，所述待测试样为对比例2步骤S3所述的“担载虾青素的酪蛋白乳液”或步骤S4所述的“TPP线粒体靶向虾青素乳液”；培养基为含有体积分数10％胎牛血清和1％商品化抗生素(青霉素和链霉素混合液；SV30010；北京宝希迪有限公司。)的DMEM培养基。图10和图11分别为“担载虾青素的酪蛋白乳液“及”TPP线粒体靶向虾青素乳液“孵育RAW264.7巨噬细胞的荧光倒置图片。结果表明，TPP线粒体靶向虾青素乳液孵育后的巨噬细胞内部尼罗红红色荧光及罗丹明123绿色荧光(定位线粒体)重叠效果及荧光强度更明显，表明TPP线粒体靶向虾青素乳液能够促进虾青素富集于巨噬细胞线粒体部位。

四、RAW264.7巨噬细胞以1×10⁶细胞/mL接种2mL于6孔板中，静置于37℃5％CO₂细胞培养箱内培养，待12h贴壁完全后加入待测试样100uL，于37℃5％CO₂细胞培养箱静置孵育5h后，加入2uL 12mM H₂O₂静置孵育30min后，加入2uL 10mM DCFH-DA染料继续静置孵育30min，利用荧光倒置显微镜进行观察；其中，所述待测试样为实施例1步骤S3所述的“担载虾青素的酪蛋白乳液”或步骤S4所述的“TPP线粒体靶向虾青素乳液”；培养基为含有体积分数10％胎牛血清和1％商品化抗生素(青霉素和链霉素混合液；SV30010；北京宝希迪有限公司。)的DMEM培养基。图12、图13和图14分别为H₂O₂阳性对照组、担载虾青素的酪蛋白乳液组和TPP线粒体靶向虾青素乳液组对RAW264.7巨噬细胞活性氧影响的荧光倒置图片，荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。通过使用Image J软件对荧光倒置图片的荧光强度进行分析，经分析H₂O₂阳性对照组平均荧光强度为72(a.u.)，担载虾青素的酪蛋白乳液组和TPP线粒体靶向虾青素乳液组的平均荧光强度分别为38(a.u.)和30(a.u.)。结果表明，担载虾青素的酪蛋白乳液和TPP线粒体靶向虾青素乳液能够明显的降低RAW264.7细胞内活性氧水平，其中TPP线粒体靶向虾青素乳液抑制活性氧的效果更明显；说明TPP线粒体靶向虾青素乳液能够载运虾青素抵达线粒体降低活性氧的水平。

五、RAW264.7巨噬细胞以1×10⁴细胞/mL接种100uL于96孔板中，静置于37℃5％CO₂细胞培养箱内培养，待12h贴壁完全后，分别加入用培养基稀释的不同浓度梯度的样品溶液100uL，于37℃5％CO₂细胞培养箱静置孵育24h后，测定细胞活力；其中，所述培养基为含有体积分数10％胎牛血清和1％商品化抗生素(青霉素和链霉素混合液；SV30010；北京宝希迪有限公司。)的DMEM培养基。

样品溶液的配制：

溶液(A)，虾青素溶液配制：称取50μg虾青素溶解于40μL DMSO中，避光静置溶解10min，加入960μL培养基，使得虾青素终浓度为50μg/mL，DMSO终浓度为4％(V/V)。其中，所述培养基为含有体积分数10％胎牛血清和1％商品化抗生素(青霉素和链霉素混合液；SV30010；北京宝希迪有限公司。)的DMEM培养基；

溶液(B)，担载虾青素的酪蛋白乳液(II)配制：称取500μg虾青素溶解于400μLDMSO中，避光静置溶解10min，加入600μL MCT使得虾青素充分溶解于MCT油相中，得担载虾青素的MCT油相；将所述担载虾青素的MCT油相加入到实施例1步骤S1所述的酪蛋白乳液中，在800rpm条件下充分搅拌30min；再进行超声破碎处理，超声频率为700W，超声时长为7min，温度为25℃，制得担载虾青素的酪蛋白乳液(II)；所述酪蛋白乳液和担载虾青素的MCT油相体积比为9:1。虾青素终浓度为50μg/mL，DMSO终浓度为4％(V/V)。所述溶液(B)即担载虾青素的酪蛋白乳液(II)与实施例1步骤S3所述担载虾青素的酪蛋白乳液的区别是：担载虾青素的MCT油相中加入了DMSO，其中DMSO与MCT的体积比为2:3，担载虾青素的酪蛋白乳液(II)中虾青素的终浓度为50μg/mL，DMSO终浓度为4％(V/V)。DMSO加入MCT油相中的目的是与溶液A形成实验参照对比，其并不影响虾青素的生物活性。

溶液(C)，TPP线粒体靶向虾青素乳液(II)配制：溶液(B)担载虾青素的酪蛋白乳液(II)与实施例1步骤S2所述的TPP羧基活化液按照体积比为100:1混合，在600rpm条件下搅拌3h，得TPP线粒体靶向虾青素乳液(II)。虾青素终浓度为50μg/mL，DMSO终浓度为4％(V/V)。所述溶液(C)即TPP线粒体靶向虾青素乳液(II)与实施例1步骤S4所述TPP线粒体靶向虾青素乳液的区别是：担载虾青素的MCT油相中加入了DMSO，其中DMSO与MCT的体积比为2:3，担载虾青素的酪蛋白乳液(II)中虾青素的终浓度为50μg/mL，DMSO终浓度为4％(V/V)。DMSO加入MCT油相中的目的是与溶液A形成实验参照对比，其并不影响虾青素的生物活性。

利用培养基稀释溶液(A)、(B)和(C)，所述样品(A)为虾青素终浓度分别为3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL的溶液(A)，所述样品(B)为虾青素终浓度分别为3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL的溶液(B)，所述样品(C)为虾青素终浓度分别为3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL的溶液(C)。其中，所述培养基为含有体积分数10％胎牛血清和1％商品化抗生素(青霉素和链霉素混合液；SV30010；北京宝希迪有限公司。)的DMEM培养基。

细胞活力测定结果如图15所示，样品(A)虾青素能够促进巨噬细胞的增长，并随着作用浓度的增高促进作用越明显，说明虾青素能够对免疫细胞有正向的促进作用。样品(C)TPP线粒体靶向虾青素乳液对RAW264.7巨噬细胞活力也同样起着促进作用，并呈现剂量依赖性，并且其促进作用略强于虾青素的作用，说明TPP修饰后促进乳液进入细胞内部释放虾青素营养因子，发挥虾青素的生物活性，提升虾青素的生物利用度。样品(B)担载虾青素的酪蛋白乳液对RAW264.7巨噬细胞活力的影响随着浓度的增大逐渐降低，说明没有TPP的靶向辅助作用被包埋的虾青素被阻碍进入细胞内或者进入细胞内无法实现充分释放效应，不能够直接的发挥其生物功效。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。